CN108676747A - 一种包含红曲废弃菌丝体和玉米粗原料的培养基及其在培养纳豆激酶生产菌中的应用 - Google Patents
一种包含红曲废弃菌丝体和玉米粗原料的培养基及其在培养纳豆激酶生产菌中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108676747A CN108676747A CN201810505997.4A CN201810505997A CN108676747A CN 108676747 A CN108676747 A CN 108676747A CN 201810505997 A CN201810505997 A CN 201810505997A CN 108676747 A CN108676747 A CN 108676747A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture medium
- red yeast
- yeast rice
- mycelium
- raw materials
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title claims abstract description 47
- 108010073682 nattokinase Proteins 0.000 title claims abstract description 46
- 229940086319 nattokinase Drugs 0.000 title claims abstract description 45
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 37
- 229940026314 red yeast rice Drugs 0.000 title claims abstract description 37
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 239000002994 raw material Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 title claims abstract description 26
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 title claims abstract description 26
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 title claims abstract description 26
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 34
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 34
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 15
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims abstract description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims abstract description 11
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 20
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 8
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 claims description 8
- 244000113306 Monascus purpureus Species 0.000 claims description 8
- 235000002322 Monascus purpureus Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 5
- 229940057059 monascus purpureus Drugs 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 101000693530 Staphylococcus aureus Staphylokinase Proteins 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 108010001682 Dextranase Proteins 0.000 claims description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims 1
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 claims 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 claims 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 abstract description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 abstract description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 7
