CN108676747B - 一种包含红曲废弃菌丝体和玉米粗原料的培养基及其在培养纳豆激酶生产菌中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种包含红曲废弃菌丝体和玉米粗原料的培养基及其在培养纳豆激酶生产菌中的应用。将发酵产生的红曲废弃菌丝体进行回收,用酸性纤维素酶和复合酶水解成含有还原糖、游离氨基酸和小肽等物质的水解液;再用KOH将水解液pH调制6.5~7.5,最后用中和后的水解液配置纳豆芽孢杆菌发酵培养基。本发明的水解红曲废弃菌丝体和玉米粗原料作为纳豆激酶生产菌发酵原料,为纳豆激酶生产菌提供了丰富的氨基酸碳源,实现了废物再利用,降低了纳豆激酶生产菌培养基的成本;纳豆激酶生产菌在其发酵培养基中生长良好,显著降低了发酵法生产红曲过程中发酵废弃物的处理量,不仅提升了菌体的培养效果,而且大大提高其附加值。
Description
技术领域
本发明涉及纳豆激酶生产菌发酵培养技术领域,具体涉及一种利用玉米粗原料发酵红曲废弃菌丝体培养纳豆激酶生产菌的方法和应用。
背景技术
在发酵培养基中,作为培养生产红曲色素的主要碳源有葡萄糖、麦芽糖、果糖等。为了适应不同行业对红曲霉产红曲色素的需求,需要寻找更廉价、可再生的培养基原料以降低生产成本。玉米粗原料不仅可以一种全新的碳源为培养基提供营养,而且相比葡萄糖等原料价格更低,是作为一种用于红曲霉生物合成红曲色素的理想原料,兼具经济性和环保价值。
在利用红曲霉发酵产红曲色素时,红曲霉在液体培养基中呈现菌丝体的形态,胞外的水溶性红曲色素在发酵时直接溶于液体培养基中,而胞内的脂溶性红曲色素则由菌丝体通过乙醇萃取而得。在红曲色素提取完成之后,通常会将红曲菌丝体作为废弃物处理。目前红曲霉液态发酵菌丝体的开发应用较少,主要被用来提取壳聚糖、食品生产添加物以及动物饲料等方面,而将红曲废弃菌丝体进一步处理作为培养基的成分目前还没有被报道。
发明内容
针对上述问题,本发明提供了一种包含红曲废弃菌丝体和玉米粗原料的培养基及其在培养纳豆激酶生产菌中的应用,满足现代产业高效培养纳豆激酶生产菌的需求。
一种包含红曲废弃菌丝体和玉米粗原料的培养基,所述培养基中红曲废弃菌丝体水解液占培养基总体积的5%~50%、玉米粗原料5~30g/L、无机盐0.01~1 g/L。
所述红曲废弃菌丝体水解液的获得方法为:首先滤出红曲发酵液中的菌体,将过滤得到的菌体配置成浓度为8g/L~35g/L的菌体液,然后再用酸性纤维素酶和复合酶水解;水解的pH值为4.0~4.5,水解温度为35~55℃,水解时间控制在24~72h;水解完成后用KOH将水解液pH调制6.5~7.5。
一种包含红曲废弃菌丝体和玉米粗原料的培养基,首先滤出红曲发酵液中的菌体,再将菌丝体进行回收,用酸性纤维素酶和复合酶水解成含有还原糖、游离氨基酸和小肽等物质的水解液;再用KOH将水解液pH调制6.5~7.5,最后用中和后的水解液配置纳豆激酶生产菌发酵培养基。
进一步的,将过滤得到的菌体配置成浓度为8g/L~35g/L的废弃菌体液,然后再用酸性纤维素酶和复合酶以2:1的配比进行水解,其中复合酶是由中性蛋白酶和葡聚糖酶按照1:1进行复合;所述的pH值的条件为4.0~4.5,温度条件为35~55℃,水解时间控制在24~72h。
进一步的,所述红曲废弃菌丝体水解液占纳豆芽孢杆菌发酵培养基总体积的5%~20%。
进一步的,所述的纳豆激酶生产菌发酵液中还包括一些辅助因子,所述辅助因子为玉米粗原料、氯化钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁和生物素等多钟组合。进一步优选为,所述培养基中红曲废弃菌丝体水解液占培养基总体积的5%~50%、玉米粗原料5~30g/L、无机盐0.01~1g/L依次加入水中,搅拌均匀,然后在121℃下维持20min进行灭菌处理,再降温至20~35℃,配置而成。
进一步的,所述的纳豆激酶生产菌采用枯草芽杆菌(Bacillus subtilis)CGMCCNo.13932,所述的纳豆激酶生产菌在所述的生产菌发酵培养基中的接种量控制在2%-10%,发酵温度在25 ℃~40 ℃,发酵20 h~72 h。
本发明的水解红曲废弃菌丝体和玉米粗原料作为纳豆激酶生产菌发酵原料,为纳豆激酶生产菌提供了丰富的氨基酸碳源,实现了废物再利用,降低了纳豆激酶生产菌培养基的成本;纳豆激酶生产菌在其发酵培养基中生长良好,显著降低了发酵法生产红曲过程中发酵废弃物的处理量,不仅减少环境污染,而且大大提高其附加值。
废弃的红曲菌丝体经过水解后会产生大量的还原糖和氨基酸成分,通常,纳豆激酶生产菌的发酵基质主要以黄豆为主,其培养方法多基于日本纳豆发酵工艺,培养基成分中主要添加了葡萄糖、蔗糖、胰蛋白胨以及各种氨基酸和小肽等,然而现有的培养纳豆激酶生产菌的培养基中所需的氨基酸和小肽的含量较多,成分较为复杂,如果将废弃红曲菌丝体的水解液作为纳豆激酶生产菌培养基的成分,同时将玉米粗原料作为培养基中的碳源,不仅可以实现废物再利用,降低纳豆激酶生产菌培养基的成本,而且可以为发酵基质提供更多更丰富碳源和氮源。
有益效果:与传统液体发酵培养基相比,本发明添加的红曲废弃菌丝体和玉米粗原料培养基发酵生产纳豆激酶活性高,同时成本大幅度降低。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技人员所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
以下实施例中所采用的红曲发酵液是在葡萄糖4.5%(w/v),大豆蛋白胨8%(w/v),KH2PO4 0.7%(w/v),CaCl2 0.001%(w/v),余量为蒸馏水的培养基下,接种10-20%(v/w)的红曲菌,再通过180r/min、30℃条件下发酵一周左右时间得到的。其中所述的红曲菌菌种为紫色红曲菌BNCC189220 (Monasucs purpureus BNCC189220),购自北纳生物。
以下实施例中所采用的纳豆激酶生产菌为枯草芽杆菌(Bacillus subtilis)CGMCCNo.13932,来自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
实施例1
将100L红曲发酵液通过6000rpm 离心15min后过滤发酵液,得到红曲废弃菌丝体,红曲废弃菌丝体的初始pH值为4.98,将pH调节成4.0~4.5,用酸性纤维素酶(100U/g,诺维信中国投资有限公司)和复合酶(中性蛋白酶60000U/g、β-葡聚糖2000U/g,大连美仑生物技术有限公司,两者按1:1复合)按照2:1的比例共同水解成含有还原糖、游离氨基酸和小肽等物质的水解液;最佳水解温度为37℃和水解时间为24h,再用KOH溶液将水解液pH调制6.5~7.5,最后用中和后的水解液配置纳豆芽孢杆菌发酵培养基。
按照质量比取各原料备用,其中红曲废弃菌丝体水解液占培养基总体积的20%,玉米粗原料15g/L、氯化钙0.3g/L,磷酸二氢钾0.5 g/L,磷酸氢二钾0.5 g/L、硫酸镁0.1 g/L、生物素0.03g/L依次加入水中,搅拌均匀,在121℃下维持20min进行灭菌处理,再降温至20~35℃,制得纳豆激酶生产菌发酵培养基。
以下通过对照组实验,说明本发明对于纳豆激酶生产菌的可行性及其效果。
对照组:发酵培养基采用葡萄糖15g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.5 g/L,磷酸氢二钾0.5 g/L、硫酸镁0.1 g/L、甘氨酸5g/L、丙氨酸5g/L、组氨酸5g/L、天冬氨酸5 g/L、亮氨酸5 g/L、大豆蛋白肽1.5 g/L生物素0.03 g/L,其余为水。
本实施例和对照组发酵工艺均按照如下步骤:将处于对数生长期的枯草芽杆菌CGMCCNo.13932按照5%(体积比)比例的接种量接入对照培养基和本实施例中的发酵培养基,在pH7.4,温度30℃,转速180rpm,接种量为8%的条件下发酵72 h。然后选择600 nm测其OD(光密度,optical density)值。两组发酵培养基中纳豆激酶生产菌生长情况见表1。结论:本实施例和对照组培养3天后,含有玉米粗原料和红曲废弃菌丝体培养基的菌体培养效果明显高于培养基中仅含有葡萄糖的对照组,相比于对照组,其OD值增长了42%,枯草芽孢杆菌浓度增长效果显著;入装液量为80mL发酵液/500mL三角瓶,25℃~40℃温度下培养,转速为180rpm。发酵3天后CGMCCNo.13932的发酵液产纳豆激酶为16279.8 IU/ml(采用琼脂糖-纤维平板法检测纳豆激酶活性),较对照组的8965.5 IU/ml相比,纳豆激酶产量提高了81.6%。
