CN109486645B - 应用固定化靶向多微菌种酿造调香老陈醋的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种应用固定化靶向多微菌种酿造调香老陈醋的方法，利用对大曲中分离出的靶向菌种进行共固定化处理，再利用共固定化菌种培养发酵的种子醪液，将培养的种子醪液代替部分大曲添加到老陈醋酿造的液态浓醪酒精发酵阶段和固态酒精发酵过程中，共固定化的菌种在发酵过程中互生、交替、酶系互补，在酒精发酵阶段、醋酸发酵阶段协同发酵，使发酵终了代谢产物丰富，老陈醋产品酸绵适口，滋味柔和，口感醇厚。

Description

应用固定化靶向多微菌种酿造调香老陈醋的方法

技术领域

本发明涉及食醋加工技术领域，具体为一种应用固定化靶向多微菌种酿造调香老陈醋的方法。

背景技术

山西老陈醋传统酿制技艺是国家级非物质文化遗产，是以高粱、麸皮为主要原料，以稻壳和谷壳为辅料，以大麦、豌豆为原料制作的大曲为糖化发酵剂，经酒精发酵后采用固态醋酸发酵，再经熏醅、陈酿等工艺酿制而成，产品具有“酸、绵、甜、香、鲜”的独特风味。山西老陈醋加曲量大，高达主粮高粱的62.5%。大曲的制作需要精选优质的大麦豌豆，经踩曲、翻曲、养曲等工艺，21天微生物的自然聚沉生产而成，生产成本较高。大曲为山西老陈醋的糖化发酵剂，但根据对不同季节生产的大曲液化淀粉酶活力、糖化酶活力、蛋白酶活力、发酵力及酯化力的测定发现，大曲的上述指标并不高，无形中降低了山西老陈醋的生产效率，增加了生产成本，同时还会导致原料利用不彻底，造成成品老陈醋中的残淀粉、残糖含量较高，这些残留的营养物质为微生物的生长创造了有利的条件，容易引起微生物的二次发酵，很大程度上影响了产品的稳定性。因此，研究能够提高老陈醋酿造过程原料中营养物质利用率的发酵方式，同时降低生产成本，提高发酵效率，对实际生产意义重大。

固定化技术是指利用化学或物理手段将游离的细胞、微生物或酶，定位于限定的空间区域并使其保持活性和可反复使用的一种基本技术。将固定化技术与食醋酿造相结合，结合菌种生长的兼容性及对产品质量的要求，先分离筛选大曲中高淀粉酶活性、高糖化酶活性、高蛋白酶活性、高发酵力及高酯化力的菌种，并分析筛选出的菌种耐酸性及耐酒精性及耐高温性，选出适合固定化培养后应用于食醋发酵的菌种，利用多种微生物自然代谢产生的淀粉酶、糖化酶等在发酵过程中分解原辅料中的大分子物质，不仅可以保持食醋酿造微生物的活力，连续使用，还可以在酿造过程中部分代替大曲，降低生产成本。

目前，中国专利CN200610027012.9《采用多菌种生产山西老陈醋的方法》在老陈醋酿造液化阶段添加淀粉酶，糖化阶段添加糖化酶及麸曲，酒化阶段添加固定化酵母，对应阶段的发酵得到了有效的调控，缩短了生产周期。但不同酶、麸曲、固定化酵母在不同阶段添加，操作繁琐，同时上述活性物质仅能够在对应添加的阶段发挥作用，在其他的发酵阶段可能会因发酵环境的条件而抑制或失活，虽然该专利也应用了固定化技术，但仅对酵母进行固定化，仅保护了酵母，提高了酵母的发酵力，未提高酒精发酵过程中的淀粉、蛋白质等营养物质的分解力。中国已公开专利CN106701519.A《一种利用高产酯土著生香酵母强化大曲提高食醋总酸总酯、还原糖含量的方法》采用从大曲中分离出的耐乙醇、耐酸的高产酯生香酵母强化大曲，克服了酿造过程中菌种不相容的问题，但仅单一的强化了大曲的发酵力，对大曲的液化淀粉酶活力、糖化酶活力、蛋白酶活力、酯化力等未见提高。中国已公开专利CN106701518.A《一种减少大曲用量，提升醋品质的大曲强化方法》采用从大曲中分离出高产纤维素酶和淀粉酶的真菌菌株强化于大曲中，并将该强化大曲应用于醋酸发酵过程，一定程度上提高了原料的利用率，改善了醋的品质，但该专利仅提高了醋酸发酵过程中原料的利用率，而对发酵的其他阶段未采取有效措施。

