CN115777877B - 一种高产溶栓纳豆激酶的纳豆发酵及冻干方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高产溶栓纳豆激酶的纳豆发酵及冻干方法，属于纳豆发酵及冻干技术领域，所述纳豆发酵及冻干方法包括如下步骤：（1）大豆预处理；（2）发酵培养基的制备；（3）纳豆芽孢杆菌活化及预培养；（4）产酶固体发酵；（5）老化；（6）真空冷冻干燥。为了解决传统发酵方式获得的纳豆激酶活性低下、发酵效果不理想的问题，本发明提出通过加入天然组分合欢皮提取物、灰树花多糖和壳聚糖等物质刺激纳豆枯草芽孢杆菌的生长，并激活纳豆枯草芽孢杆菌产酶相关基因的表达性能，显著提高了纳豆激酶的含量，本发明提供的纳豆发酵及冻干方法，方法科学，工艺合理，可用于健康无害化的不同类型不同级别的纳豆激酶制品的研发与生产。
Description
技术领域
本发明属于纳豆发酵及冻干技术领域，具体是指一种高产溶栓纳豆激酶的纳豆发酵及冻干方法。
背景技术
纳豆，起源于中国古代，自秦汉以来开始制作，由黄豆通过纳豆菌发酵制成豆制品，具有黏性，气味较臭，味道微甜，不仅保有黄豆的营养价值、富含维生素K2、提高蛋白质的消化吸收率，更重要的是发酵过程产生了多种生理活性物质，具有溶解体内纤维蛋白及其他调节生理机能的保健作用。
纳豆激酶是是由纳豆芽孢杆菌（
Bacillus subtilis）在发酵过程中天然分泌的一种碱性丝氨酸蛋白酶，纳豆激酶具有较强的纤溶活性，可以改善血液循环、降低血粘度，而且在血液中的保存时间长、不易被胃酸分解，因而具有预防和治疗血栓相关疾病的能力；纳豆芽孢杆菌是一类好氧型、有纤溶能力的杆状细菌，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和较强的抗逆能力，应用前景广泛。
传统纳豆激酶生产方法通常直接使用纳豆芽孢杆菌进行发酵，但是发酵获得的纳豆激酶活性低下，发酵效果不理想，为此，本发明提出了一种高产溶栓纳豆激酶的纳豆发酵及冻干方法。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种高产溶栓纳豆激酶的纳豆发酵及冻干方法，为了解决传统发酵方式获得的纳豆激酶活性低下、发酵效果不理想的问题，本发明对纳豆发酵培养基进行改良，提出通过加入天然组分合欢皮提取物、灰树花多糖和壳聚糖等物质刺激纳豆枯草芽孢杆菌的生长，并激活纳豆枯草芽孢杆菌产酶相关基因的表达性能，显著提高了纳豆激酶的活性及含量，同时，本发明改良了纳豆发酵及冻干工艺程序，使加工程序在保持更高的纳豆激酶含量的同时更加简约化，总之，本发明提供的纳豆发酵及冻干方法，方法科学，工艺合理，产品的质量与安全性，可用于健康无害化的不同类型不同级别的纳豆激酶制品的研发与生产。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：本发明提出了一种高产溶栓纳豆激酶的纳豆发酵及冻干方法，所述纳豆发酵及冻干方法包括如下步骤：
（1）大豆预处理：选择颗粒饱满、表皮完整、无霉变或虫蛀的大豆，清洗3-4次，浸泡12-24小时，直至豆粒饱胀，无硬心为准，沥干后得到预发酵大豆；
（2）发酵培养基的制备：将预发酵大豆、蔗糖、七水硫酸镁、氯化钙、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、合欢皮提取物、灰树花多糖和壳聚糖混合均匀后在蒸汽灭菌锅内蒸煮30-40分钟进行灭菌，冷却后备用；