实施例2
所述的枯草芽杆菌(Bacillus subtilis)液态培养:
液态培养基组成:大豆蛋白胨占培养基总体积的20%,玉米粗原料15g/L、氯化钙0.3g/L,磷酸二氢钾0.5 g/L,磷酸氢二钾0.5 g/L、硫酸镁0.1 g/L、生物素0.03g/L依次加入水中,搅拌均匀,中和pH定容后在121℃下维持20min进行灭菌处理,再降温至20~35℃,配置而成。
对照组的液态培养组成:(同实施例1)
在pH7.4,温度30℃,转速180rpm,接种量为8%的条件下发酵72 h,并在600 nm测其OD(光密度,optical density)值。两组发酵培养基中纳豆激酶生产菌生长情况见下表1。结论:本实施例和对照组培养3天后,含有玉米粗原料培养基的培养效果明显高于对照组,其OD值增长了14.6%,枯草芽孢杆菌浓度有所增长;入装液量为80mL发酵液/500mL三角瓶,25℃~40℃温度下培养,转速为180rpm。发酵3天后CGMCCNo.13932的发酵液产纳豆激酶为9986.9 IU/ml(采用琼脂糖-纤维平板法检测纳豆激酶活性),较对照组的8965.5 IU/ml相比,纳豆激酶产量提高了11.4%。
实施例3
所述的枯草芽杆菌(Bacillus subtilis)液态培养:
液态培养基组成:红曲废弃菌丝体水解液占培养基总体积的20%,葡萄糖15g/L、氯化钙0.3g/L,磷酸二氢钾0.5 g/L,磷酸氢二钾0.5 g/L、硫酸镁0.1 g/L、生物素0.03g/L依次加入水中,搅拌均匀,中和pH定容后在121℃下维持20min进行灭菌处理,再降温至20~35℃,配置而成。
对照组的液态培养组成:(同实施例1)
在25 ℃~40 ℃温度下,200rpm发酵培养3天,并600 nm测其OD(光密度,opticaldensity)值。两组发酵培养基中纳豆激酶生产菌生长情况见下表1。1结论:本实施例和对照组培养3天后,含有红曲废弃菌丝体水解液培养基的培养效果明显高于对照组,其OD值增长了17.2%,枯草芽孢杆菌浓度有所增长;入装液量为80mL发酵液/500mL三角瓶,25℃~40℃温度下培养,转速为180rpm。发酵3天后CGMCCNo.13932的发酵液产纳豆激酶为9823.7 IU/ml(采用琼脂糖-纤维平板法检测纳豆激酶活性),较对照组的8965.5 IU/ml相比,纳豆激酶产量提高了9.6%。
实施例4
所述的枯草芽杆菌(Bacillus subtilis)液态培养:
液态培养基组成:未处理的红曲废弃菌丝占培养基总体积的20%,葡萄糖15g/L、氯化钙0.3g/L,磷酸二氢钾0.5 g/L,磷酸氢二钾0.5 g/L、硫酸镁0.1 g/L、生物素0.03g/L依次加入水中,搅拌均匀,中和pH定容后在121℃下维持20min进行灭菌处理,再降温至20~35℃,配置而成。
对照组的液态培养组成:(同实施例1)
在25 ℃~40 ℃温度下,200rpm发酵培养3天,并600 nm测其OD(光密度,opticaldensity)值。两组发酵培养基中纳豆激酶生产菌生长情况见下表1。1结论:本实施例和对照组培养3天后,含有未处理的红曲废弃菌丝培养基的培养效果略高于对照组,其OD值增长了8.9%,枯草芽孢杆菌浓度有所增长;入装液量为80mL发酵液/500mL三角瓶,25℃~40℃温度下培养,转速为180rpm。发酵3天后CGMCCNo.13932的发酵液产纳豆激酶为9643.2 IU/ml(采用琼脂糖-纤维平板法检测纳豆激酶活性),较对照组的8965.5 IU/ml相比,纳豆激酶产量提高了7.6%。
表1
发酵时间 | 对照组 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 |
培养1天 | 8.5 | 10.4 | 8.6 | 8.8 | 8.6 |
培养2天 | 15.7 | 20.15 | 18.26 | 19.6 | 16.2 |
培养3天 | 18.5 | 26.31 | 21.67 | 22.35 | 20.3 |
纳豆激酶IU/ml | 8965.5 | 16279.8 | 9986.9 | 9823.7 | 9643.2 |