发明内容

本发明的目的在于提供一种应用固定化靶向多微菌种酿造调香老陈醋的方法，用于解决老陈醋酿造过程中加曲量大，成本高的问题，同时采用本发明可以提高原料利用率，保证产品的稳定性。

为了达到上述目的，本发明通过以下方法实现：

一种应用固定化靶向多微菌种酿造调香老陈醋的方法，包括如下步骤：

（1）、固定化菌种的靶向筛选

以大曲为原料，经过试验筛选出菌种：具有最优液化淀粉酶活力和糖化力的根霉，具有最优发酵力和酯化力的酵母，具有最优酯化力及糖化力的红曲霉；

（2）、菌种的固定化

选择乳酸菌同时与上述筛选出的菌种进行固定化；

2.1、取老陈醋生产淋醋结束的白醅糟，在121℃的烘箱中4h烘干，用粉碎机粉碎成40目，高温灭菌后备用；

2.2、菌种的培养

将筛选出的酵母菌和乳酸菌接种到各自的增殖培养基中培养，乳酸菌培养24h~48h、酵母菌培养2~4d；

将筛选出的根霉及红曲霉分别接种到PDA斜面培养基上，根霉培养2~4d，红曲霉培养5~7d；

上述菌种的培养温度均为30℃；

2.3、菌悬液的制备

将酵母菌及乳酸菌的增殖培养液于4℃低温离心4000r/min，时间20min，得细胞沉淀；

用无菌生理盐水分别洗涤根霉及红曲霉的PDA平板上的孢子，将得到的孢子悬液4℃低温离心4000r/min，时间20min，得孢子沉淀；

以菌体沉淀质量计，按照酵母菌：根霉：红曲霉：乳酸菌为5:4:2:1混合后用无菌生理盐水调制成含菌10⁹~10¹⁰/mL的悬液；

2.4、共固定化菌种的制备

取步骤2.3制好的悬液a L，向其中加入经步骤（1）制作的醋糟粉50a g~150a g搅拌吸附2h，再向混合液中加入浓度为3%~7%的无菌海藻酸钠溶液2a L，混合均匀后，继续加入浓度为2%~10%的无菌聚乙烯醇溶液a L，持续搅拌1h；再经无菌连续滴注器滴入5a L的浓度为2%~6%的无菌氯化钙溶液中，常温静置4h后将氯化钙溶液排出，得到共固定化靶向多微菌种，将共固定化菌种置于固定发酵罐中；

（3）、发酵种子醪液制备

以高粱为原料，将高粱粉碎后置于糖化罐中，加35~40℃的温水调至淀粉含量为14%~16%，升温至50℃，保温润料，并向其中加入耐高温α-淀粉酶调至100单位酶活力/克淀粉，搅拌均匀后继续升温至95℃，保温液化40~60min，液化结束后将醪液温度降到65℃时，按高粱添加量的20%~25%加入麸曲，保温糖化2~3h，糖化结束后醪液的白利度为18~20Brix；待醪液温度降至28℃，将醪液输送至步骤2.4的固定发酵罐中；保持罐内温度为28℃~30℃，培养15~20h；待醪液的菌数达到10¹⁰/mL时，即可作为种子醪液加入到老陈醋生产过程中；

（4）、调香老陈醋的生产方法

4.1、原料处理

将高粱粉碎备用；

4.2、调浆润料

将步骤4.1粉碎好的高粱粉输送至糖化罐中，加高粱使用量的300%的35~40℃的温水，将升温至50℃，保温润料；

4.3液化

向步骤4.2的醪液中加入耐高温α-淀粉酶调至100单位酶活力/克淀粉，搅拌均匀后继续升温至95℃，保温液化，以碘试反应判断液化终点，当滴加碘液，醪液变为黄褐色为液化终点；