（3）纳豆芽孢杆菌活化及预培养：所述纳豆芽孢杆菌活化为将纳豆枯草杆菌在无菌环境中用接种环采用“Z”字划线接种到纳豆芽孢杆菌活化培养基上，在35-38℃培养箱中培养24-30小时得到活化后的纳豆芽孢杆菌；所述预培养为将所述活化的纳豆芽孢杆菌在无菌环境下接种到纳豆芽孢杆菌预培养基中，在35-38℃、200r/min条件下振荡培养16-18小时获得纳豆芽孢杆菌培养菌液；
（4）产酶固体发酵：将步骤（3）中所述纳豆芽孢杆菌培养菌液均匀的接种在步骤（2）制备的发酵培养基中进行产酶固体发酵；
（5）老化：将经过步骤（4）固体发酵的纳豆置于低温环境下，老化24h获得鲜纳豆；
（6）真空冷冻干燥：采用无菌操作将步骤（5）获得的鲜纳豆放入真空冷冻干燥机内进行冻干处理，粉碎后即可获得纳豆冻干粉。
优选地，所述发酵培养基包括如下质量浓度的成分：500-860g/L预发酵大豆；30-45g/L蔗糖；2.5-4.0g/L七水硫酸镁；0.1-0.5g/L氯化钙；0.5-1.0g/L磷酸氢二钾；0.5-1.0g/L磷酸二氢钾；1-3g/L合欢皮提取物；15-25g/L灰树花多糖；8-10g/L壳聚糖。
优选地，所述发酵培养基的pH为6.8-7.0。
优选地，所述纳豆芽孢杆菌活化培养基包括如下质量浓度的成分：10g/L蛋白胨；2g/L牛肉粉；2.0g/L氯化钠；琼脂18g/L，于121℃灭菌20分钟，冷却后使用。
在本发明的一个优选实施方式中，所述纳豆芽孢杆菌预培养基包括如下质量浓度的成分：8-10g/L蛋白胨；2-3g/L牛肉粉；2.0-2.5g/L氯化钠；2.0-2.5g/L壳聚糖；3-5g/L合欢皮提取物；4-5g/L灰树花多糖，所述纳豆芽孢杆菌预培养基为液体培养基，于121℃灭菌20分钟，充分冷却后使用。
优选地，所述步骤（4）中纳豆芽孢杆菌培养菌液的接种比例为发酵培养基体积的3.5-6％。
优选地，所述步骤（4）中产酶固体发酵的温度为36-40℃，所述产酶固体发酵的发酵时间为24-30h。
优选地，所述步骤（5）中低温环境的温度为4-8℃。
优选地，所述步骤（6）中真空冷冻干燥的条件为-40℃保持2h、0℃保持20h、30℃保持15-18h即可冻干，真空冷冻干燥的总时间为35-40h。
优选地，所述步骤（6）中粉碎采用粗粉碎处理5min、过80目筛或采用超微粉碎方式处理10-30min。
与现有技术相比较，本发明取得的有益效果如下：
（1）本发明提供了一种高产溶栓纳豆激酶的纳豆发酵及冻干方法，为了解决传统发酵方式获得的纳豆激酶活性低下、发酵效果不理想的问题，本发明对纳豆发酵培养基进行改良，提出通过加入天然组分刺激纳豆枯草芽孢杆菌的生长，并激活纳豆枯草芽孢杆菌产酶相关基因的表达性能，显著提高了纳豆激酶的活性及含量；
（2）合欢皮提取物、灰树花多糖和壳聚糖存在协同提高纳豆芽孢杆菌生长的功效，主要表现为加快生长繁殖平缓期的到来，从而加快纳豆发酵的速度，同时稳定纳豆芽孢杆菌达到生长繁殖平缓期后的数量，相较于传统培养基，本发明提供的纳豆芽孢杆菌预培养基及发酵培养基更有利于纳豆芽孢杆菌进行发酵及产纳豆激酶，进而最终实现提高纳豆激酶含量的技术效果；
