CN116064489A - 一种纳豆激酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于纳豆激酶生产领域,涉及一种纳豆激酶的制备方法,该方法包括在纳豆激酶的发酵过程中,通过电导率协同游离氨基氮和/或CO2释放率协同游离氨基氮浓度反馈并控制工艺过程,电导率控制在0.5~20.0mS/cm,CO2释放率控制在0.5%~15.0%,游离氨基氮浓度控制在0.2~11.0g/L。本发明通过电导率协同游离氨基氮和/或CO2释放率协同游离氨基氮浓度来反馈调控纳豆激酶的发酵生产,达到满足菌体生长需求,有效提高纳豆激酶生产水平,提高底物转化率,降低生产成本。
Description
技术领域
本发明属于纳豆激酶生产领域,具体涉及一种纳豆激酶的制备方法。
背景技术
纳豆激酶具有溶栓性、半衰期长、特异性强和副作用小等优点,被作为膳食补充剂在美国、加拿大和欧洲等地销售,市场潜力巨大。目前纳豆激酶的生产主要采用微生物发酵法,包括固体发酵法和液体发酵法,所得产物具备生物活性高和易于吸收等优点。固体发酵法发酵过程条件不易控制,生产水平不稳定,不易大规模生产发酵。液体发酵法能够很好地避免此类问题。但目前液体发酵法发酵产量偏低,难以达到工业化生产的要求。
目前报道液体发酵生产纳豆激酶主要通过溶氧及经验补料对生产工艺控制进行优化,为菌体生产纳豆激酶提供良好环境,从而提高生产水平。如专利CN111019861A和CN108410847A所报道的,将溶氧值控制20%~50%,通过一些单因素实验确定溶氧相对较优的控制范围。溶氧是供氧与菌体耗氧后的综合指标,纳豆激酶发酵过程物料相对较粘稠,溶氧发生变化时不能实时反应菌体真正的呼吸及代谢强度,工艺控制存在滞后及误导等问题。
目前报道的补料多为常规的碳源和氮源,且仅根据经验进行补加。如专利CN112553235A和专利CN104630124A将发酵补料分别于发酵12h和16h后以一定流速恒速补加。一次性补加或者恒速补加等方法都不能很好地将营养利用率发挥到最大化,容易出现营养补给不足或者过剩等问题。
综上,现有报道的生产工艺在一定程度上受菌种和原料波动的影响,容易出现生产水平不稳定及底物转化率低等问题。
发明内容
本发明的目的在于解决采用现有的方法生产纳豆激酶时转化率低的问题,而提供一种新的纳豆激酶的制备方法,该方法通过建立在线监测发酵过程电导率和/或CO2释放率并协同游离氨基氮浓度的手段来反馈调控纳豆激酶发酵生产,从而达到满足菌体生长需求,有效提高纳豆激酶的生产水平,提高底物转化率,降低生产成本。
具体地,本发明提供了一种纳豆激酶的制备方法,其中,该方法包括在纳豆激酶的发酵过程中,通过电导率协同游离氨基氮浓度和/或CO2释放率协同游离氨基氮浓度反馈并控制工艺过程,电导率控制在0.5~20.0mS/cm,CO2释放率控制在0.5%~15.0%,游离氨基氮浓度控制在0.2~11.0g/L。
在一种优选实施方式中,采用如下方式通过电导率协同游离氨基氮浓度反馈并控制工艺过程:
在发酵培养0~8h期间,将电导率控制在2.0~20.0mS/cm,同时将游离氨基氮浓度控制在1.0~7.5g/L;
在发酵培养8~16h期间,将电导率控制在1.0~8.0mS/cm,同时将游离氨基氮浓度控制在5.5~10.0g/L;
在发酵培养16h~发酵结束,将电导率控制在0.5~6.0mS/cm,同时将游离氨基氮浓度控制在0.2~7.5g/L。
在一种优选实施方式中,采用如下方式通过CO2释放率协同游离氨基氮浓度反馈并控制工艺过程:
在发酵培养0~8h期间,将CO2释放率控制在0.5%~8.0%,同时将游离氨基氮浓度控制在0.2~8.0g/L;
在发酵培养8~16h期间,将CO2释放率控制在6.0%~15.0%,同时将游离氨基氮浓度控制在4.0~10.0g/L;
在发酵培养16h~发酵结束,将CO2释放率控制在1.0%~8.0%,同时将游离氨基氮浓度控制在0.5~8.0g/L。
在一种优选实施方式中,采用如下方式通过电导率和CO2释放率协同游离氨基氮浓度反馈并控制工艺过程:
在发酵培养0~8h期间,将电导率控制在2.0~20.0mS/cm,将CO2释放率控制在0.5%~8.0%,同时将游离氨基氮浓度控制在0.2~9.0g/L;
在发酵培养8~16h期间,将电导率控制在1.0~8.0mS/cm,将CO2释放率控制在6.0%~15.0%,同时将游离氨基氮浓度控制在3.0~11.0g/L;
在发酵培养16h~发酵结束,将电导率控制在0.5~6.0mS/cm,将CO2释放率控制在1.0%~8.0%,同时将游离氨基氮浓度控制在0.2~9.0g/L。
在一种优选实施方式中,所述电导率通过调整无机盐和/或氮源的补加量进行控制,和/或,通过调整转速、通气比和罐压中的至少一者进行控制。
在一种优选实施方式中,所述CO2释放率和游离氨基氮浓度通过调整氮源的补加量进行控制,和/或,通过调整转速、通气比和罐压中的至少一者进行控制。
在一种优选实施方式中,所述无机盐选自硫酸镁、硫酸铜、硫酸锰、氯化锌和氯化钙中的至少一种。
在一种优选实施方式中,所述无机盐的浓度为1%~15%。