4.4、糖化

将经过步骤4.3的醪液温度降到65℃时，按高粱添加量的20%~25%加入麸曲，保温糖化1h，待醪液的白利度为16~18Brix时，糖化结束；

4.5、液态浓醪酒精发酵

将经过步骤4.4的醪液继续降温至28℃时，加入步骤3的发酵种子醪液，添加量为原料高粱的8%~10%；同时添加大曲，大曲添加量为高粱添加量的30%~35%；将醪液搅拌均匀，注入酒精发酵罐，温度保持30~32℃，发酵14d；其中，酒精发酵前三天每天通空气，设置酒精发酵罐温度30~32℃；酒精发酵三天后将酒精罐密封发酵；

4.6、固态酒精发酵

将麸皮、谷壳与90~95℃的热水混合均匀拌醅，使得拌醅结束醅料的温度为37℃，醅料水分为64%~66%，麸皮、谷壳的添加量分别为原料高粱使用量的90%~100%、75%~80%；再将混合均匀的物料与步骤3的发酵种子醪液及步骤4.5液态浓醪酒精发酵结束后的酒醪同时混匀，发酵种子醪液的添加量为原料高粱使用量的7.5%~10%；经充分混匀的物料放入瓮缸中密闭发酵4d；

4.7、固态醋酸发酵

将麸皮、谷壳与水混合均匀，使得醋酸发酵初始醅料的酒精度为5.5vol%，水分含量为64%~66%，麸皮、稻壳的添加量分别为原料高粱使用量的20%~25%、20%~25%；再将混合均匀的物料与步骤4.6固态酒精发酵结束后的酒醅混匀，向瓮缸中加入已进行醋酸发酵第三天的醋醅作为醋酸菌种子，置于瓮缸中心，添加量为高粱添加量的10%，开始醋酸发酵；每日翻醅，12d~15d后醋醅的醅酸≥5.0%，酒精度＜0.2%vol，结束醋酸发酵；

4.8、压醅

将步骤4.7固态醋酸发酵成熟的醋醅中加入高粱原料比重5%~10%的食盐，压实用塑料布密封保存20d~22d，获得白醋醅；

4.9、熏醅

将步骤4.8发酵完成的一半的白醋醅置于熏醅瓮缸中熏制，经过4~5天熏醅，每日翻拌一次，获得熏醋醅；

4.10、淋醋

将步骤4.8压醅后的白醋醅和步骤4.9熏制获得的熏醋醅分别装入白淋池和熏淋池，经白醅淋醋及加热串淋熏醅，经过三次循环套淋获得半成品老陈醋；

4.11、陈酿

将步骤4.10获得的半成品老陈醋，经12个月的陈酿。

本发明制备的产品质量符合GB/T 19777-2013《地理标志产品 山西老陈醋》。

本发明在继承传统山西老陈醋酿造工艺的基础上，进行工艺改进，具有以下优点及突出性效果：

1、本发明选择从老陈醋大曲中进行菌种筛选，避免了采用外来引入菌种进行发酵可能出现的发酵不容性的问题。

2、本发明菌种的筛选过程紧扣发酵工艺，对老陈醋酿造过程菌种的主要来源——大曲中的微生物进行高液化淀粉酶活力、高糖化酶活力、高蛋白酶活力、高发酵力及高酯化力的靶向筛选。同时结合发酵过程中酒精发酵的高酒精环境和醋酸发酵的高温高酸环境，从筛选出的菌种中继续优选耐酒精、耐酸及耐高温的菌种作为固定化的菌种，确保了菌种在整个发酵过程中的可以保持较高的活力。

3、本发明选择高液化淀粉酶活力、高糖化力的根霉，高发酵力、高产酯的酵母，高糖化酶活力、高酯化力的红曲霉及乳酸菌作为共固定化的菌种，全方位的提高了发酵的效率，将四种微生物固定在载体上，使菌体活性持续稳定，形成共固定化混合细胞发酵体系，可以发挥多菌种发酵的优势，弥补单一菌种发酵的不足，利用该固定化体系中根霉产生的丰富的淀粉酶和糖化酶，生香酵母产生的丰富的香气成分，红曲产生的多种糖化酶及风味物质，乳酸菌产生的乳酸和低级脂肪酸等，能够较为明显的改善成品食醋的风味，尤其可以提高老陈醋中的总酯含量及乳酸含量，使老陈醋呈现柔和的酸味及酯香味。传统工艺生产的老陈醋中总酯含量为3.8g/100mL，不挥发酸含量为2.06g/100mL；而采用本发明生产的老陈醋中总酯含量可达5.1g/100mL，不挥发酸含量为2.69g/100mL。