（3）本发明改良了纳豆发酵及冻干工艺程序，使加工程序在保持更高的纳豆激酶含量的同时更加简约化，纳豆芽孢杆菌活化及预培养的设置，使纳豆芽孢杆菌在进行发酵前进入最佳状态，从而提高自身的活性；
（4）总之，本发明提供的纳豆发酵及冻干方法，方法科学，工艺合理，产品的质量与安全性，可用于健康无害化的不同类型不同级别的纳豆激酶制品的研发与生产。
附图说明
图1为本发明制备的纳豆冻干粉的纳豆激酶活力测定结果图；
图2为纳豆枯草芽孢杆菌关键基因的表达激活分析结果图；
图3为实施例1中纳豆枯草芽孢杆菌在发酵中的生长曲线分析结果图；
图4为实施例2中纳豆枯草芽孢杆菌在发酵中的生长曲线分析结果图；
图5为实施例3中纳豆枯草芽孢杆菌在发酵中的生长曲线分析结果图；
图6为对比例1中纳豆枯草芽孢杆菌在发酵中的生长曲线分析结果图；
图7为对比例2中纳豆枯草芽孢杆菌在发酵中的生长曲线分析结果图；
图8为对比例3中纳豆枯草芽孢杆菌在发酵中的生长曲线分析结果图；
图9为对比例4中纳豆枯草芽孢杆菌在发酵中的生长曲线分析结果图。
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料及试验菌株，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
实施例1
一种高产溶栓纳豆激酶的纳豆发酵及冻干方法
所述纳豆发酵及冻干方法包括如下步骤：
（1）大豆预处理：选择颗粒饱满、表皮完整、无霉变或虫蛀的大豆，清洗3-4次，浸泡12-24小时，直至豆粒饱胀，无硬心为准，沥干后得到预发酵大豆。
（2）发酵培养基的制备：将预发酵大豆、蔗糖、七水硫酸镁、氯化钙、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、合欢皮提取物、灰树花多糖和壳聚糖混合均匀后在蒸汽灭菌锅内蒸煮30-40分钟进行灭菌，冷却后备用；
其中所述发酵培养基包括如下质量浓度的成分：500g/L预发酵大豆；30g/L蔗糖；2.5g/L七水硫酸镁；0.1g/L氯化钙；0.5g/L磷酸氢二钾；0.5g/L磷酸二氢钾；1g/L合欢皮提取物；15g/L灰树花多糖；8g/L壳聚糖；所述发酵培养基的pH为6.8-7.0。
（3）纳豆芽孢杆菌活化及预培养：所述纳豆芽孢杆菌活化为将纳豆枯草杆菌在无菌环境中用接种环采用“Z”字划线接种到纳豆芽孢杆菌活化培养基上，在35-38℃培养箱中培养24-30小时得到活化后的纳豆芽孢杆菌；所述预培养为将所述活化的纳豆芽孢杆菌在无菌环境下接种到纳豆芽孢杆菌预培养基中，在35-38℃、200r/min条件下振荡培养16-18小时获得纳豆芽孢杆菌培养菌液，本发明使用的纳豆枯草杆菌购于广东省微生物菌种保藏中心。
所述纳豆芽孢杆菌活化培养基包括如下质量浓度的成分：10g/L蛋白胨；2g/L牛肉粉；2.0g/L氯化钠；琼脂18g/L，于121℃灭菌20分钟，冷却后使用；
所述纳豆芽孢杆菌预培养基包括如下质量浓度的成分：8g/L蛋白胨；2g/L牛肉粉；2.0g/L氯化钠；2.0g/L壳聚糖；3g/L合欢皮提取物；4g/L灰树花多糖，所述纳豆芽孢杆菌预培养基为液体培养基，于121℃灭菌20分钟，充分冷却后使用。
其中灰树花多糖采用乙醇层析法以灰树花为原料提取所得，也可以通过商业途径购买，所述合欢皮提取物采用乙醇回流法制备所得，具体为使用体积份数为95％乙醇溶液浸泡24小时后，80-90℃加热回流提取2-3次，每次提取时间为2-3小时，合并提取液，过滤，滤液经回收乙醇后浓缩成浸膏，冷冻干燥成粉末，其他组分通过常规商业途径购买获得，其中蛋白胨、牛肉粉、壳聚糖购于北京索莱宝科技有限公司。