在一种优选实施方式中,所述氮源选自黄豆豆粕、花生豆粕、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、硫酸铵、氯化铵和硝酸铵中的至少一种。
在一种优选实施方式中,所述氮源的浓度为1%~15%。
在一种优选实施方式中,所述转速为50~800rpm,所述通气比为0.3~2.5 VVM,所述罐压为0.02~0.08 MPa。
在一种优选实施方式中,所述纳豆激酶的发酵所采用的菌株为枯草芽孢杆菌(
Bacillus subtilis)和/或纳豆芽孢杆菌(
Bacillus natto)。
本发明的发明人经过深入且广泛研究之后惊奇地发现,电导率和/或CO2释放率协同游离氨基氮浓度能够很好地反映纳豆激酶的发酵过程变化,通过电导率协同游离氨基氮浓度和/或CO2释放率协同游离氨基氮浓度来反馈调控纳豆激酶的发酵生产,可以充分满足菌体生长需求,有效提高纳豆激酶生产水平,提高底物转化率,降低生产成本。此外,本发明提供的纳豆激酶的制备方法稳定且通用性强,不受原料、发酵规模、菌种等生产条件波动的影响,应用前景广泛。
具体实施方式
本发明提供的纳豆激酶的制备方法通过电导率协同游离氨基氮浓度和/或CO2释放率协同游离氨基氮浓度反馈并控制发酵过程,电导率控制在0.5~20.0mS/cm(如0.5、1、2、5、8、10、12、15、18、20mS/cm或它们之间的任意值),CO2释放率控制在0.5%~15.0%(如0.5%、1%、2%、5%、8%、10%、12%、15%或它们之间的任意值),游离氨基氮浓度控制在0.2~11.0g/L(如0.2、0.5、1、2、5、8、10、11g/L或它们之间的任意值)。具体地,将电导率控制在0.5~20.0mS/cm,同时将游离氨基氮浓度控制在0.2~11.0g/L;或者,将CO2释放率控制在0.5%~15.0%,同时将游离氨基氮浓度控制在0.2~11.0g/L;或者,将电导率控制在0.5~20.0mS/cm,将CO2释放率控制在0.5%~15.0%,同时将游离氨基氮浓度控制在0.2~11.0g/L。
在本发明的一种优选实施方式中,当采用电导率协同游离氨基氮反馈并控制工艺过程时,在发酵培养0~8h期间,将电导率控制在2.0~20.0mS/cm,同时将游离氨基氮浓度控制在1.0~7.5g/L;在发酵培养8~16h期间,将电导率控制在1.0~8.0mS/cm,同时将游离氨基氮浓度控制在5.5~10.0g/L;在发酵培养16h~发酵结束,将电导率控制在0.5~6.0mS/cm,同时将游离氨基氮浓度控制在0.2~7.5g/L,此时更有利于提高菌体合成纳豆激酶,能够进一步提高底物利用率,降低发酵成本。
在本发明的一种优选实施方式中,当采用CO2释放率协同游离氨基氮浓度反馈并控制工艺过程时,在发酵培养0~8h期间,将CO2释放率控制在0.5%~8.0%,同时将游离氨基氮浓度控制在0.2~8.0g/L;在发酵培养8~16h期间,将CO2释放率控制在6.0%~15.0%,同时将游离氨基氮浓度控制在4.0~10.0g/L;在发酵培养16h~发酵结束,将CO2释放率控制在1.0%~8.0%,同时将游离氨基氮浓度控制在0.5~8.0g/L,此时更有利于提高纳豆激酶发酵水平及底物转化率。
在本发明的一种优选实施方式中,当采用电导率和CO2释放率协同游离氨基氮浓度反馈并控制工艺过程时,在发酵培养0~8h期间,将电导率控制在2.0~20.0mS/cm,将CO2释放率控制在0.5%~8.0%,同时将游离氨基氮浓度控制在0.2~9.0g/L;在发酵培养8~16h期间,将电导率控制在1.0~8.0mS/cm,将CO2释放率控制在6.0%~15.0%,同时将游离氨基氮浓度控制在3.0~11.0g/L;在发酵培养16h~发酵结束,将电导率控制在0.5~6.0mS/cm,将CO2释放率控制在1.0%~8.0%,同时将游离氨基氮浓度控制在0.2~9.0g/L,此时能够极为精准地反馈纳豆激酶合成菌体的活力,纳豆激酶发酵水平能够达到最佳状态,底物转化率更高。
以上三种优选实施方式均分三阶段(即0~8h、8~16h、16h~发酵结束)对电导率和/或CO2释放率以及游离氨基氮浓度进行控制。需要说明的是,0~8h包括第1h、第2h、第3h、第4h、第5h、第6h、第7h、第8h共8h,8~16h包括第9h、第10h、第11h、第12h、第13h、第14h、第15h、第16h共8h,16h~发酵结束包括第17h、第18h……发酵结束。
在本发明中,所述电导率通过电导率电极实时在线监测。
在本发明中,所述CO2释放率是指发酵过程排出尾气中CO2的浓度(%),其通过质谱仪实时在线监测。
在本发明中,所述游离氨基氮是指发酵体系内以氨基酸形式存在的氮含量,其通过近红外光谱实时在线监测。