通过成本核验,利用普通培养基制备纳豆激酶生产菌时,每升的培养基的生产成本为10~15元/公斤,所需葡萄糖、各类氨基酸和小肽为20~200g;而将红曲废弃菌丝体和玉米粗原料作为碳源和氮源代替上述材料时生产成本为2~3元/公斤,仅占现有技术成本的五分之一左右,大大节约了企业投入,提高了企业净收入,同时将红曲菌丝体废物进行进一步利用,减少了资源浪费。
最后,还需要注意的是,以上列举仅是本发明几个具体实施例。显然,本发明不限于以上实施例,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。
酶活检测方法:
(1)试剂0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.8)取磷酸氢二钠3.58g,加水使溶解并稀释至1000mL为A液;取磷酸二氢(NaH2PO4·2H20)0.78g,加水使溶解并稀释至500mL为液;将A、B两液混合至pH值为7.8。工作溶液取0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.8)与0.9%氯化钠溶液(1:17)混合。1,5%琼脂糖溶液取琼脂糖1.5g,加工作溶液100mL加热溶解。纤维蛋白原溶液取纤维蛋白原适量,加工作溶液制成每lmL中含1.5mg的可凝蛋白溶液。凝血酶溶液取凝血酶,加0.9%氯化钠溶液制成每1mL中含1 BP单位的溶液。
(2)标准品溶液的制备:取1000 IU/ml的尿激酶标准品,用0.9%氯化钠溶液制成浓度分别为每lmL中含1000,800,600,400,200尿激酶单位的溶液。
(3)供试品溶液的制备取本品适量,加0.9%氯化钠溶液使溶解并稀释成标准曲线范围内的浓度。
(4)测定法取纤维蛋白原溶液39mL,置烧杯中,边搅拌边加入55℃琼脂糖溶液39mL、凝血酶溶液3mL,立即混匀,快速倒入直径14cm塑料培养皿中,室温水平放置1小时,打孔。精密量取不同浓度的尿激酶标准品溶液及供试品溶液各10微升 ,分别点在同一平皿中,加盖,置37℃恒温箱中反应18小时。取出后用卡尺测量溶圈垂直两直径,以蚓激酶标准品单位数的对数为横坐标,垂直两直径乘积的对数为纵坐标,计算回归方程,将供试品垂直两直径乘积的对数代人回归方程,计算供试品效价单位数。标准品与供试品应各做两点,以平均值计算。
Claims (6)
1.一种包含红曲废弃菌丝体和玉米粗原料的培养基,其特征在于,所述培养基中红曲废弃菌丝体水解液占培养基总体积的5%~50%、玉米粗原料5~30g/L、无机盐0.01~1 g/L;
所述红曲废弃菌丝体水解液的获得方法为:首先滤出红曲发酵液中的菌体,将过滤得到的菌体配置成浓度为8g/L~35g/L的菌体液,然后再用酸性纤维素酶和复合酶水解;水解的pH值为4.0~4.5,水解温度为35~55℃,水解时间控制在24~72h;水解完成后用KOH将水解液pH调制6.5~7.5;所述复合酶为由中性蛋白酶和葡聚糖酶按照1:1进行复合而成。
2.根据权利要求1所述的一种包含红曲废弃菌丝体和玉米粗原料的培养基,其特征在于,所述无机盐包括钙盐、钾盐、镁盐、磷酸盐、硫酸盐中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的一种包含红曲废弃菌丝体和玉米粗原料的培养基,其特征在于,所述酸性纤维素酶和复合酶的用量比例关系为2:1。
4.权利要求1-3中任意一项所述的培养基在培养纳豆激酶生产菌中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,将纳豆激酶生产菌接种到包含红曲废弃菌丝体和玉米粗原料的培养基中,发酵温度在25 ℃~40 ℃,发酵20 h~72 h。
6.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述的纳豆激酶生产菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CGMCC No.13932,接种量控制在2%-10%。
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