CN1295326C - 反胶团法分离纯化纳豆激酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的反胶团法分离纯化纳豆激酶的方法，特别涉及一种新的直接从母液中为直接从固态或液态发酵制得的纳豆激酶粗提液中萃取纯化纳豆激酶，包括萃取步骤和反萃取步骤；所述的萃取步骤为纳豆激酶粗提液作为水相与反胶团溶液按比例混合，在10-35℃下进入萃取，使纳豆激酶进入反胶团溶液；再在反萃液中进行反萃取，在20-45℃温度下离心，分离得到纯化后的纳豆激酶水溶液。可解决目前纳豆激酶纯化工艺复杂、步骤多、周期长的问题；酶活回收率达到80%以上，纯化因子达到3以上；并且同时具有浓缩和脱色作用；采用反胶团技术分离纯化纳豆激酶周期短，便于连续操作，易于放大。

Description

反胶团法分离纯化纳豆激酶的方法

发明领域

本发明属于生物活性物质分离纯化技术领域，特别涉及使用反胶团萃取技术直接从发酵液中分离纯化纳豆激酶的方法。

技术背景

纳豆是日本的一种传统性食品，迄今已有2000年的历史。1987年日本学者SumiH(Experimentia，1987，43，1110-1111)从日本传统的大豆发酵食品纳豆(natto)中发现了一种具有高效溶栓活性的酶，并将其命名为纳豆激酶(nattokinase，简称NK)。相关科学研究表明，纳豆激酶具有高效的溶栓能力，安全性好，无过敏反应，生产成本低，作为新一代溶栓药物，纳豆激酶具有极为诱人的市场前景。

目前，纳豆激酶的分离纯化工艺常采用传统的蛋白质纯化方法，如有机溶剂沉淀、盐析、离心、凝胶色谱、疏水色谱、离子交换色谱等纯化等方法。如付利等(生物工程进展，1995，15(5)：46-49)采用过滤、离心、盐析对纳豆激酶的粗酶液提取后，用Sephadex G-100、Sephadex G-200柱层析进一步分离纯化，最终得到的单一吸收峰经渗析后，冷冻干燥，制成纳豆激酶干粉。Nakaniski K等(UnitedStates Patent：5750650，1998)从发酵液中提取纳豆激酶时，采用无水乙醇沉淀、Butyl Sepharose柱层析、脱盐浓缩后过阴离子交换柱(Mono-Q)，洗脱液再上疏水层析柱(AlkylSepharose)得到了收率为22.0％的纯纳豆激酶。专利(02116667.6)和专利(申请号：00107589.6)采用的也是传统的纳豆激酶分离纯化方法。传统的纳豆激酶分离纯化工艺具有步骤多，周期长，酶活力回收率低等缺点。

反胶团是表面活性剂在有机溶剂中形成的微米级聚集体，其中的微水相能溶解蛋白质等生物活性物质。通过控制萃取过程的有关工艺条件，可以选择性地萃取目标蛋白质。同传统的蛋白质分离纯化手段相比，它具有酶活回收率高，可连续操作、处理量大、分离步骤少、易于放大、高选择性、低成本的特点。

专利(申请号：02121352.6)公开了纳豆激酶的生产菌种及将纳豆激酶用于制备血栓溶解性保健食品和食品添加剂；专利(申请号：00107589.6)公开了纳豆激酶的生产方法，并制成胶囊、保健食品及保健食品添加剂、医用注射针剂；专利(申请号：02109538.8)公开了纳豆激酶的纯化和冻干粉针的生产工艺；专利(申请号：99119166.8)利用基因工程的方法，表达出具有纤溶活性的纳豆激酶；专利(02116667.6)利用枯草芽孢杆菌发酵生产纳豆激酶。到目前为止，还没有有关采用反胶团分离纯化纳豆激酶的报道或专利。

发明内容

本发明目的在于解决纳豆激酶纯化工艺复杂、步骤繁多的问题，提供一种操作简单、易于放大、便于连续化运行的反胶团法分离纯化纳豆激酶的方法。

本发明的技术方案如下：

本发明提供的反胶团法分离纯化纳豆激酶的方法，为直接从固态或液态发酵制得的纳豆激酶粗提液中萃取纯化纳豆激酶，包括萃取步骤和反萃取步骤；

1)所述的萃取步骤为：

1.1)配制反胶团溶液：所述反胶团溶液的组分由表面活性剂、助溶剂、有机溶剂和水组成，其重量份配比为表面活性剂∶助溶剂∶有机溶剂∶水＝(20-100)∶(0-200)∶(800-912)∶(0-2)；