所述电导率优选通过调整无机盐和/或氮源的补加量进行控制,和/或,通过调整转速、通气比和罐压中的至少一者进行控制。在一种具体实施方式中,如电导率不在预定范围内,则可以通过调整无机盐和/或氮源的补加量以将其控制在工艺范围内。在实际操作过程中,当电导率无法通过补料控制在工艺范围时,则通过调整转速、通气比和罐压中的至少一者来维持电导率在工艺范围内。在一种具体实施方式中,通过调整无机盐和/或氮源补加量来控制电导率在工艺范围,例如发酵0~8h期间电导率需要控制在2.0~20.0mS/cm,当电导率<2.0mS/cm时,则下调转速、通气比和罐压中的至少一者,当下调后电导率仍<2.0mS/cm时,则说明菌体生长过快,则提高无机盐补加量或者停止或降低氮源补加量。当电导率>20.0mS/cm时,则上调转速、通气比和罐压中的至少一者,如上调后电导率仍然偏高,说明无机盐补入偏多,则停止或者降低无机盐补加量或者提高氮源补加量。其中,所述无机盐的具体实例包括但不限于:硫酸镁、硫酸铜、硫酸锰、氯化锌和氯化钙中的至少一种。所述无机盐的浓度优选为1%~15%。所述氮源的具体实例包括但不限于:黄豆豆粕、花生豆粕、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、硫酸铵、氯化铵和硝酸铵中的至少一种。所述氮源的浓度优选为1%~15%。
所述CO2释放率和游离氨基氮浓度优选通过调整氮源的补加量进行控制,和/或,通过调整转速、通气比和罐压中的至少一者进行控制。在一种具体实施方式中,通过调节转速、通气比和罐压中的至少一者来维持CO2释放率和游离氨基氮浓度在预定范围内,例如发酵0~8h期间需要将CO2释放浓度控制在0.5%~8.0%,当CO2释放浓度<0.5%时,则上调转速、通气比和罐压中的至少一者,当上调后CO2释放浓度仍<0.5%时,则说明游离氨基氮浓度偏低,菌体生长偏慢,需要补加氮源;当CO2释放浓度>8.0%时,则下调转速、通气比和罐压中的至少一者,当下调后CO2释放率仍然偏高,则说明菌体生长过快,说明游离氨基氮浓度偏高,需停止补加或者降低补加氮源。在发酵不同阶段游离氨基氮浓度有上限值控制不同。其中,所述氮源的具体实例包括但不限于:黄豆豆粕、花生豆粕、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、硫酸铵、氯化铵和硝酸铵中的至少一种。所述氮源的浓度优选为1%~15%。
本发明提供的生产工艺适用于能够生产纳豆激酶的菌株,比如枯草芽孢杆菌(
Bacillus subtilis,保藏号为CCTCC:M20211444)、纳豆芽孢杆菌(
Bacillus natto,菌种保藏号为CCTCC:M2012496)等。
本发明提供的纳豆激酶的生产过程包括菌株活化、摇瓶培养、种子罐培养以及发酵培养,各培养阶段对培养基配方没有特殊限制,可以是适用的常规培养基。
在一种具体实施方式中,所述纳豆激酶的制备过程包括以下步骤:
(1)菌株活化:
将平板培养基的pH值调节至4.50~8.50,再于121~123°C灭菌15~35min,之后用接种环从冻存管蘸取一环菌液划线接种于平板培养基中,于25~40°C培养10~40h后获得成熟的单菌落;所述平板培养基配方如下:蛋白胨2~20g/L、氯化钠2~20g/L、黄豆饼粉2~20g/L以及琼脂粉5~30g/L;
(2)摇瓶培养:
将种子培养基的pH值调节至4.50~8.50,再于121~123°C灭菌15~35min,再用接种铲将培养成熟的单菌落接入种子培养基中进行摇瓶培养;所述摇瓶培养基配方如下:蛋白胨2~20g/L、氯化钠2~20g/L以及黄豆饼粉2~20g/L;所述摇瓶培养的条件包括温度25~40°C,转速100~300rpm,时间10~40h,当OD600达2~20时移至种子罐,接种量控制在0.1%~10.0%;
(3)种子罐培养:
将种子罐培养基的pH值调节至5.00~8.50,再于121~123°C灭菌15~35min;所述种子罐培养基配方如下:蛋白胨2~20g/L、氯化钠2~20g/L以及黄豆饼粉2~20g/L;所述种子罐培养的条件包括温度30~45°C,罐压0.02~0.08MPa,通气比0.3~2.5VVM,转速50~800rpm,培养周期10~40h,当OD600达2~20时移至发酵罐,接种量控制在0.1%~20.0%;
(4)发酵培养:
将发酵培养基的pH值调节至4.00~9.00,再于121~123°C灭菌15~35min;所述发酵培养基配方如下:蛋白胨2~20g/L、氯化钠2~20g/L、黄豆饼粉2~40g/L、硫酸锌0.1~10g/L以及磷酸氢二钾0.1~10g/L;所述发酵培养的条件包括温度30~45°C,罐压0.02~0.08 MPa,通气比0.3~2.5 VVM,转速50~800rpm,发酵过程中通过补加碱液以将发酵体系的pH值控制在4.50~5.50,并通过补加碳源以将发酵体系中碳源浓度控制在0.1~25g/L。其中,所述碳源例如可以为葡萄糖和/或甘油。所述碳源通常以浓度为400~800g/L的溶液的形式使用。发酵过程中实时在线监测电导率、游离氨基氮浓度、CO2释放率,根据上述方案将参数控制在规定范围内。一般地,当纳豆激酶合成速率明显下降时作为终止发酵标准,通过纤维蛋白平板法测定过程纳豆激酶含量。具体地,将含有纤维蛋白原和凝血酶的琼脂糖平板进行打孔,并将标准品--尿激酶和样品点入孔内进行反应。用梯度稀释的标准品绘制标准曲线:标准液酶活性为纵坐标,对应平板上反应圈的面积为横坐标。将样品在平板的反应圈面积代入标准曲线得到相应酶活性。此外,所述发酵罐的容积可以为0.5L至500m3。
