CN102329718B - 多菌株固定化细胞组合物连续发酵制醋方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多菌株固定化细胞组合物连续发酵制醋方法。该方法所用A菌株为酿酒酵母Saccharomycescerevisiae，B菌株为巴氏醋杆菌巴氏亚种Acetobacterpasteurianussubsp.pasteurianus；具体操作步骤如下：1、菌株培养；2、菌株的固定化，分别制得A菌株固定化细胞颗粒和B菌株固定化细胞颗粒；3、固定化细胞连续发酵制醋。本发明采用现代生物工程技术进行食醋的生产，彻底改变传统食醋酿造工艺，实现精确调控生产工艺参数的目标；改变传统酿造工艺脏乱差的落后生产环境，降低工人劳动强度；提高原材料的利用率，提高生产效率。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及采用细胞固定化技术连续制醋的方法。
背景技术
食醋是我国传统的重要酿造调味品，大多数生产企业均采用传统固态发酵法酿造食醋，固态发酵工艺的产品风味、口感、品质较好，但存在卫生条件差、原料利用率较低、劳动强度大等缺点，生产工艺中淀粉转化率、糖酸转化率、产酸率均相对较低。
与传统的发酵技术相比较，细胞固定化发酵具有以下特出优点：
① 方法简便，将细胞与单体或聚合物一起聚凝，细胞被包埋在形成的聚合物之中；② 条件温和，可选用不同的聚合物载体，不同的包埋系统和条件，以保持细胞的酶催化活性；③ 细胞不易渗漏，稳定性好；④ 细胞密度高，有较高的细胞容量，聚合体中的细胞含量可达50%～70%；⑤ 固定化的细胞可以多批次使用。
现有的细胞固定化技术在理论方面研究的多、生产实践中用的少；很多研究也是局限于单一菌种的固定化。食醋酿造工艺涉及3种主要的微生物类群和相关技术过程：黑曲霉将淀粉转化为糖类，酵母菌将糖转化为酒精，醋酸杆菌将酒精转化为醋酸。在食醋酿造行业只有零星的研究涉及醋酸杆菌细胞固定化，这不能改变传统食醋酿造的面貌。因为采用固定化醋酸杆菌进行醋酸发酵，还需要采用传统的工艺将粮食等淀粉类原材料转化为糖类，再采用酵母菌将糖类转化为酒精，只有获得酒精，才能进入固定化醋酸杆菌发酵阶段。因此将食醋酿造相关微生物分别固定化，进而构建固定化细胞连续发酵技术，为酿造行业提供先进的发酵技术，将会改变食醋行业的生产面貌，提高企业生产效率，扩大生产规模，增加企业的经济效益，促进酿造行业的技术进步。
发明内容
为改变传统食醋酿造的落后面貌，采用细胞固定化技术将食醋酿造相关微生物菌株固定，构建固定化细胞发酵器，将固定化细胞发酵器串联形成固定化细胞连续发酵技术。
具体操作方法如下：
1、二个菌株固定化细胞组合物连续发酵制醋方法，具体操作步骤如下：
1.1、菌株培养
所用菌株为A菌株和B菌株；
A菌株为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 1001菌株，可将糖类转化为酒精；
B菌株为巴氏醋杆菌巴氏亚种Acetobacter pasteurianus subsp. pasteurianus 7015菌株，可将酒精转化为醋酸；
1.1.1、A菌株的培养，将酿酒酵母斜面菌种接种至酿酒酵母培养基，温度30℃、转速80～150转/分钟，培养24～48h，使酿酒酵母培养基中的酵母细胞浓度达到5.0×107/mL～1.0×109/mL，得到A菌株菌液；
酿酒酵母培养基配方：5°Bé麦芽汁，121℃高压灭菌20分钟；