（4）产酶固体发酵：将步骤（3）中所述纳豆芽孢杆菌培养菌液均匀的接种在步骤（2）制备的发酵培养基中进行产酶固体发酵，纳豆芽孢杆菌培养菌液的接种比例为发酵培养基体积的3.5％，产酶固体发酵的温度为36-40℃，所述产酶固体发酵的发酵时间为24h。
（5）老化：将经过步骤（4）固体发酵的纳豆置于4-8℃低温环境下，老化24h获得鲜纳豆；
（6）真空冷冻干燥：采用无菌操作将步骤（5）获得的鲜纳豆放入真空冷冻干燥机内进行冻干处理，粉碎后即可获得纳豆冻干粉；
其中，真空冷冻干燥的条件为-40℃保持2h、0℃保持20h、30℃保持15-18h即可冻干，真空冷冻干燥的总时间为35-40h；
所述步骤（6）中粉碎采用粗粉碎处理5min、过80目筛。
实施例2
一种高产溶栓纳豆激酶的纳豆发酵及冻干方法
所述纳豆发酵及冻干方法包括如下步骤：
（1）大豆预处理：选择颗粒饱满、表皮完整、无霉变或虫蛀的大豆，清洗3-4次，浸泡12-24小时，直至豆粒饱胀，无硬心为准，沥干后得到预发酵大豆。
（2）发酵培养基的制备：将预发酵大豆、蔗糖、七水硫酸镁、氯化钙、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、合欢皮提取物、灰树花多糖和壳聚糖混合均匀后在蒸汽灭菌锅内蒸煮30-40分钟进行灭菌，冷却后备用；
其中所述发酵培养基包括如下质量浓度的成分：860g/L预发酵大豆；45g/L蔗糖；4.0g/L七水硫酸镁；0.5g/L氯化钙；1.0g/L磷酸氢二钾；1.0g/L磷酸二氢钾；3g/L合欢皮提取物；25g/L灰树花多糖；10g/L壳聚糖；所述发酵培养基的pH为6.8-7.0。
（3）纳豆芽孢杆菌活化及预培养：所述纳豆芽孢杆菌活化为将纳豆枯草杆菌（
Bacillus subtilis）在无菌环境中用接种环采用“Z”字划线接种到纳豆芽孢杆菌活化培养基上，在35-38℃培养箱中培养24-30小时得到活化后的纳豆芽孢杆菌；所述预培养为将所述活化的纳豆芽孢杆菌在无菌环境下接种到纳豆芽孢杆菌预培养基中，在35-38℃、200r/min条件下振荡培养16-18小时获得纳豆芽孢杆菌培养菌液；
其中，所述纳豆芽孢杆菌活化培养基包括如下质量浓度的成分：10g/L蛋白胨；2g/L牛肉粉；2.0g/L氯化钠；琼脂18g/L，于121℃灭菌20分钟，冷却后使用；
其中，所述纳豆芽孢杆菌预培养基包括如下质量浓度的成分：10g/L蛋白胨；3g/L牛肉粉；2.5g/L氯化钠；2.5g/L壳聚糖；5g/L合欢皮提取物；5g/L灰树花多糖，所述纳豆芽孢杆菌预培养基为液体培养基，于121℃灭菌20分钟，充分冷却后使用。
（4）产酶固体发酵：将步骤（3）中所述纳豆芽孢杆菌培养菌液均匀的接种在步骤（2）制备的发酵培养基中进行产酶固体发酵，纳豆芽孢杆菌培养菌液的接种比例为发酵培养基体积的4.5％，产酶固体发酵的温度为36-40℃，所述产酶固体发酵的发酵时间为24h。
（5）老化：将经过步骤（4）固体发酵的纳豆置于4-8℃低温环境下，老化24h获得鲜纳豆；
（6）真空冷冻干燥：采用无菌操作将步骤（5）获得的鲜纳豆放入真空冷冻干燥机内进行冻干处理，粉碎后即可获得纳豆冻干粉；