以下实施例和对比例所采用的枯草芽孢杆菌(
Bacillus subtilis)保藏号为CCTCC:M20211444,纳豆芽孢杆菌(
Bacillus natto)保藏号为CCTCC:M2012496。
实施例1:50L罐发酵生产工艺
(1)菌株活化:用接种环从冻存管蘸取一环纳豆芽孢杆菌(CCTCC:M2012496)菌液划线接种于平板培养基中,于30°C下培养24h,获得成熟的单菌落。所述平板培养基配方:蛋白胨15g/L、氯化钠15g/L、黄豆饼粉10g/L、琼脂粉20g/L,于121°C灭菌25min,灭菌前pH调至8.50。
(2)摇瓶培养:用接种铲将培养成熟的单菌落接入100mL种子培养基中进行摇瓶培养。所述种子培养基配方:蛋白胨15g/L、氯化钠15g/L、黄豆饼粉10g/L,于121°C灭菌25min,灭菌前pH调至8.50。所述摇床培养条件包括温度30°C,转速200rpm。
(3)种子罐培养:当摇瓶培养菌体OD600为3.2时移至种子罐,按0.5%的接种量接入种子罐培养基中进行扩大培养。所述种子罐培养基配方:蛋白胨15g/L、氯化钠15g/L、黄豆饼粉10g/L,于121°C灭菌25min,灭菌前pH调至8.50。所述种子罐培养条件包括温度30°C,罐压0.05MPa,通气比0.6VVM,转速600rpm。
(4)发酵培养:当种子罐培养菌体OD600为10.5时移至容积为50L的发酵罐中进行发酵培养,接后装液量为25L,接种量为3%。所述发酵培养基配方:蛋白胨5g/L、氯化钠5g/L、黄豆饼粉25g/L、硫酸锌2g/L、磷酸氢二钾2g/L,于121°C灭菌25min,灭菌前pH调至4.50。所述发酵培养条件包括温度30°C,罐压0.04MPa,通气比0.6VVM,转速200rpm,发酵过程中通过补加氨水的方式调节发酵液pH于4.50,并补加浓度为500g/L的葡萄糖溶液以将发酵体系中葡萄糖浓度控制在5g/L。
所述发酵过程中实时在线监测电导率和游离氨基氮浓度,通过两者协同反馈控制来实时调控过程工艺控制方式如下:
在发酵培养0~8h期间,将电导率控制在19.9±0.1mS/cm,将游离氨基氮浓度控制在7.4±0.1g/L;
在发酵培养8~16h期间,将电导率控制在5.0±0.1mS/cm,将游离氨基氮浓度控制在6.2±0.1g/L;
在发酵培养16h~发酵结束,将电导率控制在5.9±0.1mS/cm,将游离氨基氮浓度控制在7.2±0.1g/L。
通过调整无机盐、氮源补加量来控制电导率在工艺范围。当电导率无法通过补料控制在范围时则通过调整转速、通气比和罐压中的至少一者来维持电导率在工艺范围内。当电导率低于工艺下限时,下调转速、通气比和罐压中的至少一者,当下调后电导率水平仍低于下限时,则提高无机盐补加量或者停止或降低氮源补加量。当电导率水平高于上限时,则上调转速、通气比和罐压中的至少一者,当上调后电导率仍然偏高,说明无机盐补入偏多,则停止或者降低无机盐补加量或者提高氮源补加量。其中,无机盐补料为硫酸镁,补料配制浓度为2%。氮源补料为玉米浆和硝酸铵按质量比1:1复配,补料配制浓度为2%。
通过调整转速、通气比和罐压中的至少一者来控制游离氨基氮浓度在工艺范围。当游离氨基氮浓度低于工艺下限时,则下调转速、通气比和罐压中的至少一者,当下调后游离氨基氮浓度仍低于下限时,则需要补加氮源或者提高补加氮源流速。当游离氨基氮浓度高于工艺上限时,则上调转速、通气比和罐压中的至少一者,当上调后游离氨基氮浓度仍高于上限时,则停止补加或者降低补加氮源流速。其中,氮源补料为玉米浆和硝酸铵按质量比1:1复配,补料配制浓度为2%。
当纳豆激酶合成速率下降为1200 IU/(mL*h)时终止发酵。使用纤维蛋白平板法(尿激酶作为标准品,下同)测定纳豆激酶活力,发酵终止时纳豆激酶活力达31000IU/mL,转化率达70%。
实施例2:50L罐发酵生产工艺
(1)菌株活化:同实施例1。
(2)摇瓶培养:同实施例1。
(3)种子罐培养:同实施例1。
(4)发酵培养:当种子罐培养菌体OD600为10.3时移至容积为50L的发酵罐中进行发酵培养,接后装液量为25L,接种量为3%。所述发酵培养基配方:蛋白胨5g/L、氯化钠5g/L、黄豆饼粉25g/L、硫酸锌2g/L、磷酸氢二钾2g/L,于122°C灭菌25min,灭菌前pH调至4.50。所述发酵罐培养条件包括温度31°C,罐压0.04MPa,通气比0.5VVM,转速200rpm,发酵过程中通过补加氨水的方式调节发酵液pH于4.50,并补加浓度为400g/L的甘油溶液以将发酵体系中甘油浓度控制在5g/L。
所述发酵过程中实时在线监测发酵液CO2释放率与游离氨基氮浓度,通过两者协同反馈控制来实时调控过程工艺,控制方式如下:
在发酵培养0~8h期间,将CO2释放率控制在4.2%±0.1%,将游离氨基氮浓度控制在4.6±0.1g/L;
在发酵培养8~16h期间,将CO2释放率控制在14.9%±0.1%,将游离氨基氮浓度控制在4.3±0.1g/L;
在发酵培养16h~发酵结束,将CO2释放率控制在4.3%±0.1%,将游离氨基氮浓度控制在5.0±0.1g/L。
