CN101033456A

CN101033456A - 一种低酸发酵肉制品加工用戊糖片球菌专用菌株及其发酵剂的制备方法

Info

Publication number: CN101033456A
Application number: CNA2007100033679A
Authority: CN
Inventors: 孙宝忠; 贾英民; 田洪涛; 李海鹏; 种京华; 马菊; 马晓燕; 于辉; 马爱进; 张红梅; 高文霞
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2007-02-06
Filing date: 2007-02-06
Publication date: 2007-09-12

Abstract

本发明公开了一种低酸发酵肉制品加工用的发酵剂专用菌株及其培养、浓缩、真空冷冻干燥适宜工艺条件与复合增值培养基、冷冻保护剂配方。本发明所提供的低酸发酵肉制品加工用发酵剂，其活性成分为戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)P1菌株CGMCC № 1923。本发明通过筛选、纯化分离出一株具有蛋白酶活性、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、李斯特菌抑制活性的戊糖片球菌P1菌株(Pediococcus pentosaceus)CGMCC № 1923，将该菌株经过复合增值培养基培养、离心浓缩、加入冻干保护剂真空冷冻干燥后可制备成活菌量达到10×10¹⁰cfu/g的干粉发酵剂，该干粉发酵剂可用于发酵牛肉火腿、干发酵香肠等低酸发酵肉制品生产方面，具有提高产品感官、营养质量、微生物安全等作用，具有良好的应用前景。

Description

一种低酸发酵肉制品加工用戊糖片球菌专用菌株及其发酵剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种低酸发酵肉制品加工专用戊糖片球菌及其直投式发酵剂的制备技术方法。

背景技术

Bundnerfleisch发酵牛肉火腿是上世纪80年代末期我国一些合资企业引进国外技术生产的低酸发酵牛肉制品。近二十年来，其生产加工已逐渐成为我国优质高档牛肉生产企业提高中低档牛肉加工附加值的重要方式之一。Bundnerfleisch发酵牛肉火腿生产企业已由最初1～2家发展到十余家企业，其产品市场已逐步由高档宾馆饭店向超级市场转化。但是，受引进消化的加工工艺一直处于自然发酵加工，导致产品质量特征中式化程度低、质量稳定性、均一性差，加工周期长、加工成本高问题制约，其生产还处于标准化、规范化、规模化、大众化程度低下发展状态。如何实现其生产加工由自然发酵加工到人为控制发酵加工转变、提高其质量、缩短其加工周期、降低其生产成本还一直是亟待解决的重要技术难题。针对这一技术难题，2001年以来，我们系统查阅了国际同类产品科学研究资料，并在确认意大利Bresaola、巴西Charqui、西班牙与墨西哥Cecina等产品生产加工过程中存在微生物区系变化、尤其是国际上已研究确认木糖葡萄球菌人为接种可提高Charqui感官质量、能够加快蛋白质降解，存在利用分离细菌实现该类产品加工由自然发酵转化到人为控制发酵、缩短其加工周期的可能性基础上，系统研究了Bundnerfleisch发酵牛肉火腿生产加工过程中发酵细菌区系变化、对优势细菌进行了分离鉴定，研究了分离筛选获得的戊糖片球菌接种对产品加工过程中蛋白质、脂肪降解发酵产物与产品质量影响。在确认戊糖片球菌具有提高产品游离脂肪酸含量、提高产品苏氨酸、甘氨酸含量，改进产品色泽、香气、滋味等感官质量的基础上，系统研究了培养基、增殖培养基组成、培养条件、浓缩方法与冷冻真空干燥技术方法与工艺参数变化对分离筛选获得的戊糖片球菌存活状况的影响以及该发酵剂应用效果。在上述研究基础上，形成了本项戊糖片球菌菌株及其活菌数达到10¹⁰cfu/g数量级的发酵剂制备工艺方法发明。

