CN111088196A - 用于制备高活性纳豆激酶的菌株sws-001及其应用 - Google Patents

用于制备高活性纳豆激酶的菌株sws-001及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于制备高活性纳豆激酶的菌株SWS‑001及其应用，菌株的保藏号为CGMCC NO：17226。利用上述微生物菌株SWS‑001对纳豆进行浅盘固体发酵：将装好盘的大豆装入发酵箱，120±5℃饱和蒸汽灭菌；灭完菌后待物料温度降到50±5℃时开始接种纳豆芽孢杆菌种液，接种完毕后开始纳豆发酵，温度为36±2℃，湿度为85‑95%，发酵时间为24‑26小时；能够制备具有抗心脑血管疾病活性的生物制品。

Description

用于制备高活性纳豆激酶的菌株SWS-001及其应用
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，尤其是一种适用于生产纳豆的微生物菌株及其应用。
背景技术
随着人们饮食习惯的改变和环境污染的影响，心脑血管病已经跃居人类死亡疾病的前列，严重威胁人类的健康。栓塞性血管阻塞在冠心病、中风等临床重病的发病机制中起着主要作用，多数大幅度降低患者的生活质量，严重时会造成患者死亡或致残，一般临床治疗血栓主要依靠溶栓剂如尿激酶(UK)、组织型纤维酶原激活剂(t-PA)等，多采用静脉输液方式，具有价格昂贵、出血倾向或半衰期短的缺点。
研究发现，纳豆含有可以溶解血液中纤维蛋白的纤溶酶-纳豆激酶，同时由于纳豆来源于传统食品，安全无副作用，具有口服有效、半衰期长等优点。
目前，通过生物发酵工程制备具有良好生物活性的纳豆产品，成为本领域的研究热点，但是能标准化、批次生产纳豆产品也是相关企业的难点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种生产纳豆的高效发酵菌株，能够获得具有较高纳豆激酶生物活性的纳豆发酵制品。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
用于制备高活性纳豆激酶的菌株SWS-001，其名称为Bacillus natto.SWS-001，属于纳豆芽孢杆菌Bacillus natto，保藏日期2019年1月23日，保藏号CGMCC NO：17226；其主要生物学特征包括：革兰氏染色阳性G+,细胞为杆状，芽孢椭圆形或柱状，革兰氏染色阳性，接触酶阳性，V.P.反应阳性，硝酸盐还原阳性，D-木糖发酵阳性，D-葡萄糖发酵阳性，明胶液化阳性，淀粉水解阳性，菌落形态乳白不透明圆形；发酵纳豆产生具有高活性纳豆激酶的生物制品。
利用所述的微生物菌株SWS-001对纳豆进行浅盘固体发酵，制备具有抗心脑血管疾病的纳豆激酶活性生物制品。
作为本发明的一种优选技术方案，该方法包括如下步骤：
C、纳豆浅盘固体发酵：
C-3、大豆灭菌及发酵：将装好盘的大豆装入发酵箱，120±5℃饱和蒸汽灭菌；灭完菌后待物料温度降到50±5℃时，接入纳豆芽孢杆菌种子液，然后开始纳豆发酵，温度为30±2℃，湿度为75-78％，发酵时间为30小时，30小时后从视镜观察豆子表面有大量白色拉丝状物质即为发酵终点。
C-1、大豆预处理：将大豆用清水洗涤1-2次，大豆：水＝1：0.8w/V，再用清水浸泡，大豆：水＝1：1.8w/V，在室温浸泡24h，大豆充分膨胀；
C-2、湿大豆装盘：将浸泡好的大豆沥去水份，平铺在带小孔的发酵托盘上，托盘上铺一层纱布以保持水份。
作为本发明的一种优选技术方案，在步骤C之前还包括如下步骤：
A、菌种斜面制备及菌种活化：
A-1、培养基制备：按如下配方制备PB培养基：牛肉膏0.5％，酵母粉1.0％，磷酸氢二钠0.5％，磷酸二氢钠0.5％，琼脂2％；将斜面培养基加热溶化后调pH到7.0－7.8，然后分装茄子瓶或试管，放入灭菌锅内湿热灭菌，冷却后制成斜面备用；
A-2、菌种活化与扩大培养：用接种环在无菌条件下从原菌种斜面上挑取菌苔，于试管斜面或茄子瓶斜面内进行划线，然后置30±1℃恒温箱内培养24小时，存放备用。
作为本发明的一种优选技术方案，在步骤A之后还包括如下步骤：
B、种子液培养：
B-1、种液培养基的配制：牛肉膏0.5％，酵母粉1.0％，磷酸氢二钠0.5％，磷酸二氢钠0.5％，调pH到7.0－7.8，灭菌备用；
B-2、接种及培养：取茄子瓶斜面或试管斜面，用接种环接菌苔于种子液内，恒温摇床内振荡培养，30±3℃、250rmp，培养6小时；种子液镜检合格后，4℃保存备用。
作为本发明的一种优选技术方案，在步骤C之后还包括如下步骤：
D、纳豆冻干粉的制备：
D-1、鲜纳豆的冷冻干燥：将发酵好的纳豆无菌操作放入冻干机内进行冻干，工艺程序为：-40℃---5小时，0℃---20小时，30℃---16-18小时；到终点时物料温度和搁板温度相差小于等于5℃；
D-2、纳豆粉碎及过筛：将冻干后纳豆放入带冷却装置的粉碎机进行粉碎，过筛得纳豆冻干粉。
作为本发明的一种优选技术方案，该方法包括如下具体步骤：
A、菌种斜面制备及菌种活化：
A-1、培养基制备：按如下重量份数比配方制备PB培养基：牛肉膏0.5％，酵母粉1.0％，磷酸氢二钠0.5％，磷酸二氢钠0.5％，琼脂2％；将斜面培养基加热溶化后调pH到7.0－7.8，然后分装茄子瓶或试管，放入灭菌锅内湿热灭菌，冷却后制成斜面备用；
A-2、菌种活化与扩大培养：用接种环在无菌条件下从原菌种斜面上挑取菌苔，于试管斜面或茄子瓶斜面内进行划线，然后置30±1℃恒温箱内培养24小时，存放备用。
B、种子液培养：
B-1、种液培养基的配制：牛肉膏0.5％，酵母粉1.0％，磷酸氢二钠0.5％，磷酸二氢钠0.5％，调pH到7.0－7.8，灭菌备用；
B-2、接种及培养：取茄子瓶斜面或试管斜面，用接种环接菌苔于种子液内，恒温摇床内振荡培养，30±3℃、250rmp，培养6小时；种子液镜检合格后，4℃保存备用。
C、纳豆浅盘固体发酵：
C-3、大豆灭菌及发酵：将装好盘的大豆装入发酵箱，120±5℃饱和蒸汽灭菌；灭完菌后待物料温度降到50±5℃时，接入纳豆芽孢杆菌种子液，然后开始纳豆发酵，温度为30±2℃，湿度为75-78％，发酵时间为30小时，30小时后从视镜观察豆子表面有大量白色拉丝状物质即为发酵终点。
4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在步骤C-3之前还包括如下步骤：
C-1、大豆预处理：将大豆用清水洗涤1-2次，大豆：水＝1：0.8w/V，再用清水浸泡，大豆：水＝1：1.8w/V，在室温浸泡24h，大豆充分膨胀；
C-2、湿大豆装盘：将浸泡好的大豆沥去水份，平铺在带小孔的发酵托盘上，托盘上铺一层纱布以保持水份。
D、纳豆冻干粉的制备：
D-1、鲜纳豆的冷冻干燥：将发酵好的纳豆无菌操作放入冻干机内进行冻干，工艺程序为：-40℃---5小时，0℃---20小时，30℃---16-18小时；到终点时物料温度和搁板温度相差小于等于5℃；
D-2、纳豆粉碎及过筛：将冻干后纳豆放入带冷却装置的粉碎机进行粉碎，过筛得纳豆冻干粉。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤D之后对所得冻干粉产品进行质量检测，检测指标至少包含纳豆激酶酶活性、大豆异黄酮含量、多聚谷氨酸含量、纳豆芽孢杆菌活菌数含量。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明利用纳豆芽孢杆菌菌株SWS-001(保藏号CGMCC NO：17226)开发了标准化的纳豆浅盘固体发酵工艺，试验生产工艺流程包括：原菌种活化、种液培养、浅盘固体发酵培养、冷冻干燥、粉碎、质量检测。
依据本发明的生产工艺制备的纳豆冻干粉具有十分优秀的生物活性指标：
①纳豆激酶酶活≥15000FU/g；
②大豆异黄酮≥120mg/100g；
③纳豆芽孢杆菌数≥4×109cfu/g；
④多聚谷氨酸含量≥2％；
⑤纳豆和纳豆冻干粉卫生标准符合《发酵豆制品卫生标准GB2712-2003》。
详细试验研究数据及生产数据参见下文的实施例。
保藏说明
保藏菌种归类于枯草芽孢杆菌纳豆菌亚种，拉丁名为Bacillus natto，命名为Bacillus natto.SWS-001，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京，保藏日期2019年1月23日，保藏号CGMCC NO：17226。
具体实施方式
以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。
在以下实施例的描述中，为了说明而不是为了限定，提出了诸如特定系统结构、技术之类的具体细节，以便透彻理解本申请实施例。然而，本领域的技术人员应当清楚，在没有这些具体细节的其它实施例中也可以实现本申请。在其它情况中，省略对众所周知的系统、装置、电路以及方法的详细说明，以免不必要的细节妨碍本申请的描述。
应当理解，当在本申请说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。
还应当理解，在本申请说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。
如在本申请说明书和所附权利要求书中所使用的那样，术语“如果”可以依据上下文被解释为“当...时”或“一旦”或“响应于确定”或“响应于检测到”。类似地，短语“如果确定”或“如果检测到[所描述条件或事件]”可以依据上下文被解释为意指“一旦确定”或“响应于确定”或“一旦检测到[所描述条件或事件]”或“响应于检测到[所描述条件或事件]”。
另外，在本申请说明书和所附权利要求书的描述中，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本申请说明书中描述的参考“一个实施例”或“一些实施例”等意味着在本申请的一个或多个实施例中包括结合该实施例描述的特定特征、结构或特点。由此，在本说明书中的不同之处出现的语句“在一个实施例中”、“在一些实施例中”、“在其他一些实施例中”、“在另外一些实施例中”等不是必然都参考相同的实施例，而是意味着“一个或多个但不是所有的实施例”，除非是以其他方式另外特别强调。术语“包括”、“包含”、“具有”及它们的变形都意味着“包括但不限于”，除非是以其他方式另外特别强调。
本发明的菌株Bacillus natto.SWS-001从纳豆中采集并经筛选获取，筛选方法为单菌株蛋白纤维平板透明圈法。
实施例1、菌种斜面生产操作
a、仪器设备和试剂
无菌室及超净工作台、灭菌锅、试管、茄子瓶、冰箱、恒温培养箱、显微镜、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、牛肉膏、蛋白胨及琼脂等。
b、培养基制备
按如下配方制备培养基(PB培养基)：按如下配方制备PB培养基：牛肉膏0.5％，酵母粉1.0％，磷酸氢二钠0.5％，磷酸二氢钠0.5％，琼脂2％；将斜面培养基加热溶化后调pH到7.0－7.8，然后分装茄子瓶或试管，放入灭菌锅内湿热灭菌，冷却后制成斜面备用；
c、菌种活化与扩大培养
用接种环在无菌条件下从原菌种斜面上挑取菌苔，于试管斜面或茄子瓶斜面内进行划线，然后置30±1℃恒温箱内培养24小时，存放备用。
实施例2、种子液培养方法
a、仪器设备和试剂
无菌室及超净工作台、灭菌锅、冰箱、恒温培养箱、显微镜、氢氧化钠、盐酸等。
b、种子液培养基的配制
按如下方法配制种液培养基：牛肉膏0.5％，酵母粉1.0％，磷酸氢二钠0.5％，磷酸二氢钠0.5％，调pH到7.0－7.8，灭菌备用；
c、接种及培养
取茄子瓶斜面或试管斜面，用接种环接菌苔于种子液内，恒温摇床内振荡培养，30±3℃、250rmp，培养6小时；种子液镜检合格后，4℃保存备用。
所有种子液合并，装入无菌不锈钢接种壶内冰箱保存备用，同时用划线法作无菌检查，种子液保存不得多于三天。
实施例3、纳豆浅盘固体发酵
a、大豆浸泡：将大豆用清水洗涤1-2次，大豆：水＝1：0.8(m/V)，再用清水浸泡，大豆：水＝1：1.8(m/V)，让水没过大豆表面1/3。根据现有固体发酵箱大小及湿纳豆的含水量计算，每批称6.8kg干大豆，加饮用水约15L，浸泡后可得16-16.5kg湿大豆；在室温浸泡24h，室内温度高时时间稍短，大豆充分膨胀即可。
b、湿大豆装盘
将浸泡好的大豆沥去水份，平铺在带小孔的发酵托盘上，托盘上铺一层纱布以保持水份。每盘装4kg，然后用不锈钢小铲铺平，每批装4托盘。
c、大豆灭菌及发酵
将装好盘的大豆装入发酵箱，120±5℃饱和蒸汽灭菌；灭完菌后待物料温度降到50±5℃时，接入纳豆芽孢杆菌种子液，然后开始纳豆发酵，温度为30±2℃，湿度为75-78％，发酵时间为30小时，30小时后从视镜观察豆子表面有大量白色拉丝状物质即为发酵终点。
实施例4、纳豆冷冻干燥、粉碎及过筛
将发酵好的纳豆无菌操作放入冻干机内进行冻干，工艺程序为：-40℃---5小时，0℃---20小时，30℃---16-18小时；到终点时物料温度和搁板温度相差小于等于5℃；将冻干后纳豆放入带冷却装置的粉碎机进行粉碎，过200目筛得纳豆冻干粉。
实施例5、纳豆固体发酵试验结果
如下为实施例1-5固体发酵试验的结果数据。
5.1纳豆固体发酵试验结果
纳豆冻干粉各主要指标
Figure BDA0002373075730000091
5.2纳豆冻干粉卫生指标检测结果
重金属指标由本单位研发部分析室测定，微生物指标及黄曲霉毒素B1委托河北省疾控中心检测。
Figure BDA0002373075730000092
Figure BDA0002373075730000101
以上所述实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.用于制备高活性纳豆激酶的菌株SWS-001，其名称为Bacillus natto.SWS-001，属于纳豆芽孢杆菌Bacillus natto，保藏日期2019年1月23日， 保藏号CGMCC NO：17226；其主要生物学特征包括：革兰氏染色阳性G+,细胞为杆状，芽孢椭圆形或柱状，革兰氏染色阳性，接触酶阳性，V.P.反应阳性，硝酸盐还原阳性，D-木糖发酵阳性，D-葡萄糖发酵阳性，明胶液化阳性，淀粉水解阳性，菌落形态乳白不透明圆形；发酵过程产生具有高活性纳豆激酶的生物制品。
2.利用权利要求1的菌株制备具有高活性纳豆激酶生物制品的方法，其特征在于：利用所述的微生物菌株SWS-001对大豆原料进行浅盘固体发酵，制备具有抗心脑血管疾病功能的生物制品。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
C、纳豆浅盘固体发酵：
C-3、大豆灭菌及发酵：将装好盘的大豆装入发酵箱，120±5℃饱和蒸汽灭菌；灭完菌后待物料温度降到50±5℃时，接入纳豆芽孢杆菌种子液，然后开始纳豆发酵，温度为30±2℃，湿度为75-78%，发酵时间为30小时，30小时后从视镜观察豆子表面有大量白色拉丝状物质即为发酵终点。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在步骤C-3之前还包括如下步骤：
C-1、大豆预处理：将大豆用清水洗涤1-2次，大豆：水=1：0.8 w/V ，再用清水浸泡，大豆：水=1：1.8 w/V，在室温浸泡24h，大豆充分膨胀；
C-2、湿大豆装盘：将浸泡好的大豆沥去水份，平铺在带小孔的发酵托盘上，托盘上铺一层纱布以保持水份。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：在步骤C之前还包括如下步骤：
A、菌种斜面制备及菌种活化：
A-1、培养基制备：按如下重量份数比配方制备PB培养基：牛肉膏0.5%，酵母粉1.0%，磷酸氢二钠0.5%，磷酸二氢钠0.5%，琼脂2%；将斜面培养基加热溶化后调pH到7.0－7.8，然后分装茄子瓶或试管，放入灭菌锅内湿热灭菌，冷却后制成斜面备用；
A-2、菌种活化与扩大培养：用接种环在无菌条件下从原菌种斜面上挑取菌苔，于试管斜面或茄子瓶斜面内进行划线，然后置30±1℃恒温箱内培养24小时，存放备用。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：在步骤A之后还包括如下步骤：
B、种子液培养：
B-1、种液培养基的配制：牛肉膏0.5%w/w，酵母粉1.0%w/w，磷酸氢二钠0.5%w/w，磷酸二氢钠0.5%w/w，调pH到7.0－7.8，灭菌备用；
B-2、接种及培养：取茄子瓶斜面或试管斜面，用接种环接菌苔于种子液内，恒温摇床内振荡培养，30±3℃、250 rmp，培养6小时；种子液镜检合格后，4℃保存备用。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：在步骤C之后还包括如下步骤：
D、纳豆冻干粉的制备：
D-1、鲜纳豆的冷冻干燥：将发酵好的纳豆无菌操作放入冻干机内进行冻干，工艺程序为：-40℃---5小时，0℃---20小时，30℃---16-18小时；到终点时物料温度和搁板温度相差小于等于5℃；
D-2、纳豆粉碎及过筛：将冻干后纳豆放入带冷却装置的粉碎机进行粉碎，过筛得纳豆冻干粉。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
A、菌种斜面制备及菌种活化：
A-1、培养基制备：按如下重量份数比配方制备PB培养基：牛肉膏0.5%，酵母粉1.0%，磷酸氢二钠0.5%，磷酸二氢钠0.5%，琼脂2%；将斜面培养基加热溶化后调pH到7.0－7.2，然后分装茄子瓶或试管，放入灭菌锅内湿热灭菌，冷却后制成斜面备用；
A-2、菌种活化与扩大培养：用接种环在无菌条件下从原菌种斜面上挑取菌苔，于试管斜面或茄子瓶斜面内进行划线，然后置30±1℃恒温箱内培养24小时，存放备用；
B、种子液培养：取茄子瓶斜面或试管斜面，用接种环接菌苔于种子液内，恒温摇床内振荡培养，30±3℃、250 rmp，培养6小时；种子液镜检合格后，4℃保存备用；
B-1、种液培养基的配制：牛肉膏0.5%w/w，酵母粉1.0%w/w，磷酸氢二钠0.5%w/w，磷酸二氢钠0.5%w/w，调pH到7.0－7.2，灭菌备用；
B-2、接种及培养：取茄子瓶斜面或试管斜面，用接种环接菌苔于种子液内，恒温摇床内振荡培养，30±3℃、250 rmp，培养6小时；种子液镜检合格后，4℃保存备用；
C、纳豆浅盘固体发酵：
C-1、大豆预处理：将大豆用清水洗涤1-2次，大豆：水=1：0.8 w/V ，再用清水浸泡，大豆：水=1：1.8 w/V，在室温浸泡24h，大豆充分膨胀；
C-2、湿大豆装盘：将浸泡好的大豆沥去水份，平铺在带小孔的发酵托盘上，托盘上铺一层纱布以保持水份；
C-3、大豆灭菌及发酵：将装好盘的大豆装入发酵箱，120±5℃饱和蒸汽灭菌；灭完菌后待物料温度降到50±5℃时，接入纳豆芽孢杆菌种子液，然后开始纳豆发酵，温度为30±2℃，湿度为75-78%，发酵时间为30小时，30小时后从视镜观察豆子表面有大量白色拉丝状物质即为发酵终点；
D、纳豆冻干粉的制备：
D-1、鲜纳豆的冷冻干燥：将发酵好的纳豆无菌操作放入冻干机内进行冻干，工艺程序为：-40℃---5小时，0℃---20小时，30℃---16-18小时；到终点时物料温度和搁板温度相差小于等于5℃；
D-2、纳豆粉碎及过筛：将冻干后纳豆放入带冷却装置的粉碎机进行粉碎，过筛得纳豆冻干粉。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于：步骤D之后对所得冻干粉产品进行质量检测，检测指标至少包含纳豆激酶酶活性、大豆异黄酮含量、多聚谷氨酸含量、纳豆芽孢杆菌活菌数含量。
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