通过调节转速、通气比和罐压中的至少一者来控制CO2释放率在工艺范围内。当CO2释放浓度低于下限时,则上调转速、通气比和罐压中的至少一者,当上调后CO2释放浓度仍偏低,则需要补加氮源;当CO2释放浓度高于上限时,则下调转速、通气比和罐压中的至少一者,如下调后CO2释放率仍然偏高,则需停止补加或者降低补加氮源。氮源补料为花生豆粕和硝酸铵按质量比1:1复配,补料配制浓度为5%。
通过调整转速、通气比和罐压中的至少一者来控制游离氨基氮浓度在工艺范围。当游离氨基氮浓度低于工艺下限时,则下调转速、通气比和罐压中的至少一者,当下调后游离氨基氮浓度仍低于下限时,则需要补加氮源或者提高补加氮源流速。当游离氨基氮浓度高于工艺上限时,则上调转速、通气比和罐压中的至少一者,当上调后游离氨基氮浓度仍高于上限时,则停止补加或者降低补加氮源流速。其中,氮源补料为花生豆粕和硝酸铵按质量比1:1复配,补料配制浓度为5%。
当纳豆激酶合成速率下降为1000 IU/(mL*h)时终止发酵。使用纤维蛋白平板法测定产物的活力,发酵终止时纳豆激酶活力达30700IU/mL,转化率达70%。
实施例3:5m3发酵罐发酵生产工艺
(1)菌株活化:用接种环从冻存管蘸取一环枯草芽孢杆菌(CCTCC:M20211444)菌液划线接种于平板培养基中,于30°C下培养24h,获得成熟的单菌落。所述平板培养基配方:蛋白胨15g/L、氯化钠15g/L、黄豆饼粉10g/L、琼脂粉20g/L,于121°C灭菌25min,灭菌前pH调至8.50。
(2)摇瓶培养:用接种铲将培养成熟的单菌落接入100mL种子培养基中进行摇瓶培养。所述种子培养基配方:蛋白胨15g/L、氯化钠15g/L、黄豆饼粉10g/L,于121°C灭菌25min,灭菌前pH调至8.50。所述摇床培养条件包括温度30°C,转速200rpm。
(3)种子罐培养:当摇瓶培养菌体OD600为3.1时移至种子罐,按0.5%的接种量接入种子罐培养基中进行扩大培养。所述种子罐培养基配方:蛋白胨15g/L、氯化钠15g/L、黄豆饼粉10g/L,于121°C灭菌25min,灭菌前pH调至8.50。所述种子罐培养条件包括温度30°C,罐压0.05MPa,通气比0.6VVM,转速600rpm。
(4)发酵培养:当种子罐培养菌体OD600为10.5时移至容积为5m3的发酵罐中进行发酵培养,接后装液量为3m3,接种量为5%。所述发酵培养基配方:蛋白胨5g/L、氯化钠5g/L、黄豆饼粉25g/L、硫酸锌2g/L、磷酸氢二钾2g/L,于121°C灭菌25min,灭菌前pH调至4.80。所述发酵培养条件包括温度32°C,罐压0.04MPa,通气比0.6VVM,转速250rmp,发酵过程中通过补加氨水的方式调节发酵液pH于4.80,并补加浓度为800g/L的葡萄糖溶液以将发酵体系中葡萄糖浓度控制在8g/L。
所述发酵过程中实时在线监测发酵液中电导率与游离氨基氮浓度,通过两者协同反馈控制来实时调控过程工艺,控制方式如下:
在发酵培养0~8h期间,将电导率控制在2.1±0.1mS/cm,将游离氨基氮浓度控制在1.5±0.1g/L;
在发酵培养8~16h期间,将电导率控制在7.9±0.1mS/cm,将游离氨基氮浓度控制在9.9±0.1g/L;
在发酵培养16h~发酵结束,将电导率控制在3.1±0.1mS/cm,将游离氨基氮浓度控制在3.0±0.1g/L。
发酵过程中,电导率以及游离氨基氮浓度反馈调控工艺及补料同实施例1。其中,无机盐补料为硫酸镁和硫酸锰按质量比1:1复配,补料配制浓度为2%。氮源补料为黄豆豆粕和硝酸铵按质量比2:1复配,补料配制浓度为2%。
当纳豆激酶合成速率下降为1250 IU/(mL*h)时终止发酵。使用纤维蛋白平板法测定产物的活力,发酵终止时纳豆激酶活力达31300IU/mL,转化率达73%。
实施例4:5m3发酵罐发酵生产工艺
(1)菌株活化:用接种环从冻存管蘸取一环枯草芽孢杆菌(CCTCC:M20211444)菌液划线接种于平板培养基中,于30°C下培养24h,获得成熟的单菌落。所述平板培养基配方:蛋白胨15g/L、氯化钠15g/L、黄豆饼粉10g/L、琼脂粉20g/L,于121°C灭菌25min,灭菌前pH调至8.50。
(2)摇瓶培养:用接种铲将培养成熟的单菌落接入100mL种子培养基中进行摇瓶培养。所述种子培养基配方:蛋白胨15g/L、氯化钠15g/L、黄豆饼粉10g/L,于121°C灭菌25min,灭菌前pH调至8.50。所述摇床培养条件包括温度30°C,转速200rpm。
(3)种子罐培养:当摇瓶培养菌体OD600为3.0时移至种子罐,按0.5%的接种量接入种子罐培养基中进行扩大培养。所述种子罐培养基配方:蛋白胨15g/L、氯化钠15g/L、黄豆饼粉10g/L,于121°C灭菌25min,灭菌前pH调至8.50。所述种子罐培养条件包括温度30°C,罐压0.05MPa,通气比0.6VVM,转速600rpm。
(4)发酵培养:当种子罐培养菌体OD600为10.5时移至容积为5m3的发酵罐中进行发酵培养,接后装液量为3m3,接种量为1%。所述发酵培养基配方:蛋白胨5g/L、氯化钠5g/L、黄豆饼粉25g/L、硫酸锌2g/L、磷酸氢二钾2g/L,于123°C灭菌20min,灭菌pH调至5.00。所述发酵培养条件包括温度31°C,罐压0.03MPa,通气比0.5VVM,转速200rpm,发酵过程中通过补加氨水的方式调节发酵液pH于5.00,并补加浓度为400g/L的甘油溶液以将发酵体系中甘油浓度控制在5g/L。
所述发酵过程实时在线监测发酵液CO2释放率与游离氨基氮浓度,通过两者协同反馈控制来实时调控过程工艺,控制方式如下:
在发酵培养0~8h期间,将CO2释放率控制在6.2%±0.1%,将游离氨基氮浓度控制在5.6±0.1g/L;
在发酵培养8~16h期间,将CO2释放率控制在6.1%±0.1%,将游离氨基氮浓度控制在9.1±0.1g/L;
在发酵培养16h~发酵结束,将CO2释放率控制在1.1%±0.1%,将游离氨基氮浓度控制在7.8±0.1g/L。
利用CO2释放率与游离氨基氮浓度进行协同反馈过程工艺及补料,过程控制同实施例2。其中,氮源补料为花生豆粕,补料配制浓度为1%。
当纳豆激酶合成速率下降为900 IU/(mL*h)时终止发酵,使用纤维蛋白平板法测定产物的活力,发酵终止时纳豆激酶活力达32000IU/mL,转化率达72%。
实施例5:160m3发酵罐发酵生产工艺
(1)菌株活化:同实施例1。
(2)摇瓶培养:同实施例1。
(3)种子罐培养:同实施例1。
(4)发酵培养:当种子罐培养菌体OD600为10.6时移至容积为160m3的发酵罐中进行发酵培养,接后装液量为80m3,接种量为4%。所述发酵培养基配方:蛋白胨5g/L、氯化钠5g/L、黄豆饼粉25g/L、硫酸锌2g/L、磷酸氢二钾2g/L,于123°C灭菌25min,灭菌前pH调至5.30。所述发酵培养条件包括温度30°C,罐压0.03MPa,通气比0.45VVM,转速200rpm,发酵过程中通过补加氨水的方式调节发酵液pH于5.30,并补加浓度为600g/L的葡萄糖溶液以将发酵体系中葡萄糖浓度控制在10g/L。
所述发酵过程中实时在线监测发酵液中电导率与游离氨基氮浓度,通过两者协同反馈控制来实时反馈过程工艺,控制方式如下:
在发酵培养0~8h期间,将电导率控制在10.2±0.1mS/cm,将游离氨基氮浓度控制在4.1±0.1g/L;
在发酵培养8~16h期间,将电导率控制在1.1±0.1mS/cm,将游离氨基氮浓度控制在5.6±0.1g/L;
在发酵培养16h~发酵结束,将电导率控制在0.6±0.1mS/cm,将游离氨基氮浓度控制在0.5±0.1g/L。
发酵过程中,电导率以及游离氨基氮浓度反馈调控工艺及补料同实施例1。其中,无机盐补料为硫酸锰,补料配制浓度为2%。氮源补料为玉米浆,补料配制浓度为3%。
当纳豆激酶合成速率下降为750 IU/(mL*h)时终止发酵,使用纤维蛋白平板法测定产物的活力,发酵终止时纳豆激酶活力达35500IU/mL,转化率达72%。
实施例6:160m3发酵罐发酵生产工艺
(1)菌株活化:同实施例1。
(2)摇瓶培养:同实施例1。
(3)种子罐培养:同实施例1。
(4)发酵培养:当种子罐培养菌体OD600为10.3时移至容积为160m3的发酵罐中进行发酵培养,接后装液量为80m3,接种量为4%。所述发酵培养基配方:蛋白胨5g/L、氯化钠5g/L、黄豆饼粉25g/L、硫酸锌2g/L、磷酸氢二钾2g/L,于122°C灭菌35min,灭菌前pH调至5.10。所述发酵培养条件包括温度31°C,罐压0.03MPa,通气比0.55VVM,转速300rmp,发酵过程中通过补加氨水的方式调节发酵液pH于5.10,并补加浓度为500g/L的葡萄糖溶液以将发酵体系中葡萄糖浓度控制在8g/L。
所述发酵过程中实时在线监测发酵液CO2释放率与游离氨基氮浓度,通过两者协同反馈控制来实时调控过程工艺,控制方式如下:
在发酵培养0~8h期间,将CO2释放率控制在0.6%±0.1%,将游离氨基氮浓度控制在7.8±0.1g/L;
在发酵培养8~16h期间,将CO2释放率控制在7.4%±0.1%,将游离氨基氮浓度控制在5.0±0.1g/L;
在发酵培养16h~发酵结束,将CO2释放率控制在6.8%±0.1%,将游离氨基氮浓度控制在5.2±0.1g/L。
利用CO2释放率与游离氨基氮浓度进行协同反馈过程工艺及补料,过程控制同实施例2。其中,氮源补料为花生豆粕和硝酸铵按质量比3:1复配,补料配制浓度为5%。
当纳豆激酶合成速率下降为1300 IU/(mL*h)时终止发酵,使用纤维蛋白平板法测定产物的活力,发酵终止时纳豆激酶活力达33500IU/mL,转化率达71%。
实施例7:325m3发酵罐发酵生产工艺
(1)菌株活化:同实施例1。
(2)摇瓶培养:同实施例1。
(3)种子罐培养:同实施例1。
(4)发酵培养:当种子罐培养菌体OD600为10.2时移至容积为325m3的发酵罐中进行发酵培养,接后装液量为200m3,接种量为1%。所述发酵培养基配方:蛋白胨5g/L、氯化钠5g/L、黄豆饼粉25g/L、硫酸锌2g/L、磷酸氢二钾2g/L,于123°C灭菌15min,灭菌前pH调至4.50。所述发酵培养条件包括温度35°C,罐压0.04MPa,通气比0.35VVM,转速200rpm,发酵过程中通过补加氨水的方式调节发酵液pH于4.50,并补加浓度为600g/L的葡萄糖溶液以将发酵体系中葡萄糖浓度控制在6g/L。
所述发酵过程中实时在线监测发酵液中电导率与游离氨基氮浓度,通过两者协同反馈控制来实时调控过程工艺,控制方式如下:
在发酵培养0~8h期间,将电导率控制在4.0±0.1mS/cm,将游离氨基氮浓度控制在4.6±0.1g/L;
在发酵培养8~16h期间,将电导率控制在3.6±0.1mS/cm,将游离氨基氮浓度控制在6.8±0.1g/L;
在发酵培养16h~发酵结束,将电导率控制在4.3±0.1mS/cm,将游离氨基氮浓度控制在5.0±0.1g/L。
发酵过程中,电导率以及游离氨基氮浓度反馈调控工艺及补料同实施例1。其中,无机盐补料为硫酸镁和硫酸锰按质量比1:1复配,补料配制浓度为4%。氮源补料为玉米浆和硝酸铵按质量比4:1复配,补料配制浓度为1%。
当纳豆激酶合成速率下降为920 IU/(mL*h)时终止发酵,使用纤维蛋白平板法测定产物的活力,发酵终止时纳豆激酶活力达32000IU/mL,转化率达70%。
实施例8:325m3发酵罐发酵生产工艺
(1)菌株活化:同实施例1。
(2)摇瓶培养:同实施例1。
(3)种子罐培养:同实施例1。
(4)发酵培养:当种子罐培养菌体OD600为10.5时移至容积为325m3的发酵罐中进行发酵培养,接后装液量为200m3,接种量为2%。所述发酵培养基配方:蛋白胨5g/L、氯化钠5g/L、黄豆饼粉25g/L、硫酸锌2g/L、磷酸氢二钾2g/L,于123°C灭菌35min,灭菌前pH调至4.80。所述发酵培养条件包括温度30°C,罐压0.03MPa,通气比0.4VVM,转速200rpm,发酵过程中通过补加氨水的方式调节发酵液pH于4.80,并补加浓度为800g/L的葡萄糖溶液以将发酵体系中葡萄糖浓度控制在20g/L。
所述发酵过程中实时在线监测发酵液CO2释放率与游离氨基氮浓度,通过两者协同反馈控制来实时反馈过程工艺,控制方式如下:
在发酵培养0~8h期间,将CO2释放率控制在7.9%±0.1%,将游离氨基氮浓度控制在0.5±0.1g/L;
在发酵培养8~16h期间,将CO2释放率控制在10.2%±0.1%,将游离氨基氮浓度控制在6.5±0.1g/L;
在发酵培养16h~发酵结束,将CO2释放率控制在7.9%±0.1%,将游离氨基氮浓度控制在1.3±0.1g/L。
利用CO2释放率与游离氨基氮浓度进行协同反馈过程工艺及补料,过程控制同实施例2。其中,氮源补料为黄豆豆粕,补料配制浓度为4%。
当纳豆激酶合成速率下降为1320 IU/(mL*h)时终止发酵。使用纤维蛋白平板法(尿激酶作为标准品)测定产物的活力,发酵终止时纳豆激酶活力达33500IU/mL,转化率达72%。
实施例9:50L罐发酵生产工艺
(1)菌株活化:同实施例1。
(2)摇瓶培养:同实施例1。
(3)种子罐培养:同实施例1。
(4)发酵培养:当种子罐培养菌体OD600为10.5时移至容积为50L的发酵罐中进行发酵培养,接后装液量为25L,接种量为3%。所述发酵培养基配方:蛋白胨5g/L、氯化钠5g/L、黄豆饼粉25g/L、硫酸锌2g/L、磷酸氢二钾2g/L,于122°C灭菌25min,灭菌前pH调至4.50。所述发酵罐培养条件包括温度31°C,罐压0.04MPa,通气比0.5VVM,转速200rpm,发酵过程中通过补加氨水的方式调节发酵液pH于4.50,并补加浓度为400g/L的甘油溶液以将发酵体系中甘油浓度控制在1g/L。
所述发酵过程中实时在线监测发酵液电导率、CO2释放率与游离氨基氮浓度,通过三者协同反馈控制来实时调控过程工艺,控制方式如下:
在发酵培养0~8h期间,将电导率控制在5.2±0.1mS/cm,将CO2释放率控制在6.7%±0.1%,同时将游离氨基氮浓度控制在5.7±0.1g/L;
在发酵培养8~16h期间,将电导率控制在5.0±0.1mS/cm,将CO2释放率控制在7.2%±0.1%,同时将游离氨基氮浓度控制在6.2±0.1g/L;
在发酵培养16h~发酵结束,将电导率控制在4.8±0.1mS/cm,将CO2释放率控制在7.0%±0.1%,同时将游离氨基氮浓度控制在6.0±0.1g/L。
通过调整无机盐、氮源补加量来控制电导率在工艺范围,当电导率无法通过补料控制在范围时则通过调整转速、通气比和罐压中的至少一者来维持电导率在工艺范围内。当电导率低于工艺下限时,下调转速、通气比和罐压中的至少一者,当下调后电导率水平仍低于下限时,则提高无机盐补加量或者停止或降低氮源补加量。当电导率水平高于上限时,则上调转速、通气比和罐压中的至少一者,当上调后电导率仍然偏高,说明无机盐补入偏多,则停止或者降低无机盐补加量或者提高氮源补加量。其中,无机盐补料为硫酸镁,补料配制浓度为2%。氮源补料为玉米浆和硝酸铵按质量比1:1复配,补料配制浓度为2%。
通过调节转速、通气比和罐压中的至少一者来控制CO2释放率在工艺范围内。当CO2释放浓度低于下限时,则上调转速、通气比和罐压中的至少一者,当上调后CO2释放浓度仍偏低,则需要补加氮源;当CO2释放浓度高于上限时,则下调转速、通气比和罐压中的至少一者,如下调后CO2释放率仍然偏高,则需停止补加或者降低补加氮源。氮源补料为玉米浆和硝酸铵按质量比1:1复配,补料配制浓度为2%。