4、本发明在固定化时先加入醋糟粉末，通过醋糟的吸附作用，先对菌种进行初步的固定，再采用海藻酸钠-聚乙烯醇复合包埋法对菌种进行固定化，吸附结合包埋法显著的减少菌种细胞的渗漏，增加了固定化菌种的机械强度，同时还有较好的发酵性能。在控制变量的条件下，单独采用海藻酸钠进行固定化的细胞渗透量为8.2×10⁶个/mL，平均机械强度为11.35g/mm²，采用此共固定化细胞发酵的种子醪液进行液态浓醪酒精发酵的酒精生成速率为0.518%vol/天；海藻酸钠-聚乙烯醇复合包埋法固定化的细胞渗透量为6.7×10⁵个/mL，平均机械强度为14.15g/mm²，液态浓醪酒精发酵的酒精生成速率为0.531%vol/天；采用醋糟吸附法结合海藻酸钠-聚乙烯醇复合包埋法固定化的细胞渗透量为9.2×10⁴个/mL，平均机械强度为17.3g/mm²，液态浓醪酒精发酵的酒精生成速率为0.579%vol/天。

5、本发明在继承原有老陈醋酿造工艺的基础上，增加了固态酒精发酵过程，液态酒精发酵过程结束的酒醪与共固定化菌种发酵的醪液、麸皮、谷壳及适量的热水同时搅拌均匀堆积，温度适宜菌种生长，经过4天的固态酒精发酵，可以富集根霉、红曲霉、乳酸菌及酵母等菌种，这些耐酒精耐酸性的菌种活力不仅可以在固态酒精发酵过程中发挥作用，在醋酸发酵过程中活力依然旺盛，可以分解醅料中残留的淀粉，边糖化，边酒化，边醋化，从而提高原料的利用率。传统工艺生产的老陈醋醋酸发酵结束的醋糟中残淀粉含量为8%~9%，采用本发明生产的老陈醋醋糟中残淀粉含量为6%~7%。由实验结果也可以看出，固定化的四个菌种在整个老陈醋发酵过程中的三边发酵作用，可以大大提高原料中淀粉的利用率。

6、本发明在继承原有老陈醋酿造工艺的基础上，在醋酸发酵结束增加了压醅的过程。醋酸发酵结束后，醋醅的酸度达到5%以上，此时增加压醅这一过程，杂菌无法生长，而醋醅中丰富的酸类物质可以和残留的醇类物质发生酯化反应，使得最终半成品醋中的酯类物质平均增加了34.21%，也使得老陈醋中酯香持久，香气和谐，缓冲酸味。

7、本发明在发酵过程中降低了大曲的用量，传统老陈醋生产工艺大曲添加量为主粮重量的62.5%，采用本发明老陈醋生产工艺大曲添加量为主粮重量的30%~35%，成功解决了老陈醋酿造过程中加曲量大，成本高的问题。

本发明利用对大曲中分离出的靶向菌种进行共固定化处理，再利用共固定化菌种培养发酵的种子醪液，将培养的种子醪液代替部分大曲添加到老陈醋酿造的液态浓醪酒精发酵阶段和固态酒精发酵过程中，共固定化的菌种在发酵过程中互生、交替、酶系互补，在酒精发酵阶段、醋酸发酵阶段协同发酵，使发酵终了代谢产物丰富，老陈醋产品酸绵适口，滋味柔和，口感醇厚。

本发明设计合理，具有很好的市场推广及应用价值。

附图说明

图1表示应用固定化靶向多微菌种酿造调香老陈醋的工艺流程图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施例进行详细说明。

一种应用固定化靶向多微菌种酿造调香老陈醋的方法，包括如下步骤：

（1）、固定化菌种的靶向筛选

以大曲为原料，采用本领域普通技术人员熟知的方法分别对大曲中高液化淀粉酶活力、高糖化酶活力、高蛋白酶活力、高发酵力及高酯化力菌种进行筛选，并测试筛出菌种的乙醇耐受性、酸的耐受性及高温耐受性。经过试验筛选出的菌种为高液化淀粉酶活力、高糖化力根霉，高发酵力、高产酯酵母，高酯化力及高糖化酶活力红曲霉。

