CN106701719B - 利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素k2和纳豆激酶的方法 - Google Patents

利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素k2和纳豆激酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K2和纳豆激酶的方法，包括以下步骤：菌种活化：将纳豆芽孢杆菌划线至平板培养基中培养，再取单菌落在试管培养基，进行培养；制备种子：将试管中纳豆芽孢杆菌接种到种子培养基中培养；纳豆激酶、维生素K2的生产：配置联产发酵培养基，待配置联产发酵培养基冷却后，取制备的种子液，接种，于最佳联产培养条件下进行纳豆激酶和维生素K2的生产；纳豆激酶、维生素K2的分离和提取：将发酵液离心后，上清与沉淀分离，向上清中添加无机高分子絮凝剂，并选用壳聚糖作为助凝剂，将上清中维生素K2和纳豆激酶分离。本发明具有提高了原料的利用率且适合于工业生产的优点。

Description

利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K2和纳豆激酶的方法
技术领域
本发明属于生物化工领域，尤其涉及利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K2和纳豆激酶的方法。
背景技术
纳豆芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌的一个亚种，经过发酵后可以得到多种生理活性物质，维生素K2，纳豆激酶，生物表面活性剂，生物多糖等。维生素K2(menaquinone，简写为MK，甲萘醌类)，是一种具有叶绿醌生物活性的萘醌基团衍生物，脂溶性维生素。依据C-3上异戊二烯侧链长度的不同，MK共有14种，通常以MK-n表示，其中n指的是侧链上异戊二烯单元的个数。MK-4，MK-7，MK-9生物活性均大幅高于维生素K1。维生素K2具有治疗和预防骨质疏松症，预防肝硬化进展为肝癌，强化肝脏的解毒功能，及治疗维生素K2缺乏性出血症等作用。维生素K2具有良好的促进凝血、预防和治疗骨质疏松的功效。但是国内外的维生素K2的生产，存在着原料成本高，产率低的问题，使得维生素K2的工业化生产受到了极大的制约，因此，降低发酵成本，或者增加发酵过程中的附加值，对维生素K2的发酵生产将起到极大的促进作用。
纳豆激酶(nattokinase简写为NK)是一种枯草芽孢杆菌蛋白激酶，是在发酵过程中由纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilisl natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶。它由275个氨基酸按照固定排列方式组成，分子量是27724，结构为无空间折叠的线性氨基酸链，特征性作用底物为纤维蛋白，纳豆激酶能显著溶解体内外血栓，降低血粘度，改善血液循环，软化和增加血管弹性。与其他具有纤溶活性的酶相比，纳豆激酶更容易被肠道吸收，溶栓作用也强于纤溶酶、尿激酶(UK)和蚓激酶，纤溶活性是纤溶酶的4倍。纳豆激酶在药品，保健品方面有极大的应用价值，但是也存在着发酵成本高，产率低的缺点。
分析国内外的已有文献，纳豆芽孢杆菌可以发酵维生素K2，也可以发酵纳豆激酶。本发明首次发明了一种利用纳豆芽孢杆菌同时高产维生素K2和纳豆激酶的新方法，可以有效的提高纳豆芽孢杆菌发酵过程中附加值，提高发酵产率。
发明内容
本发明提供了一种利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K2和纳豆激酶的方法，采用优化得到联产培养基，使纳豆芽孢杆菌联产维生素K2和纳豆激酶的产量均达到较高水平，初步解决了维生素K2和纳豆激酶发酵过程中成本高，产量低的问题，并提高了原料的利用率促进了工业化进程。