所述表面活性剂为阳离子型和非离子型表面活性剂组成的混合表面活性剂或者为阴离子型和非离子型表面活性剂组成的混合表面活性剂；

所述助溶剂为丁醇、戊醇、己醇或庚醇；

所述有机溶剂为戊烷、正己烷、环己烷、辛烷、异辛烷、庚烷和石油醚中的一种或两种或多种；

其配制步骤为：按上述比例称取各组分并均匀混合，震荡后静置，至完全溶解，制得所述反胶团溶液；

1.2)将固态或液态发酵制得的纳豆激酶粗提液的pH值调到4.5-8.0；离子强度调到0.1-0.2M；

1.3)萃取纳豆激酶粗提液，使纳豆激酶进入反胶团溶液中得到携带有纳豆激酶的反胶团溶液：

将上述步骤1.2)的纳豆激酶粗提液作为水相与步骤1.1)配制反胶团溶液混合，其混合的体积比为反胶团溶液的体积∶纳豆激酶粗提液的体积＝1∶1-1∶50，混合时间为1-10分钟，萃取操作温度为10-35℃；纳豆激酶进入反胶团溶液，得到携带有纳豆激酶的反胶团溶液；

2)对得到的携带有纳豆激酶的反胶团溶液进行反萃取，使纳豆激酶从反胶团溶液中进入反萃水相：

2.1)配制反萃水相，所述反萃水相组分由反萃助剂、缓冲剂、盐和水组成，其重量份配比为反萃助剂∶缓冲剂∶盐∶水＝(4-30)∶(0.5-10)∶(5-12)∶(48-98)

所述反萃助剂为乙醇、丙醇、异丙醇或丁醇；所述缓冲剂为磷酸盐、TRIS-HCl或甘氨酸-氢氧化钠；所述盐为氯化钾或溴化钾；

2.1)将步骤1)得到的携带有纳豆激酶的反胶团溶液同反萃水相混合，其体积比为携带有纳豆激酶的反胶团溶液的体积∶反萃水相的体积＝1∶1-50∶1，混合时间为1-30分钟，并在20-45℃温度下离心，分离得到纯化后的纳豆激酶水溶液。

所述的阳离子表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵、三辛基甲基氯化铵或Aliquat336；所述的阴离子表面活性剂为二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠；所述的非离子表面活性剂为Span60、Tween80或Tween85。

本发明中所述的纳豆激酶粗提液可采用固体发酵法制得：采用水发大豆、豆饼粉、豆渣、脱脂大豆粉作为发酵原料.将原料蒸煮(50-150℃，5min-3hr)冷却、接种芽孢杆菌、发酵(20-45℃，相对湿度控制80-95％，发酵周期18-64hr)。发酵结束后，利用氯化钠水溶液浸提，得到钠豆激酶粗提液。

本发明所述的纳豆激酶粗提液也可采用液体发酵法：配制发酵培养基，其中含有氮源，含量为0.5-50％，氮源可以是豆乳、豆饼及其水解物、豆渣及其水解物、大豆蛋白水解物、牛肉膏、玉米浆、酵母浸膏中的一种或几种；含有碳原，含量为1-10％，碳原可以是淀粉糖浆、葡萄糖、木糖、甘油、麦芽糖、废糖蜜中的一种或几种；含有无机盐类物质，含量为0.02-2％，无机盐可以是氯化钙、氯化镁、硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸锌、硫酸锰中的一种或几种。发酵温度为25-45℃，发酵pH控制为6.8-7.0，发酵周期为18-72hr.液体发酵结束后，通过离心或过滤除去菌体，得到纳豆激酶粗提液。

