CN1100142C - 纳豆激酶的生产方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提出的采用纳豆芽孢杆菌产生纳豆激酶的生产方法及用途属于微生物技术领域。本发明要解决野生纳豆菌种和由此得到的纳豆激酶一般生产方法不够理想的技术问题。提出的纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)X-501，它保藏于CGMCC，保藏号为0449，纳豆激酶的生产方法包括在大豆等培养基上按规定规范利用固体或液体发酵、提取和纯化工艺等。本发明的纳豆激酶经处理后可制成胶囊、保健食品及保健食品添加剂、医用注射针剂。
Description
本发明提出的采用纳豆芽孢杆菌产生纳豆激酶的生产方法及其用途属于微生物技术领域，特别涉及到高产菌株发酵和酶的生产方法。
纳豆是一种营养丰富的优质发酵食品，它是利用纳豆菌接种蒸煮过的大豆在适当温度下发酵得到的，在日本已做为传统食品，并且纳豆在日本民间被用来预防和治疗心血管等疾病。1987年日本须见氏发现纳豆中存在与血栓溶解酶相类似的酶，并命名为Nattokinase(纳豆激酶)，以后他证实了纳豆激酶经食用到血液这样长的时间也很稳定，从此纳豆激酶被广泛关注。
日本专利JP6261744A(1994)中描述，采用中国生产大豆进行固体发酵生产纳豆激酶，其发酵条件为首先50℃、18小时，然后5℃、24小时。
日本专利JP6153977A(1994)中记载采用液体发酵方法生产纳豆激酶，其发酵培养基组成为：2％果糖、1.5％大豆蛋白胨、0.2％酵母浸出物、0.1％KH2PO4、0.3％K2HPO4、0.05％MgSO4·5H2O、0.02％CaCl2·2H2O，发酵温度30℃、40小时。所述纳豆激酶活性单位为0.42-1.48u/ml。大规模的分离纯化采用丁基琼脂糖凝胶4B(Butyl Sepharose 4B)、葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)和丙烯葡聚糖凝胶S-200HR(Sephacryl S-200HR)。
野生的纳豆菌株和由此得到纳豆激酶的一般生产方法不够理想，主要是产率不高和不适于工业生产。
本发明的目的就是克服现有技术的不足，提出一种采用纳豆芽孢杆菌X-501高产菌株进行固体和液体发酵产生纳豆激酶的高产方法。
本发明的目的通过以下技术方案达到：1.一种纳豆芽孢杆菌，其特征在于本菌株确定为纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)X-501，该菌株保藏于北京的CGMCC，保藏号为0449。2.一种由权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌X-501培养产生纳豆激酶的生产方法，其特征在于：1)纳豆芽孢杆菌X-501在大豆或大豆制品为主要培养基上进行固体或液体发酵；2)固体发酵或液体发酵固体发酵：
采用水发黄豆破碎或不破碎，灭菌后直接进行接种进行发酵，豆饼粉、豆渣、脱脂大豆粉也可用做发酵原料；发酵时温度控制为22-40℃，最佳温度为36-38℃，相对湿度控制为80-95％，发酵周期为18-60小时；
液体发酵：
采用豆乳做发酵基质，可稀释或不稀释进行发酵；利用大豆粉、豆饼粉、豆渣使用量为1-8％，最佳用量为2-5％；添加牛肉膏或玉米浆可以促进纳豆芽孢杆菌X-501对纳豆激酶的分泌，牛肉膏使用量为0.2-2％，最佳为1-1.5％玉米浆使用量为0.5-1.5％，最佳为0.5-1.0％；发酵时温度控制为22-40℃，最佳温度为36-38℃，发酵周期18-48小时，pH值控制为6.8-7.0；
试验时摇瓶培养条件：
500ml三角摇瓶，培养基装量60-100ml，当偏心距为2.54cm的旋转摇床时，转数250-350rpm，当采用偏心距为5.0cm的旋转摇床时，转数为180-240rpm；
生产时发酵罐培养条件：
通气控制为1∶0.4-1∶1v/v/min，搅拌200-300rpm，罐温36-38℃，罐压0.03-0.05MPa；
3)提取
对于固体发酵，先用5-10倍量的0.1-0.15M的氯化钠溶液在4-10℃下搅拌抽提1-2小时后先粗预滤，除去大颗粒发酵基质，压滤或离心去除菌体；滤液或上清液中加0.02-0.05％CaCl2，并在低温下再进行超滤浓缩20-50倍，加冷酒精至乙醇含量达75-80％，或加固体硫酸铵使饱和度逐渐达80％，以便纳豆激酶沉淀下来；
对于液体发酵，则直接进行压滤或离心除去菌体；滤液或上清液中加0.02-0.05％CaCl2，并在低温下再进行超滤浓缩20-50倍，加冷酒精至乙醇含量达75-80％，或加固体硫酸铵使饱和度逐渐达80％，以便纳豆激酶沉淀下来；
4)纯化
经75％的酒精沉淀或固体硫酸铵沉淀出来的沉淀物用0.05M PH7.6的磷酸缓冲液溶解，加入固体硫酸铵逐渐达80％饱和度，高速离心，收集沉淀物。沉淀物用0.05M PH6.5磷酸缓冲液溶解并透析，在CM32离子交换柱上层析，收集活性组分。该组分进行超滤浓缩，得到高浓度的酶液，再进行SephacrylS-100HR凝胶柱层析，收集活性组分，该组分经超滤浓缩透析而得到纳豆激酶的纯化产品。
3.一种上述的纳豆激酶的用途，其特征在于，该纳豆激酶沉淀物溶解脱盐后，可直接与辅料豆粉、奶粉、豆奶粉、糊精混合调配至所需要求的酶活单位，经冷冻干燥后制成纳豆激酶胶囊或其他形式的保健食品；也可将纳豆激酶沉淀物溶解脱盐后直接进行冷冻干燥，再用少量葡萄糖或乳糖调配至所要求的酶活单位制成保健食品添加剂。
4.一种上述的纳豆激酶的用途，其特征在于，上述纳豆激酶的纯化产品经冷冻干燥制成医用注射针剂。
下面更详细的说明本发明的技术方案：
本发明提出的纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)X-501属于纳豆菌株，该菌株于2000年5月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称为CGMCC，保藏号为0449。
该菌种特征如下：
1.形态特征
于30℃培养2-4天后，X-501菌体为短杆状，不成链，直或直形：0.6～0.8×1.1～1.5μm，能运动，鞭毛侧生，有芽孢，芽孢中生，不膨大，在一个孢子囊细胞中，孢子不多于一个；革兰氏染色阳性；抗酸染色阴性。
2.培养特征
菌株X-501在四种培养基上30℃培养3～5天后的结果见表1。
表1 菌株X-501的培养特征
| 培养基 | 菌落形态 |
| 黄豆粉琼脂桑塔斯琼脂牛肉汁琼脂酵母膏麦芽精琼脂 | 菌落微黄色，厚膜状，边缘光滑菌落杏仁白色，边缘光滑，表面粗糙，嵴壮菌落乳脂色边缘光滑，表面粗糙，嵴壮菌落灰白色边缘光滑，表面粗糙，嵴壮 |
3.化学分类：
按Lechevalier薄板层析法进行全细胞水解液分析的结果表明：菌株X-501含有meso-DAP(二氨基庚二酸，Diaminopinelic acid)，甘氨酸；无特征性糖(糖型C)。
4.菌株X-501的生理生化特征见表2：
表2 菌株X-501的生理生化特征
5 稳定性检测：
| 特征 结果 | 利用糖产酸 结果 |
| 明胶液化 +淀粉水解 -吲哚反应 -硝酸盐还原 -接触酶 +纤维素生长 -VP试验 -卵磷脂 +酪氨酸分解 -酪素水解 + | 蜜二糖 -半乳糖 +核糖 +麦芽糖 +卫矛糖 -肌醇 -蔗糖 +木糖 -阿拉伯糖 -葡萄糖 + |
5.1X-501菌株隔着平皿盖在紫外光下照射72小时后，菌体生长良好，将其转接第二、第三代，其活力良好，胞壁化学组分与参照菌株相同。
5.2生长温度试验：菌株X-501在不同温度的生长情况见表3。
表3 菌株X-501在不同温度的生长情况
5.3 乙醇耐受力试验：结果见表4.
| 生长温度(℃) 生长情况 | 生长温度(℃) 生长情况 |
| -20 --10 --5 +10 +15 +20 +30 + | 35 +40 +45 +50 -60 -65 - |
表4 X-501菌株的乙醇耐受力
5.4 酸碱性试验：X-501菌株在不同pH下的生长情况见表5.
| 浸泡时间(h) | 10 | 24 | 36 | 48 | 64 | 72 | 84 |
| 生长情况 | + | + | + | + | + | - | - |
表5 X-501菌株在pH不同下的生长情况。
5.5 耐盐实验：X-501菌株在不同NaCl浓度下的生长情况见表6。
| pH | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| 生长情况 | - | - | + | + | + | + | + | - | - | - |
表6 X-501菌株在不同盐浓度下的生长情况
| 盐浓度(％) | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |
| 生长情况 | + | + | + | - | - |
本发明的纳豆芽孢杆菌X-501的生产方法如下：
菌株X-501在大豆或大豆制品(包括大豆粉，豆饼粉，脱脂大豆粉，豆渣，豆乳等)为主要基质的培养基上进行固体或液体发酵。
发酵
对于固体发酵可用水发黄豆经破碎或不破碎，经灭菌后，直接接种进行发酵。豆饼粉、大豆粉、豆渣、脱脂大豆粉也可用作为发酵原料，发酵时温度控制为22-40C，最适温度36-38℃相对湿度控制为80-95％，发酵周期为18-60小时。
对于液体发酵还可用豆乳作为发酵基质可经稀释或不稀释进行发酵。利用大豆粉、豆饼粉、豆渣等使用量为1-8％，最佳用量为2-5％。液体发酵时添加牛肉膏或玉米浆可以促进纳豆菌对纳豆激酶的分泌，玉米浆使用量0.5-1.5％，最佳用量0.5-1.0％；牛肉膏0.5-2％，最适用量1-1.5％。液体发酵时温度可控制在22-40℃，最适温度36-38℃，发酵周期18-48小时。PH值可控制在6.8-7.0。
试验时摇瓶培养条件：
500ml三角摇瓶，培养基装量60-100ml，当采用偏心距为2.54cm的旋转摇床时，转数250-350rpm，当采用偏心距为5.0cm的旋转摇床时，转数为180-240rpm；
生产时发酵罐培养条件：
通气控制为1∶0.4-1∶1v/v/min，搅拌200-300rpm，罐温36-38℃，罐压0.03-0.05MPa；纳豆激酶的提取：
对于固体发酵可先用5-10倍量的0.1-0.15M的氯化钠液在4-10℃下搅拌抽提1-2小时后先粗预滤，除去大颗粒发酵基质，压滤或离心去除菌体。对于液体发酵则直接进行压滤或离心除去菌体。滤液或上清液中加0.02-0.05％CaCl2，并在低温下再进行超滤浓缩20-50倍，加冷酒精至乙醇含量达75-80％，或加固体硫酸铵使饱和度逐渐达80％，以使纳豆激酶沉淀下来。
对于液体发酵，则直接进行压滤或离心除去菌体，滤液或上清液中加0.02-0.05％CaCl2，并在低温下再进行超滤浓缩20-50倍，加冷酒精至乙醇含量达75-80％，或加固体硫酸铵使饱和度逐渐达80％，以使纳豆激酶沉淀下来。纳豆激酶的纯化：
经75％酒精沉淀或固体硫酸铵沉淀出来的沉淀物用0.05M PH7.6磷酸缓冲液溶解，加入固体硫酸铵逐渐达80％饱和度。高速离心，收集沉淀物。沉淀物用0.05M PH6.5磷酸缓冲液溶解并透析，在CM32离子交换柱上层析，收集活性组分。该组分进行超滤浓缩，得到高浓度的酶液，再进行Sephacryl S-100HR凝胶柱层析，收集活性组分，该组分经超滤浓缩透析而得到纳豆激酶的纯化产品。纳豆激酶的用途：
纳豆激酶沉淀物溶解脱盐后可直接与其他辅料(豆粉、奶粉、豆奶粉及糊精等)混合调配至所要求的酶活单位，经冷冻干燥后制成纳豆激酶胶囊或其它形式的保健食品，也可将纳豆激酶沉淀物脱盐后直接进行冷冻干燥，再用少量葡萄糖或乳糖调配至所要求的酶活单位制成保健食品。
上述纳豆激酶的纯化产品经冷冻干燥即成高活性的纳豆激酶成品，利用该成品可制成医用注射针剂。
经研究发现纳豆激酶实际上是并无激活血浆中纤溶酶原的作用，纳豆激酶可直接降解纤维蛋白及纤维蛋白原。口服纳豆激酶不但可以经肠道吸收进入血液循环直接作用血栓，还可诱导肝脏或血管内皮产生TPA(组织型纤溶酶原激活因子)使生物体自身纤溶酶系统活化，从而温和持续地提高血液的纤溶活性。
活性单位定义——纳豆激酶的溶纤活性可采用小球下降法来进行测定。在该测定体系下(见附录I)我们规定：小球从凝块顶部下降至凝块底部需300秒(5分钟)时的酶量为1个纤溶单位。在该测定体系中，如果加入的酶量在1-2个溶纤单位时，小球下降的时间与酶的活性单位呈一直线关系。因此可以通过一个已知单位标准酶来测定样品中的酶活力。
采用纳豆芽孢杆菌X-501在以大豆/大豆粉为主要原料的发酵生产中可以获得较野生菌株高十几倍的酶活，液体发酵最高酶活达9.1u/ml。在固体发酵中可达22.9u/g大豆。本发明中采用的生产原料简单，价格便宜，并且工艺参数合理。因此，可以在最短的生产时间内获得较高的产酶量。
实施例1：
500ml三角瓶加入3.2g大豆粉，1.2g牛肉膏，80ml自来水，调pH 6.9，121℃灭菌15min，接入105纳豆芽孢杆菌X-501孢子液0.8ml.。在偏心距2.54cm旋转式摇瓶机中，旋转速度300rpm，38℃恒温培养28小时测得酶活7.6u/ml。
实施例2：
500ml三角瓶加入4.0g生大豆饼粉，1.5g牛肉膏，100ml自来水，调pH6.9，121℃灭菌15min，接入105纳豆芽孢杆菌X-501孢子液1.0ml，在偏心距2.54cm旋转式摇瓶机中，旋转速度300rpm，38℃恒温培养30小时测得酶活2.5u/ml。
实施例3：
100g经水浸泡过夜的大豆，装入一只φ16cm平皿中(记作：A)，另取100g同样处理的大豆，经碾碎放入另一个φ16cm平皿中(记作：B)，121℃灭菌20min，冷却后各接入105纳豆芽孢杆菌X-501孢子悬液2.0ml。搅拌后置37℃恒温室，控制湿度90％，培养24小时。从A、B两平皿中各取1.0g，分别溶于5ml生理盐水中，浸提过夜，其溶纤活力分别为每克培养物A：22.9u和B：12.1u。
实施例4：
液体发酵工艺
将一支纳豆芽孢杆菌X-501活化斜面菌种用10ml无菌水洗脱后接入300L发酵罐中(培养基装量为250L)。发酵培养基组分为：大豆粉4％，牛肉膏1.5％，自来水补足体积至250L，121℃灭菌30分钟，灭菌后PH为6.7-7.0，发酵温度为38℃，搅拌速度250rpm，通气量为1∶0.7v/v/m，发酵时间为30小时，发酵单位最终为8.5u/ml。实施例5：
提取工艺，纳豆激酶胶囊制取
250L发酵液经离心除去菌体，然后上清加CaCl2 0.02％～0.05％，将离心所得上清液进行超滤至10L(浓缩25倍)，向超滤液中加乙醇至乙醇含量为75％，此外4℃存放8小时，将该液离心得到的沉淀物进行抽滤至干，加少量生理盐水溶解添加辅料(豆奶粉)后，冷冻干燥成粉状，该冷冻干粉分装胶囊。酶活总收率43％。
实施例6：
纯化工艺，纳豆激酶医用注射针剂的制取
将由300L发酵罐上得到的一批250L发酵液(发酵单位9.1u/ml)按实施例5提取工艺提取得乙醇沉淀物溶解后，再经硫酸铵沉淀，收集沉淀物再进行透析脱盐。透析后的酶液先经羧甲基纤维素CM32阳离子交换柱层析，收集高活性组分，经超滤液浓缩至小体积。再经SephacrylS-100HR凝胶柱层析，收集高活性组分，经超滤浓缩后进行冷冻干燥，制成医用注射针剂。
Claims (5)
1.一种纳豆芽孢杆菌，其特征在于本菌株确定为纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)X-501，该菌株保藏于北京的CGMCC，保号为0449。
2、一种由权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌X-501培养产生的纳豆激酶。
3、一种由权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌X-501培养产生纳豆激酶的生产方法，其特征在于：
1)纳豆芽孢杆菌X-501在大豆或大豆制品为培养基上进行固体或液体发酵；
2)固体发酵或液体发酵
固体发酵：
采用水发黄豆破碎或不破碎，灭菌后直接接种进行发酵，豆饼粉、豆渣、脱脂大豆粉也可用做发酵原料；发酵时温度控制为22-40℃，相对湿度控制为80-95％，发酵周期为18-60时；
液体发酵：
采用豆乳做发酵基质，可稀释或不稀释进行发酵；利用大豆粉、豆饼粉、豆渣使用量为1-8％，添加牛肉膏或玉米浆可以促进纳豆芽孢杆菌X-501对纳豆激酶的分泌，牛肉膏使用量为0.2-2％，玉米浆使用量为0.5～1.5％发酵时温度控制为22-40℃，发酵周期18-48小时，pH值控制为6.8-7.0；
试验时摇瓶培养条件：
500ml三角摇瓶，培养基装量60-100ml，当偏心距为2.54cm的旋转摇床时，转数250-350rpm，当采用偏心距为5.0cm的旋转摇床时，转数为180-240rpm；
生产时发酵罐培养条件：
通气控制为1∶04-1∶1 v/v/min，搅拌200-300rpm，罐温36-38℃，罐压0.03-0.05MPa；
3)提取
对于固体发酵，先用5-10倍量的0.1-0.15M的氯化钠溶液在4-10℃下搅拌抽提1-2小时后先粗预滤，除去大颗粒发酵基质，压滤或离心去除菌体；滤液或上清液中加0.02-0.05％CaCl2，并在低温下再进行超滤浓缩20-50倍，加冷酒精至乙醇含量达75-80％，或加固体硫酸铵使饱和度逐渐达80％，以便纳豆激酶沉淀下来；
对于液体发酵，则直接进行压滤或离心除去菌体；滤液或上清液中加0.02-0.05％CaCl2，并在低温下再进行超滤浓缩20-50倍，加冷酒精至乙醇含量达75-80％，或加固体硫酸铵使饱和度逐渐达80％，以便纳豆激酶沉淀下来；
4)纯化
经75％的酒精沉淀或固体硫酸铵沉淀出来的沉淀物用0.05M PH7.6的磷酸缓冲液溶解，加入固体硫酸铵逐渐达80％饱和度，高速离心，收集沉淀物。沉淀物用0.05M PH6.5磷酸缓冲液溶解并透析，在CM32离子交换柱上层析，收集活性组分。该组分进行超滤浓缩，得到高浓度的酶液，再进行Sephacryl S-100HR凝胶柱层析，收集活性组分，该组分经超滤浓缩透析而得到纳豆激酶的纯化产品。
4.一种如权利要求2所述的纳豆激酶的用途，其特征在于，该纳豆激 酶沉淀物溶解脱盐后，可直接与辅料豆粉、奶粉、豆奶粉、糊精混合调配至所需要求的酶活单位，经冷冻干燥后制 成纳豆激酶胶囊或其他形式的保健食品；也可将纳豆激酶沉淀物溶解脱盐后直接进行冷冻干燥，再用少量葡萄糖或乳糖调配至所要求的酶活单位制成保健食品添加剂。
5.一种如权利要求2所述的纳豆激酶的用途，其特征在于，上述纳豆激酶的纯化产品经冷冻于燥制成医用注射针剂。
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