（2）、菌种的固定化

为了提高老陈醋总酸中不挥发酸的比例，改善老陈醋新醋刺激酸的口感，选择乳酸菌同时与上述筛选出的菌种进行固定化。乳酸菌发酵产生的乳酸，同时为酵母的生长提供酸性环境，促进酵母的生长。

2.1、取老陈醋生产淋醋结束的白醅糟，在121℃的烘箱中4h烘干，用粉碎机粉碎成40目，高温灭菌后备用。

2.2、菌种的培养

将酵母菌、乳酸菌接种到各自的增殖培养基中培养，乳酸菌培养24h~48h、酵母菌培养2d~4d；根霉及红曲霉接种到PDA斜面培养基上，根霉培养2d~4d，红曲霉培养5d~7d。培养温度均为30℃。

2.3、菌悬液的制备

将酵母菌及乳酸菌的增殖培养液于4℃低温离心4000r/min，20min，得细胞沉淀；用无菌生理盐水分别洗涤根霉及红曲霉的PDA平板上的孢子，将得到的孢子悬液于4℃低温离心4000r/min，20min，得孢子沉淀；

以菌体沉淀（或孢子沉淀）质量计，按照酵母菌:根霉:红曲霉:乳酸菌为5:4:2:1混合后用无菌生理盐水调制成含菌（或孢子）10⁹~10¹⁰/mL的悬液。

2.4、共固定化菌种的制备

取步骤2.3制好的悬液3L，向其中加入经步骤1制作的醋糟粉150g~450g搅拌吸附2h，再向混合液中加入浓度为3%~7%的无菌海藻酸钠溶液6L，混合均匀后，继续加入浓度为2%~10%的无菌聚乙烯醇溶液3L，持续搅拌1h。再经无菌连续滴注器滴入15L的浓度为2%~6%的无菌氯化钙溶液中，常温静置4h后将氯化钙溶液排出，得到共固定化靶向多微菌种，将共固定化菌种置于固定发酵罐中。

（3）、发酵种子醪液制备

以高粱为原料，将20kg高粱粉碎后置于糖化罐中，加35~40℃的温水调至淀粉含量为14%~16%，升温至50℃，保温润料，并向其中加入耐高温α-淀粉酶调至100单位酶活力/克淀粉，搅拌均匀后继续升温至95℃，保温液化40~60min，液化结束后将醪液温度降到65℃时，加入麸曲4kg~5kg，保温糖化2h~3h，糖化结束后醪液的白利度约为18Brix。待醪液温度降至28℃，将醪液输送至步骤2.4的固定发酵罐中。保持罐内温度为28℃~30℃，培养15h~20h，待醪液的菌数达到10¹⁰/mL时，即可作为种子醪液加入到老陈醋生产过程中。

（4）、调香老陈醋的生产方法

4.1原料处理

将高粱100kg粉碎备用；

4.2调浆润料

将步骤4.1粉碎好的高粱粉输送至糖化罐中，加35~40℃的温水300kg，将升温至50℃，保温润料；

4.3液化

向步骤4.2的醪液中加入耐高温α-淀粉酶调至100单位酶活力/克淀粉，搅拌均匀后继续升温至95℃，保温液化，以碘试反应判断液化终点，当滴加碘液，醪液变为黄褐色为液化终点。

4.4糖化

将经过步骤4.3的醪液温度降到65℃时，加入麸曲20kg~25kg，保温糖化，约1h，待醪液的白利度约为16Brix时，糖化结束。

4.5液态浓醪酒精发酵

将经过步骤4.4的醪液继续降温至28℃时，加入步骤3的发酵种子醪液，添加量为8kg~10kg；同时添加大曲30kg~35kg；将醪液搅拌均匀，注入酒精发酵罐，温度保持30℃~32℃发酵14d，其中酒精发酵前三天每天通空气，使酵母菌充分生长繁殖，设置酒精发酵罐温度30℃~32℃；酒精发酵三天后将酒精罐密封发酵。