本发明通过以下技术手段达到上述技术效果：一种联产维生素K2和纳豆激酶的方法，以纳豆芽孢杆菌作为发酵菌株，优化培养基配方，包括菌种活化，制备种子，接种发酵培养基，控制发酵过程中纳豆芽孢杆菌的生长以及代谢产物维生素K2和纳豆激酶的生成，对发酵液中维生素K2和纳豆激酶进行分离；包括以下步骤：
(1)菌种活化：将纳豆芽孢杆菌划线至平板培养基中培养，再取单菌落划线至试管培养基，进行培养；
(2)制备种子：将试管中纳豆芽孢杆菌接种到种子培养基中培养；
(3)纳豆激酶、维生素K2的生产：配制最佳联产发酵培养基，灭菌后冷却，再取步骤(2)制备的种子液接种到最佳联产发酵培养基中，于最佳联产培养条件下进行纳豆激酶和维生素K2的生产。
(4)纳豆激酶、维生素K2的提取：将发酵液离心后，将上清与沉淀分离；分别提取纳豆激酶、维生素K2，并检测。
优选地，所述步骤(1)中，平板培养基及试管培养基配方均为：蛋白胨5-7g/L，牛肉膏5-7g/L，氯化钠3-4g/L，琼脂粉20g/L，121℃灭菌20min，放置于30-40℃待用；纳豆芽孢杆菌在平板培养基、试管培养基中的培养条件均为：培养温度35-40℃、培养时间24-48h。
优选地，所述步骤(2)中，种子培养基配方为：葡萄糖7-10g/L，蛋白胨7-10g/L，氯化钠3-4g/L，调PH为7.2-7.4，121℃灭菌20分钟，放置于30-40℃待用；纳豆芽孢杆菌在种子培养基中的培养条件为：培养温度35-40℃，培养时间20-30h。
优选地，所述步骤(3)中，通过对纳豆芽孢杆菌联产发酵培养基进行两个响应值的响应面优化，得到最佳联产发酵培养基的配方；通过对发酵条件进行单因素优化，得到最佳联产培养条件。
优选地，所述步骤(3)中，最佳联产发酵培养基的配方为：大豆粉40-80g/L，玉米粉40-80g/L，大豆蛋白胨15-25g/L，牛肉膏10-20g/L，调PH为5.0-5.5；菌种接种量为5％-10％。
优选地，所述步骤(3)中最佳联产培养条件为：先于第一联产培养条件下培养24-36h，再于第二联产培养条件下培养60-72h；所述第一联产培养条件为：培养温度37℃，转速500-700r/min，通气量1.5-2.0vvm；所述第二联产培养条件为：培养温度37℃，转速0-100r/min，通气量0.2-0.8vvm。
优选地，所述步骤(4)中发酵液的离心条件为：9000-12000r/min，5-15min；所述离心后的上清用于纳豆激酶、维生素K2的提取，沉淀用于维生素K2的提取。
优选地，所述步骤(4)中，从上清中提取纳豆激酶、维生素K2进行检测的具体方法为：搅拌条件下，于上清中添加0.2％-0.4％无机高分子絮凝剂，然后加入4％-8％的10g/L壳聚糖醋酸溶液，搅拌5-10min，静置0.5-1h后，最终获得分离后的维生素K2和纳豆激酶，其中，上清为纳豆激酶，絮凝沉淀为维生素K2，接着，分别对其进行检测；所述纳豆激酶的检测方法为：采用琼脂糖-纤维蛋白平板法；所述维生素K2的检测方法为：上清中加入两倍体积正丙醇和正己烷混合物，震荡24h，高效液相色谱检测。
优选地，所述无机高分子絮凝剂为聚合氯化铝、聚合硫酸铝、聚合氯化铁和聚合硫酸铁中的一种或多种的混合物。
优选地所述步骤(4)中，从沉淀中提取维生素K2进行检测的具体方法为：将沉淀于60-70℃通风烘干后，加入3-8mL蒸馏水进行涡旋振荡，10000-15000r/min离心去上清，(-85)-(-75)℃温度下真空冷冻干燥，再加入正丙醇和正己烷混合物，静置24h，高效液相色谱检测。
本发明的优点在于：
(1)首次提出了维生素K2和纳豆激酶联产的方法，且发酵代谢过程易于控制，有利于产业化；
(2)采用了益生菌纳豆芽孢杆菌作为发酵菌株，有利于维生素K2和纳豆激酶在食品工业生产方面的应用；
(3)优化后的发酵培养基，发酵成本低，可以显著提高维生素K2和纳豆激酶的联产产率，是一种经济高效的方法；
(4)采用优化后的分离手段，提高了发酵液中的维生素K2和纳豆激酶的分离效率，为产品的纯化奠定了基础。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