其中，真空冷冻干燥的条件为-40℃保持2h、0℃保持20h、30℃保持15-18h即可冻干，真空冷冻干燥的总时间为35-40h；
所述步骤（6）中粉碎采用粗粉碎处理5min、过80目筛。
实施例3
一种高产溶栓纳豆激酶的纳豆发酵及冻干方法
所述纳豆发酵及冻干方法包括如下步骤：
（1）大豆预处理：选择颗粒饱满、表皮完整、无霉变或虫蛀的大豆，清洗3-4次，浸泡12-24小时，直至豆粒饱胀，无硬心为准，沥干后得到预发酵大豆。
（2）发酵培养基的制备：将预发酵大豆、蔗糖、七水硫酸镁、氯化钙、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、合欢皮提取物、灰树花多糖和壳聚糖混合均匀后在蒸汽灭菌锅内蒸煮30-40分钟进行灭菌，冷却后备用；
其中所述发酵培养基包括如下质量浓度的成分：750g/L预发酵大豆；30g/L蔗糖；2.5g/L七水硫酸镁；0.5g/L氯化钙；1.0g/L磷酸氢二钾；1.0g/L磷酸二氢钾；3g/L合欢皮提取物；20g/L灰树花多糖；10g/L壳聚糖；所述发酵培养基的pH为6.8-7.0。
（3）纳豆芽孢杆菌活化及预培养：所述纳豆芽孢杆菌活化为将纳豆枯草杆菌在无菌环境中用接种环采用“Z”字划线接种到纳豆芽孢杆菌活化培养基上，在35-38℃培养箱中培养24-30小时得到活化后的纳豆芽孢杆菌；所述预培养为将所述活化的纳豆芽孢杆菌在无菌环境下接种到纳豆芽孢杆菌预培养基中，在35-38℃、200r/min条件下振荡培养16-18小时获得纳豆芽孢杆菌培养菌液；
其中，所述纳豆芽孢杆菌活化培养基包括如下质量浓度的成分：10g/L蛋白胨；2g/L牛肉粉；2.0g/L氯化钠；琼脂18g/L，于121℃灭菌20分钟，冷却后使用；
其中，所述纳豆芽孢杆菌预培养基包括如下质量浓度的成分：10g/L蛋白胨；2g/L牛肉粉；2.0g/L氯化钠；2.0g/L壳聚糖；4g/L合欢皮提取物；5g/L灰树花多糖，所述纳豆芽孢杆菌预培养基为液体培养基，于121℃灭菌20分钟，充分冷却后使用。
（4）产酶固体发酵：将步骤（3）中所述纳豆芽孢杆菌培养菌液均匀的接种在步骤（2）制备的发酵培养基中进行产酶固体发酵，纳豆芽孢杆菌培养菌液的接种比例为发酵培养基体积的6％，产酶固体发酵的温度为36-40℃，所述产酶固体发酵的发酵时间为24h。
（5）老化：将经过步骤（4）固体发酵的纳豆置于4-8℃低温环境下，老化24h获得鲜纳豆；
（6）真空冷冻干燥：采用无菌操作将步骤（5）获得的鲜纳豆放入真空冷冻干燥机内进行冻干处理，粉碎后即可获得纳豆冻干粉；
其中，真空冷冻干燥的条件为-40℃保持2h、0℃保持20h、30℃保持15-18h即可冻干，真空冷冻干燥的总时间为35-40h；
所述步骤（6）中粉碎采用超微粉碎方式处理15min。
对比例1
本对比例提供一种高产溶栓纳豆激酶的纳豆发酵及冻干方法，其与实施例1的区别仅在于不使用壳聚糖、合欢皮提取物、灰树花多糖：所述纳豆芽孢杆菌预培养基包括如下质量浓度的成分：10g/L蛋白胨；2g/L牛肉粉；2.0g/L氯化钠，所述纳豆芽孢杆菌预培养基为液体培养基，于121℃灭菌20分钟，充分冷却后使用；
所述发酵培养基包括如下质量浓度的成分：750g/L预发酵大豆；30g/L蔗糖；2.5g/L七水硫酸镁；0.5g/L氯化钙；1.0g/L磷酸氢二钾；1.0g/L磷酸二氢钾；所述发酵培养基的pH为6.8-7.0；