1.1.2、B菌株的培养，将巴氏醋杆菌巴氏亚种斜面菌种接种至醋杆菌培养基，温度30℃、转速80~150转/分钟，培养24~48h，使醋杆菌培养基中的巴氏醋杆菌细胞浓度达到5.0×107/mL～5.0×109/mL，得到B菌株菌液；
醋杆菌培养基配方：3°Bé麦芽汁，硫酸镁0.2%，酵母膏0.5%，磷酸二氢钾0.3%，葡萄糖2%， 121℃高压灭菌20分钟，灭菌后加95%酒精2～3%混匀；
1.2、菌株的固定化
1.2.1、细胞的离心洗涤：取A菌株菌液50mL、B菌株菌液50mL，分别在转速为5000～10000转/分钟条件下，离心分离10～15分钟，倾去上清液，用0.85%生理盐水悬浮细胞，完成一次细胞的离心洗涤；再重复2次细胞的离心洗涤，制得A菌株细胞悬液和B菌株细胞悬液；
1.2.2、取A菌株细胞悬液50mL和B菌株细胞悬液50mL，与浓度1％～5％的固定化载体溶液按体积比1: 1～4的比例混合均匀，成型造粒，固定化细胞颗粒直径2～5mm，室温固化2～6小时，置于4℃冰箱中，12小时平衡，倾去上清液，加入无菌水洗涤3次；分别制得A菌株固定化细胞颗粒和B菌株固定化细胞颗粒，置于冰箱中备用；
所述固定化载体溶液中载体为琼脂或壳聚糖或角叉或聚乙烯醇，溶剂为水；
1.3、固定化细胞连续发酵制醋
1.3.1、取100g～500g的A菌株固定化细胞颗粒和100g～500g的B菌株固定化细胞颗粒，分别置于容器中，盛有A菌株固定化细胞颗粒的容器为A容器，盛有B菌株固定化细胞颗粒的容器为B容器；A容器的进口和B容器的进口均位于容器上部，A容器的出口和B容器的出口均位于容器下部；
1.3.2、A容器的出口连通着B容器的进口；常温下，通过进口向A容器中连续注入2％～6％的蔗糖溶液，控制流速为10～100mL/小时，收集B容器出口流出的发酵液；1～3天平衡后即可由B容器出口连续得到醋酸溶液，醋酸溶液中醋酸含量为1.0～4.0％。
2、三个菌株固定化细胞组合物连续发酵制醋方法，具体操作步骤如下：
2.1、菌株培养
所用菌株为A菌株、B菌株和C菌株；
A菌株为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 1001菌株，可将糖类转化为酒精；
B菌株为巴氏醋杆菌巴氏亚种Acetobacter pasteurianus subsp. pasteurianus 7015菌株，可将酒精转化为醋酸；
C菌株为黑曲霉变种Aspergillus niger var 2244菌株，可将淀粉转化为糖类；
2.1.1、 A菌株的培养，将酿酒酵母斜面菌种接种至酿酒酵母培养基，温度30℃、转速80～150转/分钟，培养24～48h，使酿酒酵母培养基中的酵母细胞浓度达到5.0×107/mL～1.0×109/mL，得到A菌株菌液；
酿酒酵母培养基配方：5°Bé麦芽汁，121℃高压灭菌20分钟；
2.1.2、 B菌株的培养，将巴氏醋杆菌巴氏亚种斜面菌种接种至醋杆菌培养基，温度30℃、转速80～150转/分钟，培养24～48h，使醋杆菌培养基中的巴氏醋杆菌细胞浓度达到5.0×107/mL～5.0×109/mL，得到B菌株菌液；
醋杆菌培养基配方：3°Bé麦芽汁，硫酸镁0.2%，酵母膏0.5%，磷酸二氢钾0.3%，葡萄糖2%， 121℃高压灭菌20分钟，灭菌后加95%酒精2～3%混匀；
2.1.3、C菌株的培养，将黑曲霉变种接种至黑曲霉培养基，温度30℃、转速80～150转/分钟 培养24～486h，使黑曲霉培养基中黑曲霉变种孢子浓度达到5.0×107/mL～5.0×108/mL，得到C菌株菌液；