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000002921 fermentation waste Substances 0.000 abstract description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 10
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 9
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000228347 Monascus <ascomycete fungus> Species 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 8
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 7
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 7
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 6
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 6
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 5
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 5
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 3
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 3
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 3
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 3
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 3
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 3
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 235000013557 nattō Nutrition 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N (2s)-4-hydroxy-2-(propylamino)butanoic acid Chemical compound CCCN[C@H](C(O)=O)CCO DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,4r,5r,6s)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,4r,5r,6s)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1[C@@H](CO)O[C@@H](OC2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 241000726221 Gemma Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L Phosphate ion(2-) Chemical compound OP([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 150000001615 biotins Chemical class 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- KCIDZIIHRGYJAE-YGFYJFDDSA-L dipotassium;[(2r,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] phosphate Chemical compound [K+].[K+].OC[C@H]1O[C@H](OP([O-])([O-])=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O KCIDZIIHRGYJAE-YGFYJFDDSA-L 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000010977 jade Substances 0.000 description 1
- 108010070324 lumbrokinase Proteins 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种包含红曲废弃菌丝体和玉米粗原料的培养基及其在培养纳豆激酶生产菌中的应用。将发酵产生的红曲废弃菌丝体进行回收，用酸性纤维素酶和复合酶水解成含有还原糖、游离氨基酸和小肽等物质的水解液；再用KOH将水解液pH调制6.5~7.5，最后用中和后的水解液配置纳豆芽孢杆菌发酵培养基。本发明的水解红曲废弃菌丝体和玉米粗原料作为纳豆激酶生产菌发酵原料，为纳豆激酶生产菌提供了丰富的氨基酸碳源，实现了废物再利用，降低了纳豆激酶生产菌培养基的成本；纳豆激酶生产菌在其发酵培养基中生长良好，显著降低了发酵法生产红曲过程中发酵废弃物的处理量，不仅提升了菌体的培养效果，而且大大提高其附加值。