戊糖片球菌是一种革兰氏染色阳性、不能运动、不形成内生孢子、能进行发酵代谢产生乳酸、不产气、不能还原硝酸盐、不液化明胶的片球均属细菌。已有大量研究表明其存在于大多数发酵肉制品加工过程中，具有显著的发酵乳糖等糖类形成乳酸，提高肉类酸度、抑制腐败菌与常见致病菌等的发酵作用。有鉴于此，上世纪80年代以来，国际上已广泛开展了发酵植物源、发酵乳品源与发酵肉品源戊糖片球菌优良发酵菌株筛选及其发酵剂制备工艺研究工作，目前欧美等发达国家已有多菌株商业化戊糖片球菌发酵剂用于多种高酸发酵向肠制品加工，再低酸发酵肉制品方面，所见报道尚不可见。在我国火腿、香肠等腌腊制品加工方面，已有研究报道发现戊糖片球菌是为主要优势细菌之一，具有改进火腿、香肠等腌腊肉制品质量作用，但在其发酵剂，尤其是冷冻浓缩发酵剂系统制备工艺技术方面研究报道甚少，尚未形成具有自主知识产权科技成果，有关发酵肉制品加工用戊糖片球菌发酵剂还处于依赖进口状态。本项发明无疑为我国低酸发酵肉制品加工用该菌发酵剂商品化生产、国产化生产供应奠定了可行的制备工艺基础，具有较大的科技与产业开发价值。

在形成本发明的基础上，我们以本发明产品戊糖片球菌发酵剂为材料研究了其不同接菌量与分离筛选的植物乳杆菌、木糖葡萄球菌不同接菌量组合对低酸发酵肉制品Bundnerfleisch发酵牛肉火腿与意大利萨拉米发酵产物与感官质量的影响，以适宜菌种组合为基础时，不同干燥温度、时间与依钙蛋白酶激活剂用量对影响低酸发酵肉制品Bundnerfleisch发酵牛肉火腿与意大利萨拉米发酵产物与感官质量的影响。研究发现戊糖片球菌发酵剂接入量是为影响Bundnerfleisch发酵牛肉火腿与意大利萨拉米发酵产物氨基酸态氮与产品可接受性显著因素，其与植物乳杆菌、木糖葡萄球菌发酵剂适量等量使用时具有显著提高产品氨基酸态氮、游离脂肪酸等发酵产物作用，具有显著改进Bundnerfleisch发酵牛肉火腿产品可接受性作用；研究发现在接入适量戊糖片球菌、植物乳杆菌、木糖葡萄球菌混合菌株发酵剂基础上，提高Bundnerfleisch发酵牛肉火腿与意大利萨拉米干燥温度愈添加适量依钙蛋白酶激活剂具有明显缩短两种产品加工周期效果。这些研究结果表明，本发明生产出的产品在改进低酸发酵肉制品Bundnerfleisch发酵牛肉火腿与意大利萨拉米产品质量、缩短其加工周期方面具有显著效果，具有明显利用价值与广阔应用前景。

低酸发酵肉制品是一类经过低温(≤22℃)发酵与干燥加工而成的，终产品pH值在5.5以上的发酵肉制品。该类产品不仅与高酸发酵肉制品一样具有营养丰富、食用安全性高、货架寿命长特点，而且因加工过程中碳水化合物降解率低、蛋白与脂肪酶解程度高，更具有口味柔和、风味浓郁等质量特点。其不仅是欧美发达国家备受青睐的高档肉类产品，而且因其起源于占我国肉制品产量30％以上的腌腊肉制品，风味较为适合我国人民饮食消费习惯且安全、营养、风味等商品质量优于腌腊肉制品，在国内也具有广阔的潜在市场。有鉴于此，近些年来，我国一些企业已在积极发展低酸发酵肉制品，积极探索将腌腊肉制品提升为低酸发酵肉制品得技术途径。但是受我国有关研究开展较迟、研究尚欠系统深入，低酸发酵肉制品发酵剂处于依赖进口状态影响，我国低酸发酵肉制品因质量特征中式化不足而发展步履艰难，腌腊肉制品生产因缺乏相应发酵剂与相应人工控制发酵技术处于传统自然发酵加工状态，安全与质量事故迭出，现代化生产消费发展举步维艰。在此形势下，在Bundnerfleisch发酵牛肉火腿与意大利萨拉米加工方面已显现具有明显改进产品质量效果与所短加工周期的戊糖片球菌发酵剂及其制备技术发明无疑对于其他低酸发酵肉制品与腌腊肉制品发展而言也具有广阔的开发价值与应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种能用于低酸发酵肉制品生产的专用菌株及发酵剂制备方法。