本发明提供的反胶团法分离纯化纳豆激酶的方法具有如下特点：本发明采用由表面活性剂和有机溶剂构成的反胶团溶液直接从发酵液中分离纯化纳豆激酶，通过调节水相pH、离子强度、相比、两相接触时间等萃取工艺条件，可实现纳豆激酶的高效萃取和反萃，酶活回收率达到80％以上，纯化因子达到3以上。该方法具有操作时间短，易于放大，易于连续化，自动操作，成本低，酶活回收率高，纯化及浓缩可同时完成。

附图说明

附图1阴离子反胶团纳豆激酶萃取效果图。

附图2阳离子反胶团纳豆激酶萃取效果图。

其中：--▲—为蛋白质回收率随反萃时间的变化曲线；

--●—纯化因子随反萃时间的变化曲线；

--■—酶活力随反萃时间的变化曲线；

为蛋白质回收率曲线；

—★—为反萃率的变化曲线；

为纳豆激酶酶活力回收率曲线；

具体实施方式

实施例1：

1.从液态发酵所产生的发酵液中分离纯化纳豆激酶

以Baciliis natto NLSSe(中国专利，申请号02121352.6)为菌种，首先进行种子培养，取一支甘油芽孢菌种接种于装有20ml种子培养基的l00ml三角瓶中，37℃、170rpm摇床培养12小时后(OD660nm约为7～8)，0-4℃冷藏，备用。液体种子可保存一周。

然后进行发酵培养：100ml三角瓶、装液量为20ml、接种量为5％、37℃、170rpm摇床培养48小时后，5000rpm、10min离心，上清液测酶活力后，冷冻保存，保存时间不长于9天。

本实施例中，反胶团溶液由AOT/辛烷构成，其重量份配比为AOT∶辛烷＝20∶878；按上述比例分别称取AOT和辛烷，混合均匀，静置，直到完全溶解，得反胶团溶液。调解发酵液的pH＝6.5；以2M氯化钠调解发酵液的离子强度到0.1M。发酵液和反胶团溶液以1∶1相比加入到三角瓶中，两相在摇床上以240rpm的速度振荡8min，温度控制在20℃。将混合液以4000rpm的速度离心5min，获得清晰分相，得到负载纳豆激酶的反胶团溶液；

反萃水相包括异丙醇、氯化钾、磷酸盐和水。其重量份配比为异丙醇、氯化钾、磷酸盐和水＝15∶5∶7∶73。按上述比例分别称取异丙醇、氯化钾、磷酸盐和水，混合均匀，静置，直到完全溶解，得反萃水相。

负载纳豆激酶的反胶团溶液同反萃水相等体积混合，在摇床上35℃以240rpm的速度振荡10min，然后将混合液中以4000rpm的速度离心5min，获得分相，得到纯化后的纳豆激酶水溶液。

纳豆激酶发酵液和反萃水相的蛋白质浓度用考马斯亮蓝法测定，并据此计算蛋白质回收率；纤维蛋白水解法测定纳豆激酶的活力，并据此计算酶活力的回收率；纯化因子等于反萃水相的比酶活力同发酵液的比酶活力的比值。其结果见附图1。图1中，萃取效果很好，酶活力回收率最高可以达到80％，纯化因子可以达到2.7左右。

实施例2

大豆用三倍的水量浸泡一昼夜(室温15℃)，然后进行高压蒸煮，121℃，15分钟，冷却后按3％的接种量接种，40℃下发酵24小时，制得纳豆。纳豆用两倍量的生理盐水浸泡提取纳豆激酶，得纳豆激酶粗提液。

本实施例中，反胶团溶液由AOT和异辛烷构成，其重量份配比为AOT∶异辛烷＝100∶800。按上述比例分别称取AOT和异辛烷，混合均匀，静置，直到完全溶解，得反胶团溶液。调解发酵液的pH＝6；以2M氯化钠调解发酵液的离子强度到0.2M。发酵液和反胶团溶液以1∶1相比加入到三角瓶中，两相在摇床上以240rpm的速度振荡8min，温度控制在10℃。将混合液以4000rpm的速度离心5min，获得清晰分相，得到负载纳豆激酶的反胶团溶液；

反萃水相包括异丙醇、氯化钾、Tris-HCl和水。其重量份配比为异丙醇、氯化钾、Tris-HCl和水＝30∶4∶8∶483。按上述比例分别称取异丙醇、氯化钾、磷酸盐和水，混合均匀，静置，直到完全溶解，得反萃水相。