Description
技术领域
本发明涉及纳豆激酶生产菌发酵培养技术领域，具体涉及一种利用玉米粗原料发酵红曲废弃菌丝体培养纳豆激酶生产菌的方法和应用。
背景技术
在发酵培养基中，作为培养生产红曲色素的主要碳源有葡萄糖、麦芽糖、果糖等。为了适应不同行业对红曲霉产红曲色素的需求，需要寻找更廉价、可再生的培养基原料以降低生产成本。玉米粗原料不仅可以一种全新的碳源为培养基提供营养，而且相比葡萄糖等原料价格更低，是作为一种用于红曲霉生物合成红曲色素的理想原料，兼具经济性和环保价值。
在利用红曲霉发酵产红曲色素时，红曲霉在液体培养基中呈现菌丝体的形态，胞外的水溶性红曲色素在发酵时直接溶于液体培养基中，而胞内的脂溶性红曲色素则由菌丝体通过乙醇萃取而得。在红曲色素提取完成之后，通常会将红曲菌丝体作为废弃物处理。目前红曲霉液态发酵菌丝体的开发应用较少，主要被用来提取壳聚糖、食品生产添加物以及动物饲料等方面，而将红曲废弃菌丝体进一步处理作为培养基的成分目前还没有被报道。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种包含红曲废弃菌丝体和玉米粗原料的培养基及其在培养纳豆激酶生产菌中的应用，满足现代产业高效培养纳豆激酶生产菌的需求。
一种包含红曲废弃菌丝体和玉米粗原料的培养基，所述培养基中红曲废弃菌丝体水解液占培养基总体积的5%~50%、玉米粗原料5~30g/L、无机盐0.01~1 g/L。
所述红曲废弃菌丝体水解液的获得方法为：首先滤出红曲发酵液中的菌体，将过滤得到的菌体配置成浓度为8g/L~35g/L的菌体液，然后再用酸性纤维素酶和复合酶水解；水解的pH值为4.0~4.5，水解温度为35~55℃，水解时间控制在24~72h；水解完成后用KOH将水解液pH调制6.5~7.5。
一种包含红曲废弃菌丝体和玉米粗原料的培养基，首先滤出红曲发酵液中的菌体，再将菌丝体进行回收，用酸性纤维素酶和复合酶水解成含有还原糖、游离氨基酸和小肽等物质的水解液；再用KOH将水解液pH调制6.5~7.5，最后用中和后的水解液配置纳豆激酶生产菌发酵培养基。
进一步的，将过滤得到的菌体配置成浓度为8g/L~35g/L的废弃菌体液，然后再用酸性纤维素酶和复合酶以2:1的配比进行水解，其中复合酶是由中性蛋白酶和葡聚糖酶按照1:1进行复合；所述的pH值的条件为4.0~4.5，温度条件为35~55℃，水解时间控制在24~72h。
进一步的，所述红曲废弃菌丝体水解液占纳豆芽孢杆菌发酵培养基总体积的5%~20%。
进一步的，所述的纳豆激酶生产菌发酵液中还包括一些辅助因子，所述辅助因子为玉米粗原料、氯化钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁和生物素等多钟组合。进一步优选为，所述培养基中红曲废弃菌丝体水解液占培养基总体积的5%~50%、玉米粗原料5~30g/L、无机盐0.01~1g/L依次加入水中，搅拌均匀，然后在121℃下维持20min进行灭菌处理，再降温至20~35℃，配置而成。
进一步的，所述的纳豆激酶生产菌采用枯草芽杆菌(Bacillus subtilis)CGMCCNo.13932，所述的纳豆激酶生产菌在所述的生产菌发酵培养基中的接种量控制在2%-10%，发酵温度在25 ℃~40 ℃，发酵20 h~72 h。
本发明的水解红曲废弃菌丝体和玉米粗原料作为纳豆激酶生产菌发酵原料，为纳豆激酶生产菌提供了丰富的氨基酸碳源，实现了废物再利用，降低了纳豆激酶生产菌培养基的成本；纳豆激酶生产菌在其发酵培养基中生长良好，显著降低了发酵法生产红曲过程中发酵废弃物的处理量，不仅减少环境污染，而且大大提高其附加值。
废弃的红曲菌丝体经过水解后会产生大量的还原糖和氨基酸成分，通常，纳豆激酶生产菌的发酵基质主要以黄豆为主，其培养方法多基于日本纳豆发酵工艺，培养基成分中主要添加了葡萄糖、蔗糖、胰蛋白胨以及各种氨基酸和小肽等，然而现有的培养纳豆激酶生产菌的培养基中所需的氨基酸和小肽的含量较多，成分较为复杂，如果将废弃红曲菌丝体的水解液作为纳豆激酶生产菌培养基的成分，同时将玉米粗原料作为培养基中的碳源，不仅可以实现废物再利用，降低纳豆激酶生产菌培养基的成本，而且可以为发酵基质提供更多更丰富碳源和氮源。
有益效果：与传统液体发酵培养基相比，本发明添加的红曲废弃菌丝体和玉米粗原料培养基发酵生产纳豆激酶活性高，同时成本大幅度降低。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中所采用的红曲发酵液是在葡萄糖4.5%（w/v），大豆蛋白胨8%（w/v），KH2PO4 0.7%（w/v），CaCl2 0.001%（w/v），余量为蒸馏水的培养基下，接种10-20%（v/w）的红曲菌，再通过180r/min、30℃条件下发酵一周左右时间得到的。其中所述的红曲菌菌种为紫色红曲菌BNCC189220 (Monasucs purpureus BNCC189220)，购自北纳生物。
以下实施例中所采用的纳豆激酶生产菌为枯草芽杆菌(Bacillus subtilis)CGMCCNo.13932，来自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
实施例1
将100L红曲发酵液通过6000rpm 离心15min后过滤发酵液，得到红曲废弃菌丝体，红曲废弃菌丝体的初始pH值为4.98，将pH调节成4.0~4.5，用酸性纤维素酶（100U/g，诺维信中国投资有限公司）和复合酶（中性蛋白酶60000U/g、β-葡聚糖2000U/g，大连美仑生物技术有限公司，两者按1:1复合）按照2:1的比例共同水解成含有还原糖、游离氨基酸和小肽等物质的水解液；最佳水解温度为37℃和水解时间为24h，再用KOH溶液将水解液pH调制6.5~7.5，最后用中和后的水解液配置纳豆芽孢杆菌发酵培养基。