4.6固态酒精发酵

将麸皮、谷壳与适量的90~95℃的热水混合均匀拌醅，使得拌醅结束醅料的温度为37℃，醅料水分为64%~66%，麸皮、谷壳的添加量分别为90kg~100kg、75kg~80kg。再将混合均匀的物料与步骤3的发酵种子醪液及步骤4.5液态浓醪酒精发酵结束后的酒醪同时混匀，发酵种子醪液的添加量为7.5kg~10kg。经充分混匀的物料放入瓮缸中密闭发酵4d。

4.7、固态醋酸发酵

将麸皮、谷壳与适量的水混合均匀，使得醋酸发酵初始醅料的酒精度为5.5vol%，水分含量为64%~66%，麸皮、稻壳的添加量分别为20kg~25kg、20kg~25kg。再将混合均匀的物料与步骤4.6固态酒精发酵结束后的酒醅混匀，向瓮缸中加入已有醋酸发酵第三天的醋醅作为“醋酸菌种子”（火醅），置于瓮缸中心，醋酸菌种子添加量为10kg，开始醋酸发酵。每日翻醅，12d~15d后醋醅的醅酸≥5.0%，酒精度＜0.2%vol，醋醅呈铜褐色有光泽，有醋香味则结束醋酸发酵。

4.8、压醅

将步骤4.7固态醋酸发酵成熟的醋醅中加入5kg~10kg的食盐，压实用塑料布密封保存20d~22d，获得白醋醅。

4.9、熏醅

将步骤4.8发酵完成的一半的白醋醅置于熏醅瓮缸中熏制，经过4~5天熏醅，每日翻拌一次，获得熏醋醅。熏醅结束醋醅的颜色为褐红色或深紫色，具有独特的熏醅味。

4.10、淋醋

将步骤4.8压醅后的剩余一半白醋醅和步骤4.9熏制获得的熏醋醅分别装入白淋池和熏淋池，经白醅淋醋经加热串淋熏醅，经过三次循环套淋获得半成品老陈醋。具体为，二淋浸泡白醅，淋出的醋液经过加热煮沸再浸泡熏醅，淋出的醋液经煮沸灭菌即为半成品老陈醋。

4.11、陈酿

将步骤4.10获得的半成品老陈醋，经12个月的陈酿，然后过滤、UHT灭菌、包装为成品。

上述方法制备的产品质量符合GB/T 19777-2013《地理标志产品 山西老陈醋》。

应当指出，对于本技术领域的一般技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和应用，这些改进和应用也视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种应用固定化靶向多微菌种酿造调香老陈醋的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）、固定化菌种的靶向筛选

以大曲为原料，经过试验筛选出菌种：具有最优液化淀粉酶活力和糖化力的根霉，具有最优发酵力和酯化力的酵母，具有最优酯化力及糖化力的红曲霉；

（2）、菌种的固定化

选择乳酸菌同时与上述筛选出的菌种进行固定化；

2.1、取老陈醋生产淋醋结束的白醅糟，在121℃的烘箱中4h烘干，用粉碎机粉碎成40目，高温灭菌后备用；

2.2、菌种的培养

将筛选出的酵母菌和乳酸菌接种到各自的增殖培养基中培养，乳酸菌培养24h~48h、酵母菌培养2~4d；

将筛选出的根霉及红曲霉分别接种到PDA斜面培养基上，根霉培养2~4d，红曲霉培养5~7d；

上述菌种的培养温度均为30℃；

2.3、菌悬液的制备

将酵母菌及乳酸菌的增殖培养液于4℃低温离心4000r/min，时间20min，得细胞沉淀；

用无菌生理盐水分别洗涤根霉及红曲霉的PDA平板上的孢子，将得到的孢子悬液于4℃低温离心4000r/min，时间20min，得孢子沉淀；

以菌体沉淀质量计，按照酵母菌：根霉：红曲霉：乳酸菌为5:4:2:1混合后用无菌生理盐水调制成含菌10⁹~10¹⁰/mL的悬液；

2.4、共固定化菌种的制备

取步骤2.3制好的悬液aL，向其中加入经步骤（1）制作的醋糟粉50ag~15ag搅拌吸附2h，再向混合液中加入浓度为3%~7%的无菌海藻酸钠溶液2a L，混合均匀后，继续加入浓度为2%~10%的无菌聚乙烯醇溶液a L，持续搅拌1h；再经无菌连续滴注器滴入5a L的浓度为2%~6%的无菌氯化钙溶液中，常温静置4h后将氯化钙溶液排出，得到共固定化靶向多微菌种，将共固定化菌种置于固定发酵罐中；

（3）、发酵种子醪液制备

以高粱为原料，将高粱粉碎后置于糖化罐中，加35~40℃的温水调至淀粉含量为14~16%，升温至50℃，保温润料，并向其中加入耐高温α-淀粉酶调至100单位酶活力/克淀粉，搅拌均匀后继续升温至95℃，保温液化40~60min，液化结束后将醪液温度降到65℃时，按高粱添加量的20%~25%加入麸曲，保温糖化2~3h，糖化结束后醪液的白利度为18~20Brix；待醪液温度降至28℃，将醪液输送至步骤2.4的固定发酵罐中；保持罐内温度为28℃~30℃，培养15~20h；待醪液的菌数达到10¹⁰/mL时，即可作为种子醪液加入到老陈醋生产过程中；

（4）、调香老陈醋的生产方法

4.1、原料处理

将高粱粉碎备用；

4.2、调浆润料

将步骤4.1粉碎好的高粱粉输送至糖化罐中，加高粱使用量的300%的35~40℃的温水，将升温至50℃，保温润料；

4.3液化

向步骤4.2的醪液中加入耐高温α-淀粉酶调至100单位酶活力/克淀粉，搅拌均匀后继续升温至95℃，保温液化，以碘试反应判断液化终点，当滴加碘液，醪液变为黄褐色为液化终点；

4.4糖化

将经过步骤4.3的醪液温度降到65℃时，按高粱添加量的20%~25%加入麸曲，保温糖化1h，待醪液的白利度为16~18Brix时，糖化结束；

4.5液态浓醪酒精发酵

将经过步骤4.4的醪液继续降温至28℃时，加入步骤3的发酵种子醪液，添加量为原料高粱的8%~10%；同时添加大曲，大曲添加量为高粱添加量的30%~35%；将醪液搅拌均匀，注入酒精发酵罐，温度保持30~32℃，发酵14d；其中，酒精发酵前三天每天通空气，设置酒精发酵罐温度30~32℃；酒精发酵三天后将酒精罐密封发酵；

4.6固态酒精发酵

将麸皮、谷壳与90~95℃的热水混合均匀拌醅，使得拌醅结束醅料的温度为37℃，醅料水分为64%~66%，麸皮、谷壳的添加量分别为原料高粱使用量的90%~100%、75%~80%；再将混合均匀的物料与步骤3的发酵种子醪液及步骤4.5液态浓醪酒精发酵结束后的酒醪同时混匀，发酵种子醪液的添加量为原料高粱使用量的7.5%~10%；经充分混匀的物料放入瓮缸中密闭发酵4d；

4.7固态醋酸发酵

将麸皮、谷壳与水混合均匀，使得醋酸发酵初始醅料的酒精度为5.5vol%，水分含量为64%~66%，麸皮、稻壳的添加量分别为原料高粱使用量的20%~25%、20%~25%；再将混合均匀的物料与步骤4.6固态酒精发酵结束后的酒醅混匀，向瓮缸中加入已进行醋酸发酵第三天的醋醅作为醋酸菌种子，置于瓮缸中心，添加量为高粱添加量的10%，开始醋酸发酵；每日翻醅，12d~15d后醋醅的醅酸≥5.0%，酒精度＜0.2%vol，结束醋酸发酵；

4.8压醅

将步骤4.7固态醋酸发酵成熟的醋醅中加入高粱原料比重5%~10%的食盐，压实用塑料布密封保存20d~22d，获得白醋醅；

4.9熏醅

将步骤4.8发酵完成的一半的白醋醅置于熏醅瓮缸中熏制，经过4~5天熏醅，每日翻拌一次，获得熏醋醅；

4.10淋醋

将步骤4.8压醅后的白醋醅和步骤4.9熏制获得的熏醋醅分别装入白淋池和熏淋池，经白醅淋醋及加热串淋熏醅，经过三次循环套淋获得半成品老陈醋；

4.11陈酿

将步骤4.10获得的半成品老陈醋，经12个月的陈酿。

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