负载纳豆激酶的反胶团溶液同反萃水相等体积混合，在摇床上35℃以240rpm的速度振荡10min，然后将混合液中以4000rpm的速度离心5min，获得分相，得到纯化后的纳豆激酶水溶液。酶活力回收率达到80％，纯化因子可以达到2.7左右。

实施例3

纳豆激酶粗提液的制备方法如实施例1。本实施例中，反胶团溶液由十六烷基三甲基溴化铵、正己醇和正己烷和水组成，其重量份配比为100∶100∶800∶0.5。混合均匀，静置，直到完全溶解，得反胶团溶液。调解发酵液的pH＝4.5；以2M氯化钠调解发酵液的离子强度0.2M。反胶团溶液和发酵液以1∶25相比加入到三角瓶中，两相在摇床上以240rpm的速度振荡5min，温度控制在20℃；将混合液以4000rpm的速度离心5min，获得清晰分相，得到负载纳豆激酶的反胶团溶液；

反萃水相包括异丙醇、溴化钾、甘氨酸-氢氧化钠和水。其重量份配比为异丙醇∶氯化钾∶甘氨酸-氢氧化钠∶水＝15∶5∶7∶73。按上述比例分别称取异丙醇、溴化钾、甘氨酸-氢氧化钠和水，混合均匀，静置，直到完全溶解，得反萃水相，得到纯化后的纳豆激酶水溶液。

反萃水相与负载纳豆激酶的反胶团溶液以1∶25混合，在摇床上35℃以240rpm的速度振荡10min，然后将混合液中以4000rpm的速度离心5min，获得分相.萃取效果见图2。

实施例4

纳豆激酶粗提液的制备方法同实施例1.本实施例中，反胶团溶液由AOT、Tween 80和辛烷构成，其重量份配比为AOT∶Tween80∶辛烷＝20∶10∶868。按上述比例分别称取AOT、Tween 80和辛烷，混合均匀，静置，直到完全溶解，得反胶团溶液。调解发酵液的pH＝8；以2M氯化钠调解发酵液的离子强度到0.1M。反胶团溶液和发酵液以1∶50相比加入到三角瓶中，两相在摇床上以240rpm的速度振荡8min，温度控制在35℃。将混合液以4000rpm的速度离心5min，获得清晰分相。

反萃水相包括异丙醇、氯化钾、磷酸盐和水。其重量份配比为异丙醇、氯化钾、磷酸盐和水＝4∶5∶7∶73。按上述比例分别称取异丙醇、氯化钾、磷酸盐和水，混合均匀，静置，直到完全溶解，得反萃水相。

负载纳豆激酶的反胶团溶液同反萃水相等体积混合，在摇床上35℃以240rpm的速度振荡10min，然后将混合液中以4000rpm的速度离心5min，获得分相。

酶活力回收率可以达到75％，纯化因子可以达到2.5左右。

实施例5

纳豆激酶粗提液的制备方法如实施例1。本实施例中，反胶团溶液由表面活性剂(Aliquat336+span60)、戊醇和戊烷和水组成，其重量份配比表面活性剂(Aliquat336+span60)∶戊醇∶戊烷∶水＝(80+20)∶100∶800∶0.5。混合均匀，静置，直到完全溶解，得反胶团溶液。

其余同实施例3。酶活力回收率可以达到65％，纯化因子可以达到2左右。

实施例6

本实施例中，反胶团溶液由AOT、石油醚构成，其重量份配比为AOT∶石油醚＝88∶912。混合均匀，静置，直到完全溶解，得反胶团溶液。前萃取混合时间为1min，温度为15℃.反萃取混合时间为30min，温度为10℃.其余同实施例2。酶活力回收率可以达到45％，纯化因子达到2.0左右

实施例7

本实施例中，反胶团溶液由三辛基甲基氯化铵、庚醇、石油醚构成。其重量份配比为三辛基甲基氯化铵∶庚醇∶石油醚＝20∶200∶800∶0.5。混合均匀，静置，直到完全溶解，得反胶团溶液。前萃取混合时间为10min，温度为15℃.反萃取混合时间为1min，温度为35℃；反萃水相的组成与实施例3相同，其重量份配比为异丙醇∶氯化钾∶甘氨酸-氢氧化钠∶水＝15∶10∶0.5∶98；酶活力回收率达到45％，纯化因子达到3.0左右