其余组分、组分含量与实施例1相同。
对比例2
本对比例提供一种高产溶栓纳豆激酶的纳豆发酵及冻干方法，其与实施例1的区别仅在于不使用壳聚糖，具体为：所述纳豆芽孢杆菌预培养基包括如下质量浓度的成分：10g/L蛋白胨；2g/L牛肉粉；2.0g/L氯化钠；4g/L合欢皮提取物；5g/L灰树花多糖，所述纳豆芽孢杆菌预培养基为液体培养基，于121℃灭菌20分钟，充分冷却后使用；
所述发酵培养基包括如下质量浓度的成分：750g/L预发酵大豆；30g/L蔗糖；2.5g/L七水硫酸镁；0.5g/L氯化钙；1.0g/L磷酸氢二钾；1.0g/L磷酸二氢钾；3g/L合欢皮提取物；20g/L灰树花多糖；所述发酵培养基的pH为6.8-7.0；
其余组分、组分含量与实施例1相同。
对比例3
本对比例提供一种高产溶栓纳豆激酶的纳豆发酵及冻干方法，其与实施例1的区别仅在于不使用合欢皮提取物，具体为：所述纳豆芽孢杆菌预培养基包括如下质量浓度的成分：10g/L蛋白胨；2g/L牛肉粉；2.0g/L氯化钠；2.0g/L壳聚糖；5g/L灰树花多糖，所述纳豆芽孢杆菌预培养基为液体培养基，于121℃灭菌20分钟，充分冷却后使用；
所述发酵培养基包括如下质量浓度的成分：750g/L预发酵大豆；30g/L蔗糖；2.5g/L七水硫酸镁；0.5g/L氯化钙；1.0g/L磷酸氢二钾；1.0g/L磷酸二氢钾；20g/L灰树花多糖；10g/L壳聚糖；所述发酵培养基的pH为6.8-7.0；
其余组分、组分含量与实施例1相同。
对比例4
本对比例提供一种高产溶栓纳豆激酶的纳豆发酵及冻干方法，其与实施例1的区别仅在于不使用灰树花多糖：所述纳豆芽孢杆菌预培养基包括如下质量浓度的成分：10g/L蛋白胨；2g/L牛肉粉；2.0g/L氯化钠；2.0g/L壳聚糖；4g/L合欢皮提取物，所述纳豆芽孢杆菌预培养基为液体培养基，于121℃灭菌20分钟，充分冷却后使用；
所述发酵培养基包括如下质量浓度的成分：750g/L预发酵大豆；30g/L蔗糖；2.5g/L七水硫酸镁；0.5g/L氯化钙；1.0g/L磷酸氢二钾；1.0g/L磷酸二氢钾；3g/L合欢皮提取物；10g/L壳聚糖；所述发酵培养基的pH为6.8-7.0；
其余组分、组分含量与实施例1相同。
改良后效果测试分析
（1）本发明制备的纳豆冻干粉的纳豆激酶活力测定
将实施例1、实施例2、实施例3和对比例1、对比例2、对比例3和对比例4刚制得的取纳豆冻干粉样品按质量比1∶6混于生理盐水中，混匀，4℃静置4h，离心后取上清液，得纳豆激酶粗提液，精密量取适量，生理盐水稀释5倍，即得供试品溶液。纳豆激酶总活力测定方法为纤维蛋白平板法，即配置含有凝血酶的纤维蛋白原平板；纳豆激酶粗提液使用10000rpm离心10min后吸取10微升纳豆激酶粗提液，分别点在平板的指定位置；静置观察并在10min时记录光圈直径，重复3次。
实验结果如图1所示，实施例1和实施例2及实施例3中纳豆激酶的活力明显高于对比例1，表明壳聚糖、合欢皮提取物、灰树花多糖的使用可能是提高纳豆芽孢杆菌产生高含量纳豆激酶的关键，同时，相较于对比例2-对比例4，壳聚糖缺失后效果有所下降，而合欢皮提取物、灰树花多糖的缺失导致了纳豆激酶活力的显著下降，表明壳聚糖、合欢皮提取物、灰树花多糖之间可能存在一定的协同作用关系，同时影响了纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶的性能。