黑曲霉培养基配方：蔗糖3%，硝酸钠0.2%，硫酸镁0.05%，氯化钾0.05%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸亚铁0.001%，121℃高压灭菌20分钟；
2.2、菌株的固定化
2.2.1、细胞的离心洗涤：取A菌株菌液50mL、B菌株菌液50mL、C菌株菌液50mL，分别在转速为5000～10000转/分钟条件下，离心分离10～15分钟，倾去上清液，用0.85%生理盐水悬浮细胞，完成一次细胞的离心洗涤；再重复2次细胞的离心洗涤，制得A菌株细胞悬液、B菌株细胞悬液和C菌株细胞悬液；
2.2.2、取A菌株细胞悬液50mL、B菌株细胞悬液50mL和C菌株细胞悬液50mL，与浓度1％～5％的固定化载体溶液按体积比1: 1～4的比例混合均匀后，成型造粒，固定化细胞颗粒直径2～5mm，室温固化2～6小时，置于4℃冰箱中，12小时平衡，倾去上清液，加入无菌水洗涤3次；分别制得A菌株固定化细胞颗粒、B菌株固定化细胞颗粒和C菌株固定化细胞颗粒，置于冰箱中备用；
所述的固定化载体溶液中载体为琼脂或壳聚糖或角叉或聚乙烯醇，溶剂为水；
2.3、固定化细胞连续发酵制醋
2.3.1、取100g～500g的A菌株固定化细胞颗粒、100g～500g的B菌株固定化细胞颗粒和100g～500g的C菌株固定化细胞颗粒分别置于容器中，盛有A菌株固定化细胞颗粒的容器为A容器，盛有B菌株固定化细胞颗粒的容器为B容器，盛有C菌株固定化细胞颗粒的容器为C容器；A容器的进口、B容器的进口和C容器的进口均位于容器的上部，A容器的出口、B容器的出口和C容器的出口均位于容器的下部；
2.3.2、 C容器的出口连通着A容器的进口；A容器的出口连通着B容器的进口；常温下，通过进口向C容器中连续注入2％～6％的淀粉溶液，控制流速为10～100mL/小时，收集B容器出口流出的发酵液；10～18小时平衡后即可由B容器出口连续得到醋酸溶液，醋酸溶液中醋酸含量为1.0～4.0％。
在菌株的固定化步骤的第2步中取A菌株细胞悬液50mL和B菌株细胞悬液50mL，与浓度1％～5％的海藻酸钠溶液按体积比1: 1～4的比例混合均匀，滴入浓度0.5％～1.5％的氯化钙（CaCl2）溶液，自然成型造粒；所述海藻酸钠溶液为固定化载体溶液。
在菌株的固定化步骤的第2步中取A菌株细胞悬液50mL、B菌株细胞悬液50mL和C菌株细胞悬液50mL，与浓度1％～5％的海藻酸钠溶液按体积比1:1～4的比例混合均匀，滴入浓度0.5％～1.5％的氯化钙（CaCl2）溶液，自然成型造粒；所述海藻酸钠溶液为固定化载体溶液。
本发明使用的菌种酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 1001菌株、巴氏醋杆菌巴氏亚种Acetobacter pasteurianus subsp. pasteurianus 7015菌株和黑曲霉变种Aspergillus niger var 2244菌株均自中国工业微生物菌种保藏中心获得。
本发明的有益技术效果如下：
1、采用现代生物工程技术进行食醋的生产，彻底改变传统食醋酿造工艺，实现精确调控生产工艺参数的目标；
2、改变传统酿造工艺脏乱差的落后生产环境，降低工人劳动强度；
3、提高原材料的利用率，提高生产效率。
具体实施方式
下面对本发明作进一步地说明。
实施例1：固定化细胞组合物连续发酵制醋
本例采用二个菌株固定化细胞组合物连续发酵制醋方法，具体操作步骤如下：
1、菌株培养，所用菌株为A菌株和B菌株；
A菌株为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 1001菌株，可将糖类转化为酒精；