按照质量比取各原料备用，其中红曲废弃菌丝体水解液占培养基总体积的20%，玉米粗原料15g/L、氯化钙0.3g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L、硫酸镁0.1 g/L、生物素0.03g/L依次加入水中，搅拌均匀，在121℃下维持20min进行灭菌处理，再降温至20~35℃，制得纳豆激酶生产菌发酵培养基。
以下通过对照组实验，说明本发明对于纳豆激酶生产菌的可行性及其效果。
对照组：发酵培养基采用葡萄糖15g/L、氯化钙0.3g/L、磷酸二氢钾0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L、硫酸镁0.1 g/L、甘氨酸5g/L、丙氨酸5g/L、组氨酸5g/L、天冬氨酸5 g/L、亮氨酸5 g/L、大豆蛋白肽1.5 g/L生物素0.03 g/L，其余为水。
本实施例和对照组发酵工艺均按照如下步骤：将处于对数生长期的枯草芽杆菌CGMCCNo.13932按照5%（体积比）比例的接种量接入对照培养基和本实施例中的发酵培养基，在pH7.4，温度30℃，转速180rpm，接种量为8%的条件下发酵72 h。然后选择600 nm测其OD（光密度，optical density）值。两组发酵培养基中纳豆激酶生产菌生长情况见表1。结论：本实施例和对照组培养3天后，含有玉米粗原料和红曲废弃菌丝体培养基的菌体培养效果明显高于培养基中仅含有葡萄糖的对照组，相比于对照组，其OD值增长了42%，枯草芽孢杆菌浓度增长效果显著；入装液量为80mL发酵液/500mL三角瓶，25℃~40℃温度下培养，转速为180rpm。发酵3天后CGMCCNo.13932的发酵液产纳豆激酶为16279.8 IU/ml（采用琼脂糖-纤维平板法检测纳豆激酶活性），较对照组的8965.5 IU/ml相比，纳豆激酶产量提高了81.6%。
实施例2
所述的枯草芽杆菌（Bacillus subtilis）液态培养：
液态培养基组成：大豆蛋白胨占培养基总体积的20%，玉米粗原料15g/L、氯化钙0.3g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L、硫酸镁0.1 g/L、生物素0.03g/L依次加入水中，搅拌均匀，中和pH定容后在121℃下维持20min进行灭菌处理，再降温至20~35℃，配置而成。
对照组的液态培养组成：（同实施例1）
在pH7.4，温度30℃，转速180rpm，接种量为8%的条件下发酵72 h，并在600 nm测其OD（光密度，optical density）值。两组发酵培养基中纳豆激酶生产菌生长情况见下表1。结论：本实施例和对照组培养3天后，含有玉米粗原料培养基的培养效果明显高于对照组，其OD值增长了14.6%，枯草芽孢杆菌浓度有所增长；入装液量为80mL发酵液/500mL三角瓶，25℃~40℃温度下培养，转速为180rpm。发酵3天后CGMCCNo.13932的发酵液产纳豆激酶为9986.9 IU/ml（采用琼脂糖-纤维平板法检测纳豆激酶活性），较对照组的8965.5 IU/ml相比，纳豆激酶产量提高了11.4%。
实施例3
所述的枯草芽杆菌（Bacillus subtilis）液态培养:
液态培养基组成：红曲废弃菌丝体水解液占培养基总体积的20%，葡萄糖15g/L、氯化钙0.3g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L、硫酸镁0.1 g/L、生物素0.03g/L依次加入水中，搅拌均匀，中和pH定容后在121℃下维持20min进行灭菌处理，再降温至20~35℃，配置而成。
对照组的液态培养组成：（同实施例1）
在25 ℃~40 ℃温度下，200rpm发酵培养3天，并600 nm测其OD（光密度，opticaldensity）值。两组发酵培养基中纳豆激酶生产菌生长情况见下表1。1结论：本实施例和对照组培养3天后，含有红曲废弃菌丝体水解液培养基的培养效果明显高于对照组，其OD值增长了17.2%，枯草芽孢杆菌浓度有所增长；入装液量为80mL发酵液/500mL三角瓶，25℃~40℃温度下培养，转速为180rpm。发酵3天后CGMCCNo.13932的发酵液产纳豆激酶为9823.7 IU/ml（采用琼脂糖-纤维平板法检测纳豆激酶活性），较对照组的8965.5 IU/ml相比，纳豆激酶产量提高了9.6%。
实施例4
所述的枯草芽杆菌（Bacillus subtilis）液态培养：
液态培养基组成：未处理的红曲废弃菌丝占培养基总体积的20%，葡萄糖15g/L、氯化钙0.3g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L、硫酸镁0.1 g/L、生物素0.03g/L依次加入水中，搅拌均匀，中和pH定容后在121℃下维持20min进行灭菌处理，再降温至20~35℃，配置而成。
对照组的液态培养组成：（同实施例1）
在25 ℃~40 ℃温度下，200rpm发酵培养3天，并600 nm测其OD（光密度，opticaldensity）值。两组发酵培养基中纳豆激酶生产菌生长情况见下表1。1结论：本实施例和对照组培养3天后，含有未处理的红曲废弃菌丝培养基的培养效果略高于对照组，其OD值增长了8.9%，枯草芽孢杆菌浓度有所增长；入装液量为80mL发酵液/500mL三角瓶，25℃~40℃温度下培养，转速为180rpm。发酵3天后CGMCCNo.13932的发酵液产纳豆激酶为9643.2 IU/ml（采用琼脂糖-纤维平板法检测纳豆激酶活性），较对照组的8965.5 IU/ml相比，纳豆激酶产量提高了7.6%。
表1
| 发酵时间 | 对照组 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 |