（2）纳豆枯草芽孢杆菌关键基因的表达激活分析
根据Genbank数据库中纳豆枯草芽孢杆菌来源的纳豆激酶设计扩增引物NK-F:gcgcaatctgttccttatggca和NK-R:ttattgtgcagctgcttgtacgt，用于在发酵过程中关键基因的表达变化，分别取实施例1（A组）、实施例2（B组）、实施例3（C组）、对比例1（D组）、对比例2（E组）、对比例3（F组）和对比例4（G组）经产酶固体发酵12小时后收集菌丝发酵物，使用TRIzol试剂（购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司）提取菌丝发酵物细胞的总RNA样品，使用逆转录试剂盒（购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司）将mRNA逆转录为cDNA，使用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒（购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司）进行RT-qPCR分析，PCR循环如下：95℃预处理5min；93℃，30s，65℃，30s，进行40个循环；93℃，30s；67℃，1min；95℃，30s，进行1个循环；75℃延伸5min。
结果如图2所示，实施例1-实施例3均显著可以调高纳豆激酶编码基因的表达，而对比例明显表达量提升幅度小，表明壳聚糖、合欢皮提取物、灰树花多糖是刺激纳豆激酶表达的原因，而相较于对比例2-对比例4，纳豆激酶表达均处于较低激活水平。
（3）纳豆枯草芽孢杆菌在发酵中的生长菌量分析
取实施例1、实施例2、实施例3和对比例1、对比例2、对比例3和对比例4在进行预培养2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、24小时、28小时纳豆芽孢杆菌培养菌液，分别用无菌水稀释5倍，以稀释相同倍数的空白培养基为对照测其吸光度值OD660，测量吸光度A660，如图3、图4、图5、图6、图7、图8和图9所示，实施例1、实施例2、实施例3和对比例1、对比例2、对比例3和对比例4在预培养过程中均可以得到快速的繁殖，但是实施例1、实施例2和实施例3在长时间培养24小时候表现为可以持续的生长（即死亡慢），而对比例1-对比例3均存在菌量下降的现象，此外，实施例1、实施例2和实施例3具有快速提高纳豆枯草芽孢杆菌的功效，综上，本发明实施例1-实施例3制备的纳豆枯草芽孢杆菌具有快速繁殖及保持生长的性能，从而稳定地提高纳豆激酶的产量。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的应用并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种高产溶栓纳豆激酶的纳豆发酵及冻干方法，其特征在于：所述纳豆发酵及冻干方法包括如下步骤：
（1）大豆预处理：选择颗粒饱满、表皮完整、无霉变或虫蛀的大豆，清洗3-4次，浸泡12-24小时，沥干后得到预发酵大豆；