本发明所提供的所提供的低酸发酵肉制品生产的专用菌株戊糖片球菌P1分离自北京华安肉类有限公司Bundnerfleisch发酵牛肉火腿加工过程中，微生物形态学与生理生化鉴定为戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)，该菌株已于2007年1月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC No.1923。此菌株除具有戊糖片球菌一般特性外，还具有耐受6％浓度食盐、0.15％亚硝酸钠特性，抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌特性，在20℃培养条件下具有较强蛋白酶活性。

本发明所提供的低酸发酵肉制品加工用戊糖片球菌发酵剂制备方法为：以培养、浓缩、真空冷冻干燥为基本工艺。培养时使用的适宜培养基为麦芽汁复合增值培养基，其组成为麦芽汁培养基中加入0.5％乳糖、1.5％牛肉蛋白胨、5％酵母膏、10％番茄汁增殖因子(％指g/100ml)；适宜培养条件为温度20℃，培养基起始pH值为6.5～7.0，适宜收获时间为摇床培养18～22h后离心收获菌体；适宜浓缩方法为离心富集法，离心条件为温度0～4℃，离心转速6000rpm，离心时间30min；真空冷冻干燥时悬浮介质为加入4％蔗糖、1％维生素C、3％甘油、2％CaCO₃(％代表g/100ml)保护因子的12％的脱脂乳，真空冷冻干燥方法为将加有保护剂的和浓缩菌体的脱脂乳装于真空冷冻干燥器、在-25℃条件下冷冻2小时，然后将其放入真空冷冻干燥集中在冷阱温度-30，绝压4帕以下条件下干燥28~32小时，使含菌与冷冻保护剂脱脂乳水分含量达到2.5~3％时停止干燥，并将其盛放于密闭包装内。采用本戊糖片球菌发酵剂制备技术方法制备的发酵剂中戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)P1 CGMCC No.1923的含量达到10¹⁰cfu/g以上。

具体实施方式

实施例1、低酸发酵制品加工用专用戊糖片球菌P1菌株(Pediococcus pentosaceus)P1 CGMCC №1923)的筛选

1.备选菌株获取过程

从北京华安肉类有限公司Bundnerfleisch发酵牛肉火腿生产加工过程腌制阶段开始，第0，6，12，18(腌制阶段)，27，36，48(干燥阶段)天分别无菌获取肉样。从各时间取得的肉样中无菌称取25.0g样品，加入225mL无菌生理盐水中，均质30s，进行不同浓度稀释。然后将不同稀释度的菌悬液接种于MRS平板培养基中，在30℃二氧化碳培养箱中培养48h后，分别从最高稀释度的培养平板上随机挑取10个菌落，再移接到MRS与营养琼脂斜面培养基中，分别筛选得到乳酸菌70株，生理生化鉴定后获得戊糖片球菌菌株。

2.备选菌株蛋白酶与脂肪酶活性测定

菌株蛋白酶活性测定培养基组成为蛋白胨5g，干酪素10g，葡萄糖10g，牛肉膏10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。

菌株脂肪酶活性测定油脂培养基为蛋白胨10g，牛肉膏10g，氯化钠5g，香油或花生油10g，中性红(1.6％水溶液)约1ml，琼脂20g，蒸馏水1000ml。

无菌吸取0.1ml所分离的19个菌株培养液，均匀涂布在菌株蛋白酶活性测定培养基与脂肪酶活性测定油脂培养基上。分别于15℃、20℃、25℃培养48h以透明圈直径与菌落直径的比值判断菌株蛋白酶活的大小。确定所选菌株在20℃以上条件下具有蛋白酶活性。

分别无菌吸取0.1mL以适当倍数稀释的菌悬液滴加于油脂培养基上，涂布均匀，20℃培养48h，以菌落上或其周围出现红色斑点与否判断菌株是否具有脂肪酶活性。测定发现该菌株无脂肪酶活性。