B菌株为巴氏醋杆菌巴氏亚种Acetobacter pasteurianus subsp. pasteurianus 7015菌株，可将酒精转化为醋酸；
A菌株的培养，将酿酒酵母斜面菌种接种至酿酒酵母培养基，温度30℃、转速120转/分钟，培养24h，使酿酒酵母培养基中的酵母细胞浓度达到5.0×107/mL，得到A菌株菌液；
酿酒酵母培养基配方：5°Bé麦芽汁，121℃高压灭菌20分钟；
B菌株的培养，将巴氏醋杆菌巴氏亚种斜面菌种接种至醋杆菌培养基，温度30℃、转速150转/分钟，培养24h，使醋杆菌培养基中的巴氏醋杆菌细胞浓度达到5.0×108/mL，得到B菌株菌液；
醋杆菌培养基配方：3°Bé麦芽汁，硫酸镁0.2%，酵母膏0.5%，磷酸二氢钾0.3%，葡萄糖2%，121℃高压灭菌20分钟，灭菌后加95%酒精2.5%混匀；
2、菌株的固定化
细胞的离心洗涤：取A菌株菌液50mL、B菌株菌液50mL，分别在转速为6000转/分钟条件下，离心分离12分钟，倾去上清液，用0.85%生理盐水悬浮细胞，完成一次细胞的离心洗涤；再重复2次细胞的离心洗涤，制得A菌株细胞悬液和B菌株细胞悬液；
取A菌株细胞悬液50mL和B菌株细胞悬液50mL，与温度50℃、浓度2.7％的琼脂100mL混合均匀，冷却至25℃凝固，切割成直径4mm固定化细胞颗粒，室温固化4小时，置于4℃冰箱中，12小时平衡，倾去上清液，加入无菌水洗涤3次；分别制得A菌株固定化细胞颗粒和B菌株固定化细胞颗粒，置于冰箱中备用；
1.3、固定化细胞连续发酵制醋
取500g的A菌株固定化细胞颗粒和500g的B菌株固定化细胞颗粒，分别置于容器中，盛有A菌株固定化细胞颗粒的容器为A容器，盛有B菌株固定化细胞颗粒的容器为B容器；A容器的进口和B容器的进口均位于容器上部，A容器的出口和B容器的出口均位于容器下部；
A容器的出口连通着B容器的进口；25℃下，通过进口向A容器中连续注入3％的蔗糖溶液，控制流速为35mL/小时，收集B容器出口流出的发酵液；24小时平衡后即可由B容器出口连续得到醋酸溶液，醋酸溶液中醋酸含量为2.5％。这套固定化细胞连续发酵装置连续运行性能稳定。
实施例2
二个菌株固定化细胞组合物连续发酵制醋方法，具体操作步骤如下：
1、菌株培养
所用菌株为A菌株和B菌株；
A菌株为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 1001菌株，可将糖类转化为酒精；
B菌株为巴氏醋杆菌巴氏亚种Acetobacter pasteurianus subsp. pasteurianus 7015菌株，可将酒精转化为醋酸；
A菌株的培养，将酿酒酵母斜面菌种接种至酿酒酵母培养基，温度30℃、转速100转/分钟，培养30h，使酿酒酵母培养基中的酵母细胞浓度达到1.0×108/mL，得到A菌株菌液；
酿酒酵母培养基配方：5°Bé麦芽汁，121℃高压灭菌20分钟；
B菌株的培养，将巴氏醋杆菌巴氏亚种斜面菌种接种至醋杆菌培养基，温度30℃、转速150转/分钟，培养24h，使醋杆菌培养基中的巴氏醋杆菌细胞浓度达到5.0×108/mL，得到B菌株菌液；
醋杆菌培养基配方：3°Bé麦芽汁，硫酸镁0.2%，酵母膏0.5%，磷酸二氢钾0.3%，葡萄糖2%， 121℃高压灭菌20分钟，灭菌后加95%酒精2.5%混匀；
2、菌株的固定化
细胞的离心洗涤：取A菌株菌液50mL、B菌株菌液50mL，分别在转速为6000转/分钟条件下，离心分离15分钟，倾去上清液，用0.85%生理盐水悬浮细胞，完成一次细胞的离心洗涤；再重复2次细胞的离心洗涤，制得A菌株细胞悬液和B菌株细胞悬液；