| 培养1天 | 8.5 | 10.4 | 8.6 | 8.8 | 8.6 |
| 培养2天 | 15.7 | 20.15 | 18.26 | 19.6 | 16.2 |
| 培养3天 | 18.5 | 26.31 | 21.67 | 22.35 | 20.3 |
| 纳豆激酶IU/ml | 8965.5 | 16279.8 | 9986.9 | 9823.7 | 9643.2 |
通过成本核验，利用普通培养基制备纳豆激酶生产菌时，每升的培养基的生产成本为10~15元/公斤，所需葡萄糖、各类氨基酸和小肽为20~200g；而将红曲废弃菌丝体和玉米粗原料作为碳源和氮源代替上述材料时生产成本为2~3元/公斤，仅占现有技术成本的五分之一左右，大大节约了企业投入，提高了企业净收入，同时将红曲菌丝体废物进行进一步利用，减少了资源浪费。
最后，还需要注意的是，以上列举仅是本发明几个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
酶活检测方法：
(1)试剂0．01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7．8)取磷酸氢二钠3．58g，加水使溶解并稀释至1000mL为A液；取磷酸二氢(NaH2PO4·2H20)0．78g，加水使溶解并稀释至500mL为液；将A、B两液混合至pH值为7.8。工作溶液取0．01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7．8)与0．9％氯化钠溶液(1：17)混合。1,5％琼脂糖溶液取琼脂糖1.5g，加工作溶液100mL加热溶解。纤维蛋白原溶液取纤维蛋白原适量，加工作溶液制成每lmL中含1.5mg的可凝蛋白溶液。凝血酶溶液取凝血酶，加0.9％氯化钠溶液制成每1mL中含1 BP单位的溶液。
(2)标准品溶液的制备：取1000 IU/ml的尿激酶标准品，用0.9％氯化钠溶液制成浓度分别为每lmL中含1000，800，600，400，200尿激酶单位的溶液。
(3)供试品溶液的制备取本品适量，加0．9％氯化钠溶液使溶解并稀释成标准曲线范围内的浓度。
(4)测定法取纤维蛋白原溶液39mL，置烧杯中，边搅拌边加入55℃琼脂糖溶液39mL、凝血酶溶液3mL，立即混匀，快速倒入直径14cm塑料培养皿中，室温水平放置1小时，打孔。精密量取不同浓度的尿激酶标准品溶液及供试品溶液各10微升 ，分别点在同一平皿中，加盖，置37℃恒温箱中反应18小时。取出后用卡尺测量溶圈垂直两直径，以蚓激酶标准品单位数的对数为横坐标，垂直两直径乘积的对数为纵坐标，计算回归方程，将供试品垂直两直径乘积的对数代人回归方程，计算供试品效价单位数。标准品与供试品应各做两点，以平均值计算。
Claims (8)
1.一种包含红曲废弃菌丝体和玉米粗原料的培养基，其特征在于，所述培养基中红曲废弃菌丝体水解液占培养基总体积的5%~50%、玉米粗原料5~30g/L、无机盐0.01~1 g/L。
2.根据权利要求1所述的一种包含红曲废弃菌丝体和玉米粗原料的培养基，其特征在于，所述红曲废弃菌丝体水解液的获得方法为：首先滤出红曲发酵液中的菌体，将过滤得到的菌体配置成浓度为8g/L~35g/L的菌体液，然后再用酸性纤维素酶和复合酶水解；水解的pH值为4.0~4.5，水解温度为35~55℃，水解时间控制在24~72h；水解完成后用KOH将水解液pH调制6.5~7.5。
3.根据权利要求1所述的一种包含红曲废弃菌丝体和玉米粗原料的培养基，其特征在于，所述无机盐包括钙盐、钾盐、镁盐、磷酸盐、硫酸盐中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的一种包含红曲废弃菌丝体和玉米粗原料的培养基，其特征在于，所述酸性纤维素酶和复合酶的用量比例关系为2:1。
5.根据权利要求2所述的一种包含红曲废弃菌丝体和玉米粗原料的培养基，其特征在于，所述复合酶为由中性蛋白酶和葡聚糖酶按照1:1进行复合而成。
6.权利要求1-5中任意一项所述的培养基在培养纳豆激酶生产菌中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将纳豆激酶生产菌接种到包含红曲废弃菌丝体和玉米粗原料的培养基中，发酵温度在25 ℃~40 ℃，发酵20 h~72 h。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的纳豆激酶生产菌为枯草芽杆菌(Bacillus subtilis) CGMCCNo.13932，接种量控制在2%-10%。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810505997.4A CN108676747B (zh) | 2018-05-24 | 2018-05-24 | 一种包含红曲废弃菌丝体和玉米粗原料的培养基及其在培养纳豆激酶生产菌中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810505997.4A CN108676747B (zh) | 2018-05-24 | 2018-05-24 | 一种包含红曲废弃菌丝体和玉米粗原料的培养基及其在培养纳豆激酶生产菌中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108676747A true CN108676747A (zh) | 2018-10-19 |
| CN108676747B CN108676747B (zh) | 2021-08-20 |
Family
ID=63808101