3.低酸发酵制品加工用专用戊糖片球菌P1菌株安全性测定

采用GB4789.3-94～GB4789.14-94食品微生物学检验规定的沙门氏菌、志贺氏菌、致泻大肠埃希氏菌、副溶血性弧菌、小肠结肠耶森氏菌、空肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、蜡状芽孢杆菌检验方法检验戊糖片球菌P1菌株安全性，确定所选菌株安全无害，不属于国内食品安全所限定的致病菌。

4.低酸发酵制品加工用专用戊糖片球菌P1菌株种属鉴定

将戊糖片球菌P1菌株经过多次纯化，然后采用美国BIOLOG公司Microstation型全自动快速微生物鉴定仪进行鉴定，经鉴定该菌株应属于戊糖片球菌。

5.低酸发酵制品加工用专用戊糖片球菌P1菌株可用性测定

对菌株进行了耐盐性、耐亚硝酸盐性、抑菌活性等特性测定，发现该菌株具备肉品发酵剂菌种应具备的耐盐、耐亚硝酸盐所需特性、具有显著抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌作用。

实施例2、戊糖片球菌P1菌株(Pediococcus pentosaceus)P1 CGMCC №.1923的发酵培养

1、发酵培养基的确定

将所得低酸发酵制品加工用专用戊糖片球菌P1菌株分别在液体营养琼脂培养基、西红柿汁培养基、胡萝卜汁培养基、麦芽汁培养基中进行培养，观察其生长情况，确定出其基础培养基为麦芽汁培养基。(培养基配方均已公开)向基础培养基中添加牛肉蛋白胨、乳糖等增殖因子，观察戊糖片球菌P1菌株在其中的生长情况，通过测定菌株的增殖情况确定出有效的增殖因子，并以此设计正交试验，优化得到了P1菌株的复合增殖培养基的组成配方如下：麦芽汁基础培养基中添加0.5％乳糖、1.5％牛肉蛋白胨、5％酵母膏、10％番茄汁(％指g/100ml)增殖因子

2、培养条件的确定

将菌株在不同温度(10～25℃)、不同培养基起始pH值(5.5～8.0)、不同溶氧的条件下恒温培养，定时取样测定菌株的活菌数，研究确定了戊糖片球菌P1菌株的适宜培养温度、培养基适宜pH值、溶氧情况及最佳收获期等培养条件：培养温度20℃，培养基pH值6.5～7.0，摇床培养20h后离心收获菌体。

实施例3、干粉发酵剂的制备

将培养好的菌种离心，去除离心上清液，然后，加入冻干保护剂进行冷冻干燥，即可以得到干粉发酵剂。

以下对冻干过程中的一些工艺条件进行优化：

1、离心条件的优化

菌体富集培养后，研究了不同离心温度(0-25℃)、不同离心转速(3000-7500rpm)、不同离心时间(10～40min)等离心条件对菌株存活率影响，确定戊糖片球菌P1菌株菌液的适宜离心条件为：温度0～4℃，离心转速6000rpm，离心时间30min。

2、冻干保护剂配方

研究了戊糖片球菌P1菌株在添加甘油、维生素C等单因子保护剂的情况下冻干存活率的变化；并以筛选出的单因子保护剂为因素项，通过正交试验开展了不同保护剂及其剂量对戊糖片球菌P1菌株冻干存活率的影响，优化筛选出了戊糖片球菌P1菌株冻干保护剂的配方：浓度为12％的脱脂乳中添加4％蔗糖、1％维生素C、3％甘油、2％CaCO₃(％代表g/100ml)保护因子。

3、冻干工艺

冻干过程中，离心浓缩菌体与冻干保护剂近等量配比。在冻干过程中，菌粉干燥至2～5％含水量时停止干燥，以利于保持菌种的活性。在添加优化筛选出的复合保护剂情况下，冷冻干燥戊糖片球菌P1菌株的活菌数可达2.54×10¹⁰cfu/g。

一个具体的操作过程如下：

将木糖葡萄球菌戊糖片球菌P1菌株接种于pH值为7.0的复合增殖培养基中，接种量为1％，于20℃温度下摇床培养20h，然后经4℃、6000rpm、离心30min后，添加近等量的冻干保护剂，置于真空冷冻干燥机中，于-30℃，绝压4帕以下干燥24～26h，菌粉含水量降至2.5～3％时停止干燥，即得到干粉发酵剂。

所得干粉发酵剂活菌数可达2.54×10¹⁰cfu/g；在0～4℃贮存60天后，菌粉活菌数仍处于10¹⁰cfu/g数量级。

实施例4、干粉发酵剂的应用

本发明的干粉发酵剂应用于Bundnerfleisch发酵牛肉火腿的生产中，可以缩短牛肉的生产周期，提高产品质量。具体发酵过程如下：

腌制液的配制：将1000g食盐、50g葡萄糖、5g亚硝酸钠、150g香辛料溶于10L洁净水中，加热熬煮1.5-2.5小时后补充水分至10L并冷却至0-4℃保存，然后，在注入前加入实施例3所制备的干粉发酵剂100g，腌制液中菌量控制在10⁸cfu/ml。

采用注入方法将菌量为10⁸cfu/ml腌制液300g注入到1.5千克/块的新鲜冷分割小米龙牛肉中，在0～4℃温度下密封腌制2～3天，然后开始干燥：初期干燥温度控制在16～22℃，相对湿度75～85％，干燥时间10～15天；后期干燥温度控制在55～65℃、相对湿度控制在50～60％，时间控制在2～3天。总体加工时间控制在15～20天，即得到Bundnerfleisch发酵牛肉火腿，产品pH值为5.60～5.80。

作为对比，采用常规方法来制备Bundnerfleisch发酵牛肉火腿，其加工工艺为在0-2℃条件下密闭腌制20天(百公斤腌制剂中食盐为87.25千克、葡萄糖为2.5千克、香辛料为10千克，亚硝酸钠为0.25千克，腌制剂用量为4千克/100千克牛肉)，腌制后在16～20℃、70％～85％相对湿度下干燥30～60天至失重30％，得到发酵牛肉火腿，产品pH值为5.70～5.90。

测定两种方法所制备的发酵牛肉火腿，结果表明，采用本发明发酵剂所制备的发酵牛肉火腿与常规方法所制备的发酵牛肉火腿相比，游离甘氨酸含量提高160％、亮氨酸含量提高20％、脯氨酸含量提高20％以上，显著改进了Bundnerfleisch发酵牛肉火腿口感质量，可以实现低酸发酵肉制品的生产，并且可以大大缩短生产周期(生成时间从50天以上降低到16-22天左右)。

Claims

1、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)P1菌株菌CGMCC № 1923。

2、一种低酸发酵肉制品加工用的发酵剂，其活性成分为具有蛋白酶活性、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、李斯特菌抑制活性的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)P1菌株CGMCC № 1923。

3、根据权利要求2所述的发酵剂，其特征在于：所述发酵剂中戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)P1菌株CGMCC № 1923的含量达到10¹⁰cfu/g数量级。

4、根据权利要求2或3所述的发酵剂，其培养工艺在于：所述发酵剂是由戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)P1菌株CGMCC № 1923中加入麦芽汁增殖培养基中在温度20℃，初始pH值6.5～7.0条件下摇床培养20h后离心收获菌体。麦芽汁增殖培养基为麦芽培养基中添加0.5％乳糖、1.5％牛肉蛋白胨、5％酵母膏、10％番茄汁(％指g/100ml)增殖因子。

5、根据权利要求2或3所述的发酵剂，其离心浓缩工艺条件特征为：温度0～4℃，离心转速6000rpm，离心时间30min。

6、根据权利要求2或3所述的发酵剂，其真空冷冻浓缩工艺特征在于：离心浓缩后菌体中加入冻干保护剂后，经真空冷冻干燥制得；真空冷冻干燥工艺体方法为，冷阱-30℃，绝压4帕以下干燥24～26h至菌粉含水量降至2.5～3％时停止干燥。所述冻干保护剂为12％的脱脂乳中添加4％蔗糖、1％维生素C、3％甘油、2％CaCO₃(％代表g/100ml)的保护因子。

7、根据权利要求6所述的发酵剂制备要求，其特征在于：戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)P1菌株CGMCC № 1923培养后离心浓缩菌体与冻干保护剂的用量为近等质量。