取A菌株细胞悬液50mL和B菌株细胞悬液50mL（分别取多少？），与浓度2.8％的海藻酸钠溶液按体积比1:4的比例混合均匀，移入玻璃注射器中，适度加力，滴入浓度1.2％的氯化钙（CaCl2）溶液，自然成型造粒，固定化细胞颗粒直径4.5mm，室温固化3小时，置于4℃冰箱中，12小时平衡，倾去溶液，加入无菌水洗涤3次；分别制得A菌株固定化细胞颗粒和B菌株固定化细胞颗粒，置于冰箱中备用；
3、固定化细胞连续发酵制醋
3.1、取500g的A菌株固定化细胞颗粒和B菌株固定化细胞颗粒，分别置于容器中，盛有A菌株固定化细胞颗粒的容器为A容器，盛有B菌株固定化细胞颗粒的容器为B容器；A容器的进口和B容器的进口均位于容器上部，A容器的出口和B容器的出口均位于容器下部；
3.2、A容器的出口连通着B容器的进口；25℃下，通过进口向A容器中连续注入3％的蔗糖溶液，控制流速为40mL/小时，收集B容器出口流出的发酵液；24小时平衡后即可由B容器出口连续得到醋酸溶液，醋酸溶液中醋酸含量为2.8％。固定化细胞连续发酵装置运行稳定。
实施例3：
三个菌株固定化细胞组合物连续发酵制醋方法，具体操作步骤如下：
1、菌株培养
所用菌株为A菌株、B菌株和C菌株；
A菌株为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 1001菌株，可将糖类转化为酒精；
B菌株为巴氏醋杆菌巴氏亚种Acetobacter pasteurianus subsp. pasteurianus 7015菌株，可将酒精转化为醋酸；
C菌株为黑曲霉变种Aspergillus niger var 2244菌株，可将淀粉转化为糖类；
A菌株的培养，将酿酒酵母斜面菌种接种至酿酒酵母培养基，温度30℃、转速100转/分钟，培养30h，使酿酒酵母培养基中的酵母细胞浓度达到1.0×108/mL，得到A菌株菌液；
酿酒酵母培养基配方：5°Bé麦芽汁，121℃高压灭菌20分钟；
B菌株的培养，将巴氏醋杆菌巴氏亚种斜面菌种接种至醋杆菌培养基，温度30℃、转速150转/分钟，培养24h，使醋杆菌培养基中的巴氏醋杆菌细胞浓度达到5.0×108/mL，得到B菌株菌液；
醋杆菌培养基配方：3°Bé麦芽汁，硫酸镁0.2%，酵母膏0.5%，磷酸二氢钾0.3%，葡萄糖2%， 121℃高压灭菌20分钟，灭菌后加95%酒精2.5%混匀；
C菌株的培养，将黑曲霉变种接种至黑曲霉培养基，温度30℃、转速140转/分钟 培养28h，使黑曲霉培养基中黑曲霉变种孢子浓度达到5.0×107/mL，得到C菌株菌液；
黑曲霉培养基配方：蔗糖3%，硝酸钠0.2%，硫酸镁0.05%，氯化钾0.05%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸亚铁0.001%，121℃高压灭菌20分钟；
2、菌株的固定化
细胞的离心洗涤：取A菌株菌液50mL、B菌株菌液50mL、C菌株菌液50mL，分别在转速为6000转/分钟条件下，离心分离15分钟，倾去上清液，用0.85%生理盐水悬浮细胞，完成一次细胞的离心洗涤；再重复2次细胞的离心洗涤，制得A菌株细胞悬液、B菌株细胞悬液和C菌株细胞悬液；
取A菌株细胞悬液50mL、B菌株细胞悬液50mL和C菌株细胞悬液50mL，与浓度2.5％的海藻酸钠溶液按体积比1:4的比例混合均匀，移入玻璃注射器中，适度加力，滴入浓度1.2％的氯化钙（CaCl2）溶液，自然成型造粒，固定化细胞颗粒直径5mm，室温固化4小时，置于4℃冰箱中，12小时平衡，倾去溶液，加入无菌水洗涤3次；分别制得A菌株固定化细胞颗粒和B菌株固定化细胞颗粒，置于冰箱中备用；
3、固定化细胞连续发酵制醋
3.1、取400g的A菌株固定化细胞颗粒、400g的B菌株固定化细胞颗粒和400g的C菌株固定化细胞颗粒，分别置于容器中，盛有A菌株固定化细胞颗粒的容器为A容器，盛有B菌株固定化细胞颗粒的容器为B容器，盛有C菌株固定化细胞颗粒的容器为C容器；A容器的进口、B容器的进口和C容器的进口均位于容器上部，A容器的出口、B容器的出口和C容器的出口均位于容器下部；
3.2、C容器的出口连通着A容器的进口，A容器的出口连通着B容器的进口；25℃下，通过进口向C容器中连续注入3％的淀粉溶液，控制流速为32mL/小时，收集B容器出口流出的发酵液；24小时平衡后即可由B容器出口连续得到醋酸溶液，醋酸溶液中醋酸含量为3.4％。固定化细胞连续发酵装置运行性能仍稳定。
Claims (4)
1.多菌株固定化细胞组合物连续发酵制醋方法，其特征在于具体操作步骤如下：
1.1、菌株培养
所用菌株为A菌株和B菌株；
A菌株为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，
B菌株为巴氏醋杆菌巴氏亚种Acetobacter pasteurianus subsp.pasteurianus；
1.1.1、A菌株的培养，将酿酒酵母斜面菌种接种至酿酒酵母培养基，温度30℃、转速80~150转/分钟，培养24～48h，使酿酒酵母培养基中的酵母细胞浓度达到5.0×107/mL～1.0×109/mL，得到A菌株菌液；
1.1.2、B菌株的培养，将巴氏醋杆菌巴氏亚种斜面菌种接种至醋杆菌培养基，温度30℃、转速80~150转/分钟，培养24～48h，使醋杆菌培养基中的巴氏醋杆菌细胞浓度达到5.0×107/mL～5.0×109/mL，得到B菌株菌液；
1.2、菌株的固定化
1.2.1、细胞的离心洗涤：取A菌株菌液50mL、B菌株菌液50mL，分别在转速为5000～10000转/分钟条件下，离心分离10～15分钟，倾去上清液，用0.85%生理盐水悬浮细胞，完成一次细胞的离心洗涤；再重复2次细胞的离心洗涤，制得A菌株细胞悬液和B菌株细胞悬液；
1.2.2、取A菌株细胞悬液50mL和B菌株细胞悬液50mL，与浓度1％～5％的固定化载体溶液按体积比1:1～4的比例混合均匀，成型造粒，固定化细胞颗粒直径2～5mm，室温固化2～6小时，温度4℃，12小时平衡，倾去上清液，加入无菌水洗涤3次；分别制得A菌株固定化细胞颗粒和B菌株固定化细胞颗粒；
所述固定化载体溶液中载体为琼脂或壳聚糖或角叉或聚乙烯醇，溶剂为水；
1.3、固定化细胞连续发酵制醋
1.3.1、取100g～500g的A菌株固定化细胞颗粒和100g～500g的B菌株固定化细胞颗粒，分别置于容器中，盛有A菌株固定化细胞颗粒的容器为A容器，盛有B菌株固定化细胞颗粒的容器为B容器；A容器的进口和B容器的进口均位于容器上部，A容器的出口和B容器的出口均位于容器下部；
1.3.2、A容器的出口连通着B容器的进口；常温下，通过进口向A容器中连续注入2％～6％的蔗糖溶液，控制流速为10～100mL/小时，收集B容器出口流出的发酵液；1～3天平衡后即可由B容器出口连续得到醋酸溶液，醋酸溶液中醋酸含量为1.0～4.0％。
2.多菌株固定化细胞组合物连续发酵制醋方法，其特征在于具体操作步骤如下：
1.1、菌株培养
所用菌株为A菌株、B菌株和C菌株；
A菌株为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，
B菌株为巴氏醋杆菌巴氏亚种Acetobacter pasteurianus subsp.pasteurianus；
C菌株为黑曲霉变种Aspergillus niger var；
1.1.1、A菌株的培养，将酿酒酵母斜面菌种接种至酿酒酵母培养基，温度30℃、转速80~150转/分钟，培养24～48h，使酿酒酵母培养基中的酵母细胞浓度达到5.0×107/mL～1.0×109/mL，得到A菌株菌液；
1.1.2、B菌株的培养，将巴氏醋杆菌巴氏亚种斜面菌种接种至醋杆菌培养基，温度30℃、转速80~150转/分钟，培养24～48h，使醋杆菌培养基中的巴氏醋杆菌细胞浓度达到5.0×107/mL～5.0×109/mL，得到B菌株菌液；
1.1.3、C菌株的培养，将黑曲霉变种接种至黑曲霉培养基，温度30℃、转速80~150转/分钟培养24～48h，使黑曲霉培养基中黑曲霉变种孢子浓度达到5.0×107/mL～5.0×108/mL，得到C菌株菌液；
1.2、菌株的固定化
1.2.1、细胞的离心洗涤：取A菌株菌液50mL、B菌株菌液50mL、C菌株菌液50mL，分别在转速为5000～10000转/分钟条件下，离心分离10～15分钟，倾去上清液，用0.85%生理盐水悬浮细胞，完成一次细胞的离心洗涤；再重复2次细胞的离心洗涤，制得A菌株细胞悬液、B菌株细胞悬液和C菌株细胞悬液；
1.2.2、取A菌株细胞悬液50mL、B菌株细胞悬液50mL和C菌株细胞悬液50mL，与浓度1％～5％的固定化载体溶液按体积比1:1～4的比例混合均匀后，成型造粒，固定化细胞颗粒直径2～5mm，室温固化2～6小时，温度4℃，12小时平衡，倾去上清液，加入无菌水洗涤3次；分别制得A菌株固定化细胞颗粒、B菌株固定化细胞颗粒和C菌株固定化细胞颗粒；
所述的固定化载体溶液中载体为琼脂或壳聚糖或角叉或聚乙烯醇，溶剂为水；
1.3、固定化细胞连续发酵制醋
2.3.1、取100g～500g的A菌株固定化细胞颗粒、100g～500g的B菌株固定化细胞颗粒和100g～500g的C菌株固定化细胞颗粒分别置于容器中，盛有A菌株固定化细胞颗粒的容器为A容器，盛有B菌株固定化细胞颗粒的容器为B容器，盛有C菌株固定化细胞颗粒的容器为C容器；A容器的进口、B容器的进口和C容器的进口均位于容器的上部，A容器的出口、B容器的出口和C容器的出口均位于容器的下部；
1.3.2、C容器的出口连通着A容器的进口；A容器的出口连通着B容器的进口；常温下，通过进口向C容器中连续注入2％～6％的淀粉溶液，控制流速为10～100mL/小时，收集B容器出口流出的发酵液；1～3天平衡后即可由B容器出口连续得到醋酸溶液，醋酸溶液中醋酸含量为1.0～4.0％。
3.根据权利要求1所述的多菌株固定化细胞组合物连续发酵制醋方法，其特征在于：在菌株的固定化步骤的第2步中：取A菌株细胞悬液50mL和B菌株细胞悬液50mL，与浓度1％～5％的海藻酸钠溶液按体积比1:1～4的比例混合均匀，滴入浓度0.5％～1.5％的氯化钙（CaCl2）溶液，自然成型造粒；所述海藻酸钠溶液为固定化载体溶液。
4.根据权利要求2所述的多菌株固定化细胞组合物连续发酵制醋方法，其特征在于：在菌株的固定化步骤的第2步中：取A菌株细胞悬液50mL、B菌株细胞悬液50mL和C菌株细胞悬液50mL，与浓度1％～5％的海藻酸钠溶液按体积比1:1～4的比例混合均匀，滴入浓度0.5％～1.5％的氯化钙（CaCl2）溶液，自然成型造粒；所述海藻酸钠溶液为固定化载体溶液。
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