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810505997.4A Active CN108676747B (zh) | 2018-05-24 | 2018-05-24 | 一种包含红曲废弃菌丝体和玉米粗原料的培养基及其在培养纳豆激酶生产菌中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108676747B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116064489A (zh) * | 2023-04-03 | 2023-05-05 | 内蒙古金达威药业有限公司 | 一种纳豆激酶的制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1273274A (zh) * | 2000-05-22 | 2000-11-15 | 北京市孚曼生物技术研究所 | 纳豆激酶的生产方法及其用途 |
| CN107099487A (zh) * | 2017-06-27 | 2017-08-29 | 南京工业大学 | 一种高分泌纳豆激酶的枯草芽孢杆菌及其应用 |
| CN107254423A (zh) * | 2017-07-03 | 2017-10-17 | 成都市农林科学院 | 一种纳豆激酶菌剂的制备及使用方法 |
-
2018
- 2018-05-24 CN CN201810505997.4A patent/CN108676747B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1273274A (zh) * | 2000-05-22 | 2000-11-15 | 北京市孚曼生物技术研究所 | 纳豆激酶的生产方法及其用途 |
| CN107099487A (zh) * | 2017-06-27 | 2017-08-29 | 南京工业大学 | 一种高分泌纳豆激酶的枯草芽孢杆菌及其应用 |
| CN107254423A (zh) * | 2017-07-03 | 2017-10-17 | 成都市农林科学院 | 一种纳豆激酶菌剂的制备及使用方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 史旭东等: "纳豆菌I液体发酵生产纳豆激酶最佳培养基的筛选", 《齐齐哈尔大学学报》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116064489A (zh) * | 2023-04-03 | 2023-05-05 | 内蒙古金达威药业有限公司 | 一种纳豆激酶的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108676747B (zh) | 2021-08-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN100392092C (zh) | 大豆肽生产方法 | |
| CN102994605B (zh) | 一种通过酶解和微生物发酵生产高效生物肽的方法 | |
| CN107022493B (zh) | 一种高产饲用复合酶的米曲霉菌株及其应用 | |
| CN103409347B (zh) | 一种产碱性蛋白酶的菌株及其工业化液体发酵方法 | |
| CN110229852B (zh) | 一种利用大豆蛋白酶解物发酵生产γ-聚谷氨酸的方法 | |
| CN106244658B (zh) | 一种甘薯蛋白多肽的制备方法 | |
| CN101671703B (zh) | 一种提高ε-聚-L-赖氨酸产量的新方法 | |
| CN106754508A (zh) | 一株枯草芽孢杆菌菌株及其在酱油发酵增香中的应用 | |
| CN109439601A (zh) | 一株产蛋白酶的菌株及其制备碱性蛋白酶的方法 | |
| CN111517860A (zh) | 富含海藻活性寡糖的植物营养剂及其制备方法 | |
| CN115058355B (zh) | 一株耐热且高产蛋白酶的蜡状芽孢杆菌sh-831及其应用 | |
| CN108719991B (zh) | 一种利用豆渣和豆腐黄浆水制备含有纳豆菌的红曲的方法 | |
| CN113817635A (zh) | 一种利用大豆乳清废水培养芽孢杆菌的方法 | |
| CN116656565B (zh) | 一种地衣芽孢杆菌及其应用 | |
| CN108676747A (zh) | 一种包含红曲废弃菌丝体和玉米粗原料的培养基及其在培养纳豆激酶生产菌中的应用 | |
| CN110747188B (zh) | 一种生产角蛋白酶的方法 | |
| CN102392008B (zh) | 一种可替代蛋白质原料的生物蛋白及其生产方法 | |
| CN105175275B (zh) | 一种l‑鸟氨酸的分离纯化方法 | |
| CN106173187A (zh) | 一种含有蛋白酶活力的植物蛋白水解物的制备方法与应用 | |
| CN1683520A (zh) | 一株产复合酶的菌株及用该菌株发酵生产复合酶的方法 | |
| CN108949731A (zh) | 一种提高碱性蛋白酶发酵活力的生产方法 | |
| CN105002228B (zh) | 一种以精氨酸为原料制备l-鸟氨酸的方法 | |
| CN110777096B (zh) | 一株高产热稳定胰蛋白酶的链霉菌及其应用 | |
| CN104830718B (zh) | S-8菌及其灭活大豆抗营养因子的工艺方法 | |
| CN110747128A (zh) | 一株高产角蛋白酶的地衣芽孢杆菌菌株及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |