CN113208057B - 一种含高活性纳豆激酶的纳豆及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纳豆发酵技术领域，具体公开一种含高活性纳豆激酶的纳豆及其制备方法。本发明通过将含有乳糖、蔗糖、L‑谷氨酸和L‑丝氨酸的纳豆菌稀释液接种至蒸煮后的黄豆表面，然后将接种纳豆菌稀释液的黄豆先于36‑38℃、湿度85‑95％的条件下发酵8‑12h，然后于44‑46℃、湿度70‑80％条件下发酵5‑10h的工艺，显著提高了纳豆中纳豆激酶的活性，纳豆激酶活性可达3.2×105U/g，且制备的纳豆的菌丝丰富，纳豆表面覆盖一层均匀的菌膜，菌丝粘滞性好，且韧性好不易断，无任何氨味及苦涩味，咀嚼时有柔软、溜滑的口感，有效提高了纳豆产品的质量，市场前景广阔。

Description

一种含高活性纳豆激酶的纳豆及其制备方法
技术领域
本发明涉及纳豆发酵技术领域，尤其涉及一种含高活性纳豆激酶的纳豆及其制备方法。
背景技术
纳豆是以黄豆为主要原料，经枯草芽胞杆菌发酵制成的一种具有独特风味的发酵豆制品，至今已有2000多年的食用历史。纳豆中富含纳豆激酶、大豆异黄酮、皂苷、维生素B2、维生素K2等功能因子，因此，具有多种保健功效。其中，纳豆激酶是纳豆中最重要的一种活性成分，具有较强的溶解血栓的功效，纳豆激酶的体内外溶栓性质已经通过实验得到明确验证，其在体内的作用时间可达4-8小时(一般溶解血栓的药物的作用时间仅有4-20分钟)，具有持续溶解血栓的优点；同时，纳豆激酶具有分子量小、容易被人体吸收利用以及食用安全的优点，因此，近年来成为新一代溶栓药物的研究热点。
目前，传统的纳豆固体发酵法生产的纳豆激酶的活性较低，一般只有5-15万U/g，远低于液体发酵法生产的纳豆激酶的活力。但是，液体发酵法的发酵设备复杂，且发酵后还需要繁琐的提纯工序，生产效率低、生产成本较高。因此，研发一种生产成本低、生产效率高且纳豆激酶活力高的固态发酵制备纳豆激酶的方法，对于扩大纳豆激酶的应用、增加企业的竞争力具有十分重要的意义。
发明内容
针对现有固态发酵法制备的纳豆激酶的酶活性较低的问题，本发明提供一种含高活性纳豆激酶的纳豆及其制备方法。本发明通过将含有乳糖、蔗糖、L-谷氨酸和L-丝氨酸的纳豆菌稀释液接种至黄豆表面，通过在特定温度下进行二段式发酵，显著提高了纳豆中纳豆激酶的活性。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
一种含高活性纳豆激酶的纳豆的制备方法，包括如下步骤：
将原料黄豆清洗后加水浸泡，蒸煮，接种纳豆菌稀释液，二段式发酵，后熟，得含高活性纳豆激酶的纳豆；
其中，所述纳豆菌稀释液包含以下组分：乳糖4-6wt％，蔗糖2-4wt％，L-谷氨酸4-6wt％和L-丝氨酸1-2wt％；
所述二段式发酵具体为：将接种纳豆稀释液的黄豆先于36-38℃、湿度85-95％的条件下发酵8-12h，然后于44-46℃、湿度70-80％条件下继续发酵5-10h。
本发明中所述纳豆菌为纳豆芽孢杆菌。
相对于现有技术，本发明提供的含高活性纳豆激酶的纳豆的制备方法，通过向纳豆菌稀释液中加入特定含量的乳糖、蔗糖、L-谷氨酸和L-丝氨酸，不但可促进纳豆菌的生长及其蛋白酶的合成，满足其生长代谢需求，更重要的是还能促进纳豆菌产生和分泌纳豆激酶，同时，还有利于提高纳豆激酶的活性；进一步采用二阶段变温发酵，充分激活纳豆菌的生长代谢活性，进一步提高纳豆激酶的产生和分泌量，并且在发酵过程中，通过温度的控制和纳豆稀释液中加入的L-谷氨酸，可充分保持纳豆激酶的高活性，避免发酵过程纳豆激酶活性降低，从而最大限度的提升了纳豆产品中纳豆激酶的活性；除此之外，通过二阶段式发酵温度和湿度的精确控制，还有利于改善纳豆的口感和色泽，使纳豆菌丝的韧性和粘滞性达到最佳，提高纳豆产品的质量。