（2）发酵培养基的制备：将预发酵大豆、蔗糖、七水硫酸镁、氯化钙、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、合欢皮提取物、灰树花多糖和壳聚糖混合后在蒸汽灭菌锅内蒸煮30-40分钟进行灭菌，冷却后备用；
（3）纳豆芽孢杆菌活化及预培养：所述纳豆芽孢杆菌活化为将纳豆枯草杆菌在无菌环境中用接种环采用“Z”字划线接种到纳豆芽孢杆菌活化培养基上，在35-38℃培养箱中培养24-30小时后得到活化的纳豆芽孢杆菌；所述预培养为将所述活化的纳豆芽孢杆菌在无菌环境下接种到纳豆芽孢杆菌预培养基中，在35-38℃、200r/min条件下振荡培养16-18小时获得纳豆芽孢杆菌培养菌液；
（4）产酶固体发酵：将步骤（3）中所述纳豆芽孢杆菌培养菌液接种在步骤（2）制备的发酵培养基中进行产酶固体发酵；
（5）老化：将经过步骤（4）固体发酵的纳豆置于低温环境下，老化24h获得鲜纳豆；
（6）真空冷冻干燥：采用无菌操作将步骤（5）获得的鲜纳豆放入真空冷冻干燥机内进行冻干处理，粉碎后即可获得纳豆冻干粉。
2.根据权利要求1所述的一种高产溶栓纳豆激酶的纳豆发酵及冻干方法，其特征在于：所述发酵培养基包括如下质量浓度的成分：500-860g/L预发酵大豆；30-45g/L蔗糖；2.5-4.0g/L七水硫酸镁；0.1-0.5g/L氯化钙；0.5-1.0g/L磷酸氢二钾；0.5-1.0g/L磷酸二氢钾；1-3g/L合欢皮提取物；15-25g/L灰树花多糖；8-10g/L壳聚糖。
3.根据权利要求2所述的一种高产溶栓纳豆激酶的纳豆发酵及冻干方法，其特征在于：所述发酵培养基的pH为6.8-7.0。
4.根据权利要求3所述的一种高产溶栓纳豆激酶的纳豆发酵及冻干方法，其特征在于：所述纳豆芽孢杆菌活化培养基包括如下质量浓度的成分：10g/L蛋白胨；2g/L牛肉粉；2.0g/L氯化钠；琼脂18g/L，于121℃灭菌20分钟，冷却后使用。
5.根据权利要求4所述的一种高产溶栓纳豆激酶的纳豆发酵及冻干方法，其特征在于：所述纳豆芽孢杆菌预培养基包括如下质量浓度的成分：8-10g/L蛋白胨；2-3g/L牛肉粉；2.0-2.5g/L氯化钠；2.0-2.5g/L壳聚糖；3-5g/L合欢皮提取物；4-5g/L灰树花多糖，所述纳豆芽孢杆菌预培养基为液体培养基，于121℃灭菌20分钟，充分冷却后使用。
6.根据权利要求5所述的一种高产溶栓纳豆激酶的纳豆发酵及冻干方法，其特征在于：所述步骤（4）中纳豆芽孢杆菌培养菌液的接种比例为发酵培养基体积的3.5-6％。
7.根据权利要求6所述的一种高产溶栓纳豆激酶的纳豆发酵及冻干方法，其特征在于：所述步骤（4）中产酶固体发酵的温度为36-40℃，所述产酶固体发酵的发酵时间为24-30h。
8.根据权利要求7所述的一种高产溶栓纳豆激酶的纳豆发酵及冻干方法，其特征在于：所述步骤（5）中低温环境的温度为4-8℃。
9.根据权利要求8所述的一种高产溶栓纳豆激酶的纳豆发酵及冻干方法，其特征在于：所述步骤（6）中真空冷冻干燥的条件为-40℃保持2h、0℃保持20h、30℃保持15-18h即可冻干，真空冷冻干燥的总时间为35-40h。
10.根据权利要求9所述的一种高产溶栓纳豆激酶的纳豆发酵及冻干方法，其特征在于：所述步骤（6）中粉碎采用粗粉碎处理5min、过80目筛或采用超微粉碎方式处理10-30min。
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