一种利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K2和纳豆激酶的方法，以纳豆芽孢杆菌作为发酵菌株，优化培养基配方，包括菌种活化，制备种子，接种发酵培养基，控制发酵过程中纳豆芽孢杆菌的生长以及代谢产物维生素K2和纳豆激酶的生成，对发酵液中维生素K2和纳豆激酶进行分离。
包括以下步骤：
(1)菌种活化：将纳豆芽孢杆菌划线至平板培养基(配方为：蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，氯化钠3g/L，琼脂粉20g/L，121℃灭菌20min，放置于30℃待用)中培养，再取单菌落划线至试管培养基(配方为：蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，氯化钠3g/L，琼脂粉20g/L，121℃灭菌20min，放置于30℃待用)进行培养，其中纳豆芽孢杆菌在平板培养基、试管培养基中的培养条件均为：培养温度35℃、培养时间24h；
(2)制备种子：将试管中纳豆芽孢杆菌接种到种子培养基(配方为：葡萄糖7g/L，蛋白胨7g/L，氯化钠3g/L，调PH为7.2，121℃灭菌20min，放置于30℃待用)中培养，培养条件为：培养温度35℃，培养时间20h；
(3)纳豆激酶、维生素K2的生产：通过对纳豆芽孢杆菌联产发酵培养基进行两个响应值的响应面优化，得到最佳联产发酵培养基的配方；通过对发酵条件进行单因素优化，得到最佳联产培养条件；配制最佳联产发酵培养基(配方为：大豆粉40g/L，玉米粉40g/L，大豆蛋白胨15g/L，牛肉膏10g/L，调PH为5.0；菌种接种量为5％)，灭菌后冷却，再取步骤(2)制备的种子液接种到最佳联产发酵培养基中，于最佳联产培养条件下进行纳豆激酶和维生素K2的生产；其中最佳联产培养条件为：培养温度为37℃，在转速500r/min，通气量为1.5vvm的条件下培养24h，在此过程中主要是纳豆激酶的积累及纳豆芽孢杆菌的迅速生长；然后改变转速到0r/min，通气量调整为0.2vvm，继续培养60h，在这个阶段主要是代谢产物维生素K2的积累；
(4)纳豆激酶、维生素K2的提取：将发酵液于9000r/min转速下离心5min后，将上清与沉淀分离，离心后的上清用于纳豆激酶、维生素K2的提取与检测，沉淀则用于维生素K2的提取与检测；
从上清中提取纳豆激酶、维生素K2进行检测的具体方法为：搅拌条件下，于上清中添加0.2％的无机高分子絮凝剂，然后加入4％的10g/L壳聚糖醋酸溶液，搅拌5min，静置0.5h后，最终获得分离后的维生素K2和纳豆激酶，其中，上清为纳豆激酶，絮凝沉淀为维生素K2，接着，分别对其进行检测；纳豆激酶的检测方法为：采用琼脂糖-纤维蛋白平板法；维生素K2的检测方法为：上清中加入两倍体积正丙醇和正己烷混合物，震荡24h，高效液相色谱检测；
从沉淀中提取维生素K2进行检测的具体方法为：将沉淀于60℃通风烘干后，加入3mL蒸馏水进行涡旋振荡，10000r/min离心去上清，-85℃温度下真空冷冻干燥，再加入正丙醇和正己烷混合物，静置24h，高效液相色谱检测。
其中，表1为添加有不同无机高分子絮凝剂(聚合氯化铝、聚合硫酸铝、聚合氯化铁和聚合硫酸铁)的上清中维生素K2和纳豆激酶产量变化表，由表1可知，上清中的维生素K2和纳豆激酶已基本分离开来，维生素K2集中于絮凝沉淀中，纳豆激酶则集中于去除絮凝沉淀后的上清中。
表1添加有不同无机高分子絮凝剂的上清中维生素K2和纳豆激酶产量变化表
Figure GDA0002384125610000071
总结：发酵液中维生素K2总产量为48.51mg/L，其中，沉淀中维生素K2产量为31.53mg/L，上清中维生素K2产量为17.10mg/L；上清中纳豆激酶产量为1221U/mL。
实施例2
一种利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K2和纳豆激酶的方法，以纳豆芽孢杆菌作为发酵菌株，优化培养基配方，包括菌种活化，制备种子，接种发酵培养基，控制发酵过程中纳豆芽孢杆菌的生长以及代谢产物维生素K2和纳豆激酶的生成，对发酵液中维生素K2和纳豆激酶进行分离。
包括以下步骤：
(1)菌种活化：将纳豆芽孢杆菌划线至平板培养基(配方为：蛋白胨5-7g/L，牛肉膏7g/L，氯化钠4g/L，琼脂粉20g/L，121℃灭菌20min，放置于40℃待用)中培养，再取单菌落划线至试管培养基(配方为：蛋白胨7g/L，牛肉膏7g/L，氯化钠4g/L，琼脂粉20g/L，121℃灭菌20min，放置于40℃待用)进行培养，其中纳豆芽孢杆菌在平板培养基、试管培养基中的培养条件均为：培养温度40℃、培养时间48h；
(2)制备种子：将试管中纳豆芽孢杆菌接种到种子培养基(配方为：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠4g/L，调PH为7.4，121℃灭菌20分钟，放置于40℃待用)中培养，培养条件为：培养温度40℃，培养时间30h；
(3)纳豆激酶、维生素K2的生产：通过对纳豆芽孢杆菌联产发酵培养基进行两个响应值的响应面优化，得到最佳联产发酵培养基的配方；通过对发酵条件进行单因素优化，得到最佳联产培养条件；配制最佳联产发酵培养基(配方为：大豆粉80g/L，玉米粉80g/L，大豆蛋白胨25g/L，牛肉膏20g/L，调PH为5.5；菌种接种量为10％)，灭菌后冷却，再取步骤(2)制备的种子液接种到最佳联产发酵培养基中，于最佳联产培养条件下进行纳豆激酶和维生素K2的生产；其中最佳联产培养条件为：培养温度为37℃，在转速700r/min，通气量为2.0vvm的条件下培养36h，在此过程中主要是纳豆激酶的积累及纳豆芽孢杆菌的迅速生长；然后改变转速到100r/min，通气量调整为0.8vvm，继续培养72h，在这个阶段主要是代谢产物维生素K2的积累；
(4)纳豆激酶、维生素K2的提取：将发酵液于12000r/min转速下离心15min后，将上清与沉淀分离，离心后的上清用于纳豆激酶、维生素K2的提取与检测，沉淀则用于维生素K2的提取与检测；
从上清中提取纳豆激酶、维生素K2进行检测的具体方法为：搅拌条件下，于上清中添加0.4％的无机高分子絮凝剂，然后加入8％的10g/L壳聚糖醋酸溶液，搅拌10min，静置1h后，最终获得分离后的维生素K2和纳豆激酶，其中，上清为纳豆激酶，絮凝沉淀为维生素K2，接着，分别对其进行检测；纳豆激酶的检测方法为：采用琼脂糖-纤维蛋白平板法；维生素K2的检测方法为：上清中加入两倍体积正丙醇和正己烷混合物，震荡24h，高效液相色谱检测；
从沉淀中提取维生素K2进行检测的具体方法为：将沉淀于70℃通风烘干后，加入3-8mL蒸馏水进行涡旋振荡，15000r/min离心去上清，-75℃温度下真空冷冻干燥，再加入正丙醇和正己烷混合物，静置24h，高效液相色谱检测。
其中，表2为添加有不同无机高分子絮凝剂(聚合氯化铝、聚合硫酸铝、聚合氯化铁和聚合硫酸铁)的上清中维生素K2和纳豆激酶产量变化表，由表2可知，上清中的维生素K2和纳豆激酶已基本分离开来，维生素K2集中于絮凝沉淀中，纳豆激酶则集中于去除絮凝沉淀后的上清中。
表2添加有不同无机高分子絮凝剂的上清中维生素K2和纳豆激酶产量变化表
Figure GDA0002384125610000091
总结：发酵液中维生素K2总产量为72.25mg/L，其中，沉淀中维生素K2产量为46.21mg/L，上清中维生素K2产量为26.12mg/L；上清中纳豆激酶产量为1460U/mL。
实施例3
一种利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K2和纳豆激酶的方法，以纳豆芽孢杆菌作为发酵菌株，优化培养基配方，包括菌种活化，制备种子，接种发酵培养基，控制发酵过程中纳豆芽孢杆菌的生长以及代谢产物维生素K2和纳豆激酶的生成，对发酵液中维生素K2和纳豆激酶进行分离。
包括以下步骤：
(1)菌种活化：将纳豆芽孢杆菌划线至平板培养基(配方为：蛋白胨6g/L，牛肉膏6g/L，氯化钠3.5g/L，琼脂粉20g/L，121℃灭菌20min，放置于35℃待用)中培养，再取单菌落划线至试管培养基(配方为：蛋白胨6g/L，牛肉膏6g/L，氯化钠3.5g/L，琼脂粉20g/L，121℃灭菌20min，放置于35℃待用)进行培养，其中纳豆芽孢杆菌在平板培养基、试管培养基中的培养条件均为：培养温度37℃、培养时间36h；
(2)制备种子：将试管中纳豆芽孢杆菌接种到种子培养基(配方为：葡萄糖8g/L，蛋白胨8g/L，氯化钠3.5g/L，调PH为7.3，121℃灭菌20min，放置于35℃待用)中培养，培养条件为：培养温度37℃，培养时间24h；
(3)纳豆激酶、维生素K2的生产：通过对纳豆芽孢杆菌联产发酵培养基进行两个响应值的响应面优化，得到最佳联产发酵培养基的配方；通过对发酵条件进行单因素优化，得到最佳联产培养条件；配制最佳联产发酵培养基(配方为：大豆粉60g/L，玉米粉60g/L，大豆蛋白胨20g/L，牛肉膏15g/L，调PH为5.3；菌种接种量为8％)，灭菌后冷却，再取步骤(2)制备的种子液接种到最佳联产发酵培养基中，于最佳联产培养条件下进行纳豆激酶和维生素K2的生产；其中最佳联产培养条件为：培养温度为37℃，在转速600r/min，通气量为1.8vvm的条件下培养30h，在此过程中主要是纳豆激酶的积累及纳豆芽孢杆菌的迅速生长；然后改变转速到50r/min，通气量调整为0.5vvm，继续培养66h，在这个阶段主要是代谢产物维生素K2的积累；
(4)纳豆激酶、维生素K2的提取：将发酵液于10000r/min转速下离心10min后，将上清与沉淀分离，离心后的上清用于纳豆激酶、维生素K2的提取与检测，沉淀则用于维生素K2的提取与检测；
从上清中提取纳豆激酶、维生素K2进行检测的具体方法为：搅拌条件下，于上清中添加0.3％无机高分子絮凝剂，然后加入6％的10g/L壳聚糖醋酸溶液，搅拌8min，静置40min后，最终获得分离后的维生素K2和纳豆激酶，其中，上清为纳豆激酶，絮凝沉淀为维生素K2，接着，分别对其进行检测；纳豆激酶的检测方法为：采用琼脂糖-纤维蛋白平板法；维生素K2的检测方法为：上清中加入两倍体积正丙醇和正己烷混合物，震荡24h，高效液相色谱检测；
从沉淀中提取维生素K2进行检测的具体方法为：将沉淀于65℃通风烘干后，加入5mL蒸馏水进行涡旋振荡，13000r/min离心去上清，-80℃温度下真空冷冻干燥，再加入正丙醇和正己烷混合物，静置24h，高效液相色谱检测。
其中，表3为添加有不同无机高分子絮凝剂(聚合氯化铝、聚合硫酸铝、聚合氯化铁和聚合硫酸铁)的上清中维生素K2和纳豆激酶产量变化表，由表3可知，上清中的维生素K2和纳豆激酶已基本分离开来，维生素K2集中于絮凝沉淀中，纳豆激酶则集中于去除絮凝沉淀后的上清中。
表3添加有不同无机高分子絮凝剂的上清中维生素K2和纳豆激酶产量变化表
Figure GDA0002384125610000111
总结：发酵液中维生素K2总产量为89.45mg/L，其中，沉淀中维生素K2产量为62.61mg/L，上清中维生素K2产量为26.75mg/L；上清中纳豆激酶产量为1747U/mL。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K2和纳豆激酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将纳豆芽孢杆菌划线至平板培养基中培养，再取单菌落划线至试管培养基，进行培养；
（2）制备种子：将试管中纳豆芽孢杆菌接种到种子培养基中培养；
（3）纳豆激酶、维生素K2的生产：配制最佳联产发酵培养基，灭菌后冷却，再取步骤（2）制备的种子液接种到最佳联产发酵培养基中，于最佳联产培养条件下进行纳豆激酶和维生素K2的生产；
（4）纳豆激酶、维生素K2的提取：将发酵液离心后，将上清与沉淀分离；分别提取纳豆激酶、维生素K2，并检测；
所述最佳联产发酵培养基的配方为：大豆粉40-80 g/L，玉米粉40-80 g/L，大豆蛋白胨15-25 g/L，牛肉膏10-20 g/L，调pH为5.0-5.5；菌种接种量为5%-10%；
所述最佳联产培养条件为：先于第一联产培养条件下培养24-36 h，再于第二联产培养条件下培养60-72 h；所述第一联产培养条件为：培养温度37℃，转速500-700 r/min，通气量1.5-2.0 vvm；所述第二联产培养条件为：培养温度37℃，转速0-100 r/min，通气量0.2-0.8 vvm。
2.根据权利要求1所述的利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K2和纳豆激酶的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，平板培养基及试管培养基配方均为：蛋白胨5-7 g/L，牛肉膏5-7g/L，氯化钠3-4 g/L，琼脂粉20 g/L，121℃灭菌20 min，放置于30-40℃待用；纳豆芽孢杆菌在平板培养基、试管培养基中的培养条件均为：培养温度35-40℃、培养时间24-48 h。
3.根据权利要求1所述的利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K2和纳豆激酶的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，种子培养基配方为：葡萄糖7-10 g/L，蛋白胨7-10 g/L，氯化钠3-4g/L，调pH为7.2-7.4，121℃灭菌20分钟，放置于30-40℃待用；纳豆芽孢杆菌在种子培养基中的培养条件为：培养温度35-40℃，培养时间20-30 h。
4.根据权利要求1所述的利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K2和纳豆激酶的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，通过对纳豆芽孢杆菌联产发酵培养基进行两个响应值的响应面优化，得到最佳联产发酵培养基的配方；通过对发酵条件进行单因素优化，得到最佳联产培养条件。
5.根据权利要求1所述的利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K2和纳豆激酶的方法，其特征在于，所述步骤（4）中发酵液的离心条件为：9000-12000 r/min， 5-15 min；所述离心后的上清用于纳豆激酶、维生素K2的提取，沉淀用于维生素K2的提取。
6.根据权利要求1所述的利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K2和纳豆激酶的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，从上清中提取纳豆激酶、维生素K2进行检测的具体方法为：搅拌条件下，于上清中添加0.2%-0.4%无机高分子絮凝剂，然后加入4%-8%的10 g/L壳聚糖醋酸溶液，搅拌5-10 min，静置0.5-1 h后，最终获得分离后的维生素K2和纳豆激酶，其中，上清为纳豆激酶，絮凝沉淀为维生素K2，接着，分别对其进行检测；所述纳豆激酶的检测方法为：采用琼脂糖-纤维蛋白平板法；所述维生素K2的检测方法为：上清中加入两倍体积正丙醇和正己烷混合物，震荡24 h，高效液相色谱检测。
7.根据权利要求6所述的利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K2和纳豆激酶的方法，其特征在于，所述无机高分子絮凝剂为聚合氯化铝、聚合硫酸铝、聚合氯化铁和聚合硫酸铁中的一种或多种的混合物。
8.根据权利要求1所述的利用纳豆芽孢杆菌发酵联产维生素K2和纳豆激酶的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，从沉淀中提取维生素K2进行检测的具体方法为：将沉淀于60-70℃通风烘干后，加入3-8 mL蒸馏水进行涡旋振荡，10000-15000 r/min离心去上清，-85～-75℃温度下真空冷冻干燥，再加入正丙醇和正己烷混合物，静置24 h，高效液相色谱检测。
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