优选的，所述原料黄豆的中粒径为4-6mm，吸收率为120-140％，死豆率≤0.5％，蛋白质含量35-40％。
本发明中优选粒豆均匀、光泽鲜亮的东北小粒黄豆作为发酵原料，并控制所选黄豆的中粒径为4-6mm，吸收率为120-140％，死豆率≤0.5％，蛋白质含量35-40％。
优选的，所述浸泡的料水比为1:3-4，浸泡温度为12-20℃，浸泡时间为16-22h。
优选的浸渍温度和浸渍时间，可使水分充分被吸收至黄豆中，软化组织，有利于后续对黄豆进行蒸煮，缩短蒸煮时间；同时，还有利于抑制黄豆表面杂菌的繁殖，保证纳豆菌在黄豆表面的最佳生长，从而使纳豆菌充分地发酵黄豆，提高原料的利用率。
优选的，所述蒸煮的温度为116-121℃，蒸煮时间为30-40min。
蒸煮后黄豆的硬度标准为：按压重量值为200-300g/粒。测试时采用在量程3kg以内的电子称上，用手指缓慢按压豆粒至崩溃，记录此时按压的重量值，取20粒平均值。
优选的蒸煮时间和温度，可充分软化黄豆的组织，从而有利于纳豆菌更充分利用黄豆中的营养成分，进而有利于产生和分泌更多的纳豆激酶。
优选的，所述纳豆菌稀释液中纳豆菌的活菌数为1×106-2×106个/mL。
优选的，接种纳豆菌稀释液时，黄豆的温度为70-90℃，活菌接种量为103-105个/g。
优选的，所述纳豆菌稀释液的制备方法包括如下步骤：将纳豆菌活化后，进行固体培养，得孢子；将所述孢子制成菌悬液，向所述菌悬液中加入稀释剂，得纳豆菌稀释液。
优选的，所述菌悬液中的活菌数为1×109-2×109个/mL。
优选的，所述稀释剂包括如下质量百分含量的原料组分：乳糖4-6％，蔗糖2-4％，L-谷氨酸4-6％和L-丝氨酸1-2％，余量去离子水。
可选的，在接种纳豆菌稀释液后还包括充填步骤：将接种好的黄豆充填至不锈钢托盘中，并在上面覆盖一层聚乙烯透气膜，黄豆充填厚度为1.5-2.5cm，充填后黄豆的温度为50-60℃，聚乙烯透气膜的厚度为55μm，通气孔直径1.5mm，开孔率9个/100cm2。
优选的，后熟阶段的温度为2-4℃，保温时间为24-48h。
可选的，本发明中发酵室的硬件配置为：装填率40-60％(面积占比)，制冷量1000-3000W/100kg，制热量500-1000W/100kg。并采用自动化控制发酵室的温度和湿度，温度控制精度±1℃，湿度控制精度±5％RH；升温速率2-5℃/60min，降温速率5-10℃/60min。
本发明还提供了一种含高活性纳豆激酶的纳豆，由上述任一项所述的含高活性纳豆激酶的纳豆的制备方法制备得到。
本发明通过固体发酵法制备得到的纳豆有纳豆独特的鲜香味，无任何氨臭味，颜色为浅茶色，拉丝多且有力，且纳豆激酶活性高，有利于为后续纳豆激酶制品的研发提供高质量纳豆原料，同时，本发明中纳豆的制备工艺简单，成本低，经济效益明显，具有良好的市场前景，可显著增强企业的市场竞争力。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
纳豆芽孢杆菌孢子菌悬液的制备：
1.1菌株初筛
大豆蛋白胨培养基：将大豆蛋白胨5.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，加入1000mL去离子水中，充分溶解后，121℃灭菌15min。
从纳豆芽孢杆菌种保藏斜面挑取一环菌种，在大豆蛋白胨培养基的平板上划线分离，37℃培养16h。根据纳豆芽孢杆菌的菌落形态，挑选菌落生长正常，直径大，镜检菌体好的菌株作为扩大培养菌株。
1.2固体产孢培养基扩大培养
将划线分离得到的扩大培养菌株划线接种至固体产孢培养基中，在37℃生化培养箱中培养2-4天后镜检观察，当孢子率大于95％时收集，将菌苔刮入盛有25mL无菌水的50mL离心管中，经10000rpm离心10min后，沉淀孢子用无菌去离子水洗涤两次，待用。
固体产孢培养基(SA)配制：
大豆蛋白胨5g，酵母浸膏2.5g，葡萄糖1.0g，琼脂20.0g，MnCl2·4H2O 0.025g，MgSO4·7H2O 0.51g，FeSO4·7H2O 0.055g，CaCl2·2H2O 0.015g，加入1000mL去离子水中，充分溶解后，121℃灭菌15min。
1.3稀释
将上述制备的孢子沉淀加入无菌水中，制成活菌数为1×109-2×109个/mL的孢子菌悬液，经80℃、20min灭活菌丝体和杂菌后，进行分装，每瓶250mL，保藏于0-4℃，保质期2年。
实施例2
本实施例提供一种含高活性纳豆激酶的纳豆的制备方法，包括如下步骤：
1.原料筛选
选用吉育YJ105号极小粒黄豆，黄豆颗粒匀整，淡黄色，光泽鲜亮，中粒径为4.2mm，吸水率130％，死豆率0.1％，蛋白质含量38％。
2.黄豆浸泡
称取上述筛选的吉育YJ105号极小粒黄豆150kg，清洗干净，倒入浸泡槽中，加入500L清水进行浸泡，浸泡水温为18℃，浸泡时间为20h。
3.黄豆蒸煮
将浸泡后的黄豆倒入蒸煮锅中，利用清洁蒸汽对其进行蒸煮，蒸煮温度为120℃，蒸煮时间为35min。
蒸煮后，黄豆呈赭黄色，硬度为250-300g/粒(测试方法为：在量程3kg以内的电子秤上，用手指缓慢按压豆粒至崩溃，记录此时的按压重量值，取20粒平均值)。
4.纳豆菌稀释液制备
取7500mL加热至100℃的去离子水，自然冷却至40-60℃，加入乳糖375g，蔗糖225g，L-谷氨酸375g和L-丝氨酸113g，混合均匀，得稀释液；
量取8mL实施例1制备的纳豆芽孢杆菌孢子菌悬液，加入上述7500mL稀释液，得纳豆菌稀释液。
5.接种
将上述纳豆菌稀释液均匀喷洒至蒸煮后的黄豆表面，接种时，蒸煮黄豆的温度为85℃，活菌接种量为103-105个/g。
6.充填
将接种好的黄豆充填至不锈钢托盘中，并在上面覆盖一层聚乙烯透气膜，黄豆充填厚度为1.5cm，充填后黄豆的温度为55℃，聚乙烯透气膜的厚度为55μm，通气孔直径1.5mm，开孔率9个/100cm2。
7.二段式发酵
将充填好的黄豆于温度37℃，湿度90％，发酵10h，然后于温度45℃，湿度75％，发酵8h；
8.后熟
发酵后置于4℃中保存24h后熟，后熟后呈现纳豆特有的粘滞感、拉丝性、香气和口味。
实施例3
本实施例提供一种含高活性纳豆激酶的纳豆的制备方法，包括如下步骤：
1.原料筛选
选用吉育YJ105号极小粒黄豆，黄豆颗粒匀整，淡黄色，光泽鲜亮，中粒径为4.2mm，吸水率130％，死豆率0.1％，蛋白质含量38％。
2.黄豆浸泡
称取上述筛选的吉育YJ105号极小粒黄豆150kg，清洗干净，倒入浸泡槽中，加入450L清水进行浸泡，浸泡水温为12℃，浸泡时间为22h。
3.黄豆蒸煮
将浸泡后的黄豆倒入蒸煮锅中，利用清洁蒸汽对其进行蒸煮，蒸煮温度为121℃，蒸煮时间为30min。
蒸煮后，黄豆呈赭黄色，硬度为250-300g/粒(测试方法为：在量程3kg以内的电子秤上，用手指缓慢按压豆粒至崩溃，记录此时的按压重量值，取20粒平均值)。
4.纳豆菌稀释液制备
取7500mL加热至100℃的去离子水，自然冷却至40-60℃，加入乳糖300g，蔗糖150g，L-谷氨酸450g和L-丝氨酸75g，混合均匀，得稀释液；
量取5mL实施例1制备的纳豆芽孢杆菌孢子菌悬液，加入上述7500mL稀释液，得纳豆菌稀释液。
5.接种
将上述纳豆菌稀释液均匀喷洒至蒸煮后的黄豆表面，接种时，蒸煮黄豆的温度为90℃，活菌接种量为103-105个/g。
6.充填
将接种好的黄豆充填至不锈钢托盘中，并在上面覆盖一层聚乙烯透气膜，黄豆充填厚度为2.5cm，充填后黄豆的温度为50℃，聚乙烯透气膜的厚度为55μm，通气孔直径1.5mm，开孔率9个/100cm2。
7.二段式发酵
将充填好的黄豆于温度36℃，湿度85％，发酵12h，然后于温度46℃，湿度80％，发酵5h；
8.后熟
发酵后置于3℃中保存36h后熟，后熟后呈现纳豆特有的粘滞感、拉丝性、香气和口味。
实施例4
本实施例提供一种含高活性纳豆激酶的纳豆的制备方法，包括如下步骤：
1.原料筛选
选用吉育YJ105号极小粒黄豆，黄豆颗粒匀整，淡黄色，光泽鲜亮，中粒径为4.2mm，吸水率130％，死豆率0.1％，蛋白质含量38％。
2.黄豆浸泡
称取上述筛选的吉育YJ105号极小粒黄豆150kg，清洗干净，倒入浸泡槽中，加入600L清水进行浸泡，浸泡水温为20℃，浸泡时间为16h。
3.黄豆蒸煮
将浸泡后的黄豆倒入蒸煮锅中，利用清洁蒸汽对其进行蒸煮，蒸煮温度为116℃，蒸煮时间为40min。
蒸煮后，黄豆呈赭黄色，硬度为250-300g/粒(测试方法为：在量程3kg以内的电子秤上，用手指缓慢按压豆粒至崩溃，记录此时的按压重量值，取20粒平均值)。
4.纳豆菌稀释液制备
取7500mL加热至100℃的去离子水，自然冷却至40-60℃，加入乳糖450g，蔗糖300g，L-谷氨酸300g和L-丝氨酸150g，混合均匀，得稀释液；
量取10mL实施例1制备的纳豆芽孢杆菌孢子菌悬液，加入上述7500mL稀释液，得纳豆菌稀释液。
5.接种
将上述纳豆菌稀释液均匀喷洒至蒸煮后的黄豆表面，接种时，蒸煮黄豆的温度为70℃，活菌接种量为103-105个/g。
6.充填
将接种好的黄豆充填至不锈钢托盘中，并在上面覆盖一层聚乙烯透气膜，黄豆充填厚度为2.0cm，充填后黄豆的温度为60℃，聚乙烯透气膜的厚度为55μm，通气孔直径1.5mm，开孔率9个/100cm2。
7.二段式发酵
将充填好的黄豆于温度38℃，湿度95％，发酵8h，然后于温度44℃，湿度70％，发酵10h；
8.后熟
发酵后置于2℃中保存48h后熟，后熟后呈现纳豆特有的粘滞感、拉丝性、香气和口味。
上述实施例1-3中发酵室的硬件配置为：装填率40-60％(面积占比)，制冷量1000-3000W/100kg，制热量500-1000W/100kg。并采用自动化控制发酵室的温度和湿度，温度控制精度±1℃，湿度控制精度±5％RH；升温速率2-5℃/60min，降温速率5-10℃/60min。
对比例1
本对比例提供一种纳豆的制备方法，其制备方法与实施例1完全相同，不同的仅是二段式发酵过程，具体为：将充填好的黄豆于温度37℃，湿度90％，发酵10h，然后于温度39℃，湿度75％，发酵8h。
对比例2
本对比例提供一种纳豆的制备方法，其制备方法与实施例1完全相同，不同的仅是纳豆菌稀释液中的L-丝氨酸替换为等量的L-丙氨酸。
对比例3
本对比例提供一种纳豆的制备方法，其制备方法与实施例1完全相同，不同的仅是纳豆菌稀释液中的蔗糖替换为等量的葡萄糖。
对比例4
本对比例提供一种纳豆的制备方法，其制备方法与实施例1完全相同，不同的仅是纳豆菌稀释液中的乳糖替换为等量的葡萄糖，将L-丝氨酸替换为等量的L-丙氨酸。
将实施例2-4以及对比例1-4制备的纳豆粉碎，采用纤维蛋白平板法，以蚓激酶为标准品，检测各纳豆样品中的纳豆激酶活性。
蚓激酶标准品溶液：取蚓激酶标准品，用0.9％氯化钠溶液制成浓度分别为1mL中含2000、4000、6000、8000、10000蚓激酶单位的溶液。
取适量纳豆样品粉碎，用50mL离心管称取1g粉碎后的纳豆样品，加20mL 0.9％氯化钠溶液，常温超声波处理30min使其溶解，然后于5000r/min，离心10min，得样品溶液。
精密量取蚓激酶标准品溶液及样品溶液各10μL，点入纤维平板事先打好的孔内，37℃培养18h，用卡尺测量溶圈垂直两直径。
以蚓激酶标准品单位数的对数为横坐标，以蚓激酶标准品溶圈垂直两直径乘积的对数为纵坐标，计算标准曲线回归方程，回归方程为：y＝1.1029x-1.8942，R2＝0.9792。
将样品溶圈垂直两直径(x,y)乘积的对数代入标准曲线回归方程，计算样品中纳豆激酶含量(以蚓激酶计)，结果如表1所示。
表1
Figure BDA0003106424910000101
Figure BDA0003106424910000111
由上表可以看出，实施例2-4制备的纳豆中纳豆激酶的活性明显高于对比例1-4，这说明本发明实施例中通过将含有乳糖、蔗糖、L-谷氨酸和L-丝氨酸的菌种稀释液接种至大豆表面，并在特定温度下进行二段式发酵，显著提高了纳豆中纳豆激酶的活性。
将上述实施例2-4以及对比例1-4制备的纳豆进行感官评测(感官测定表准如表2所示)。结果：本发明实施例2-4制备所得到的纳豆在感官、拉丝、色泽、氨味、口感四项鉴定标准均可达到10分标准，菌丝丰富，纳豆表明覆盖一层均匀的菌膜，菌丝粘滞性好，其中拉丝长度可达40mm-80mm，且韧性好不易断，无任何氨味及苦涩味，咀嚼时有柔软、溜滑的口感。而对比例1-4制备的纳豆的评分均为8分。
表2
Figure BDA0003106424910000112
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种含高活性纳豆激酶的纳豆的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将原料黄豆清洗后加水浸泡，蒸煮，接种纳豆菌稀释液，二段式发酵，后熟，得含高活性纳豆激酶的纳豆；
其中，所述纳豆菌稀释液包含以下组分：乳糖4-6wt%，蔗糖2-4wt%，L-谷氨酸4-6wt%和L-丝氨酸1-2wt%；所述纳豆菌稀释液中纳豆菌的活菌数为1×106-2×106个/mL；
所述二段式发酵具体为：将接种纳豆稀释液的黄豆先于36-38℃、湿度85-95%的条件下发酵8-12h，然后于44-46℃、湿度70-80%条件下继续发酵5-10h。
2.如权利要求1所述的含高活性纳豆激酶的纳豆的制备方法，其特征在于，所述原料黄豆的中粒径为4-6mm，吸水率为120-140%，死豆率≤0.5%，蛋白质含量35-40%。
3.如权利要求1所述的含高活性纳豆激酶的纳豆的制备方法，其特征在于，所述浸泡的料水比为1:3-4，浸泡温度为12-20℃，浸泡时间为16-22h。
4.如权利要求1所述的含高活性纳豆激酶的纳豆的制备方法，其特征在于，所述蒸煮的温度为116-121℃，蒸煮时间为30-40min。
5.如权利要求1所述的含高活性纳豆激酶的纳豆的制备方法，其特征在于，接种纳豆菌稀释液时，黄豆的温度为70-90℃，活菌接种量为103-105个/g。
6.如权利要求1所述的含高活性纳豆激酶的纳豆的制备方法，其特征在于，所述纳豆菌稀释液的制备方法包括如下步骤：将纳豆菌活化后，进行固体培养，得孢子；将所述孢子制成菌悬液，向所述菌悬液中加入稀释剂，得纳豆菌稀释液。
7.如权利要求6所述的含高活性纳豆激酶的纳豆的制备方法，其特征在于，所述菌悬液中的活菌数为1×109-2×109个/mL。
8.如权利要求1所述的含高活性纳豆激酶的纳豆的制备方法，其特征在于，后熟阶段的温度为2-4℃，保温时间为24-48h。
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