实施例8

以丁醇替换实施例1反萃取水相中异丙醇。重量份比同实施例1。酶活力回收率可以达到85％，纯化因子可以达到2.8左右。

实施例9

本实施例中，反胶团溶液由Aliquat336、庚醇、石油醚、异辛烷、水构成。其重量份配比为：Aliquat336∶庚醇∶石油醚∶异辛烷∶水＝20∶200∶300∶500∶2。混合均匀，静置，直到完全溶解，得反胶团溶液。前萃取混合时间为10min，温度为15℃.反萃取混合时间为1min，温度为35℃.其余同实施例3。酶活力回收率达到45％，纯化因子达到3.0左右

实施例10

以丙醇替换实施例1反萃取水相中异丙醇。重量份比同实施例1。酶活力回收率达到85％，纯化因子达到2.8左右。

Claims (4)

1、一种反胶团法分离纯化纳豆激酶的方法，为直接从固态或液态发酵制得的纳豆激酶粗提液中萃取纯化纳豆激酶，包括萃取步骤和反萃取步骤；

1)所述的萃取步骤为：

1.1)配制反胶团溶液：所述反胶团溶液的组分由表面活性剂、助溶剂、有机溶剂和水组成，其重量份配比为表面活性剂∶助溶剂∶有机溶剂∶水＝20-100∶0-200∶800-912∶0-2；

所述表面活性剂为阳离子型和非离子型表面活性剂组成的混合表面活性剂或者为阴离子型和非离子型表面活性剂组成的混合表面活性剂；

所述助溶剂为丁醇、戊醇、己醇或庚醇；

所述有机溶剂为戊烷、正己烷、环己烷、辛烷、异辛烷、庚烷和石油醚中的一种或两种或多种；

其配制步骤为：按上述比例称取各组分并均匀混合，震荡后静置，至完全溶解，混合均匀，制得所述反胶团溶液；

1.2)将固态或液态发酵制得的纳豆激酶粗提液的pH值调到4.5-8.0；离子强度调到0.1-0.2M；

1.3)萃取纳豆激酶粗提液，使纳豆激酶进入反胶团溶液中得到携带有纳豆激酶的反胶团溶液：

将上述步骤1.2)的纳豆激酶粗提液作为水相与步骤1.1)配制反胶团溶液混合，其混合的体积比为反胶团溶液的体积∶纳豆激酶粗提液的体积＝1∶1-1∶50，混合时间为1-10分钟，萃取操作温度为10-35℃；纳豆激酶进入反胶团溶液，得到携带有纳豆激酶的反胶团溶液；

2)对得到的携带有纳豆激酶的反胶团溶液进行反萃取，使纳豆激酶从反胶团溶液中进入反萃水相：

2.1)配制反萃水相，所述反萃水相组分由反萃助剂、缓冲剂、盐和水组成，其重量份配比为反萃助剂∶缓冲剂∶盐∶水＝4-30∶0.5-10∶5-12∶48-98；

所述反萃助剂为乙醇、丙醇、异丙醇或丁醇；所述缓冲剂为磷酸盐、TRIS-HCl或甘氨酸-氢氧化钠；所述盐为氯化钾或溴化钾；

2.1)将步骤1)得到的携带有纳豆激酶的反胶团溶液同反萃水相混合，其体积比为携带有纳豆激酶的反胶团溶液的体积∶反萃水相的体积＝1∶1-50∶1，混合时间为1-30分钟，并在20-45℃温度下离心，分离得到纯化后的纳豆激酶水溶液。

2、按权利要求1所述的反胶团法分离纯化纳豆激酶的方法，其特征在于，所述的阳离子表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵、三辛基甲基氯化铵或Aliquat336。

3、按权利要求1所述的反胶团法分离纯化纳豆激酶的方法，其特征在于，所述的阴离子表面活性剂为二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠。

4、按权利要求1所述的反胶团法分离纯化纳豆激酶的方法，其特征在于，所述的非离子表面活性剂为Span60、Tween80或Tween85。

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