通过调整转速、通气比和罐压中的至少一者来控制游离氨基氮浓度在工艺范围。当游离氨基氮浓度低于工艺下限时,则下调转速、通气比和罐压中的至少一者,当下调后游离氨基氮浓度仍低于下限时,则需要补加氮源或者提高补加氮源流速。当游离氨基氮浓度高于工艺上限时,则上调转速、通气比和罐压中的至少一者,当上调后游离氨基氮浓度仍高于上限时,则停止补加或者降低补加氮源流速。其中,氮源补料为玉米浆和硝酸铵按质量比1:1复配,补料配制浓度为2%。
当纳豆激酶合成速率下降为1230 IU/(mL*h)时终止发酵。使用纤维蛋白平板法测定产物的活力,发酵终止时纳豆激酶活力达36300IU/mL,转化率达75%。
实施例10:50L罐发酵生产工艺
(1)菌株活化:同实施例2。
(2)摇瓶培养:同实施例2。
(3)种子罐培养:同实施例2。
(4)发酵培养:当种子罐培养菌体OD600为10.3时移至容积为50L的发酵罐中进行发酵培养,接后装液量为25L,接种量为3%。所述发酵培养基配方:蛋白胨5g/L、氯化钠5g/L、黄豆饼粉25g/L、硫酸锌2g/L、磷酸氢二钾2g/L,于122°C灭菌25min,灭菌前pH调至4.50。所述发酵罐培养条件包括温度31°C,罐压0.04MPa,通气比0.5VVM,转速200rpm,发酵过程中通过补加氨水的方式调节发酵液pH于4.50,并补加浓度为400g/L的甘油溶液以将发酵体系中甘油浓度控制在5g/L。
所述发酵过程中实时在线监测发酵液CO2释放率与游离氨基氮浓度,通过协同反馈控制来实时调控过程工艺,控制方式如下:
在发酵培养0~8h期间,将CO2释放率控制在4.2%±0.1%,将游离氨基氮浓度控制在4.6±0.1g/L;
在发酵培养8~16h期间,将CO2释放率控制在4.0%±0.1%,将游离氨基氮浓度控制在4.3±0.1g/L;
在发酵培养16h~发酵结束,将CO2释放率控制在4.3%±0.1%,将游离氨基氮浓度控制在5.0±0.1g/L。
利用CO2释放率与游离氨基氮浓度进行协同反馈过程工艺及补料,过程控制同实施例2。其中,氮源补料为花生豆粕和硝酸铵按质量比1:1复配,补料配制浓度为5%。
当纳豆激酶合成速率下降为560 IU/(mL*h)时终止发酵。使用纤维蛋白平板法测定产物的活力,发酵终止时纳豆激酶活力达8100IU/mL,转化率为55%,也就说部分周期CO2释放率未控制在优选工艺范围时发酵水平偏低,转化率偏低。
实施例11:50L发酵罐发酵生产工艺
(1)菌株活化:同实施例1。
(2)摇瓶培养:同实施例1。
(3)种子罐培养:同实施例1。
(4)发酵培养:当种子罐培养菌体OD600为10.5时移至容积为50L的发酵罐中进行发酵培养,接后装液量为25L,接种量为3%。所述发酵培养基配方:蛋白胨5g/L、氯化钠5g/L、黄豆饼粉25g/L、硫酸锌2g/L、磷酸氢二钾2g/L,于121°C灭菌25min,灭菌前pH调至4.50。所述发酵培养条件包括温度30°C,罐压0.04MPa,通气比0.6VVM,转速200rpm,发酵过程中通过补加氨水的方式调节发酵液pH于4.50,并补加浓度为500g/L的葡萄糖溶液以将发酵体系中葡萄糖浓度控制在5g/L。
所述发酵过程中实时在线监测发酵液中电导率与游离氨基氮浓度,通过两者协同反馈控制来实时调控过程工艺,控制方式如下:
在发酵培养0~8h期间,将电导率控制在19.9±0.1mS/cm,将游离氨基氮浓度控制在7.4±0.1g/L;
在发酵培养8~16h期间,将电导率控制在11.0±0.1mS/cm,将游离氨基氮浓度控制在6.2±0.1g/L;
在发酵培养16h~发酵结束,将电导率控制在5.9±0.1mS/cm,将游离氨基氮浓度控制在7.2±0.1g/L。
发酵过程中,电导率以及游离氨基氮浓度反馈调控工艺及补料同实施例1。其中,无机盐补料为硫酸镁,补料配制浓度为2%。氮源补料为玉米浆和硝酸铵按质量比1:1复配,补料配制浓度为2%。
当纳豆激酶合成速率下降为610 IU/(mL*h)时终止发酵,使用纤维蛋白平板法测定产物的活力,发酵终止时纳豆激酶活力达7800IU/mL,转化率为51%,也就说部分周期电导率未控制在优选工艺范围时发酵水平偏低,转化率偏低。
实施例12:50L罐发酵生产工艺
(1)菌株活化:同实施例1。
(2)摇瓶培养:同实施例1。
(3)种子罐培养:同实施例1。
(4)发酵培养:当种子罐培养菌体OD600为10.5时移至容积为50L的发酵罐中进行发酵培养,接后装液量为25L,接种量为3%。所述发酵培养基配方:蛋白胨5g/L、氯化钠5g/L、黄豆饼粉25g/L、硫酸锌2g/L、磷酸氢二钾2g/L,于121°C灭菌25min,灭菌前pH调至4.50。所述发酵培养条件包括温度30°C,罐压0.04MPa,通气比0.6VVM,转速200rpm,发酵过程中通过补加氨水的方式调节发酵液pH于4.50,并补加浓度为500g/L的葡萄糖溶液以将发酵体系中葡萄糖浓度控制在5g/L。
所述发酵过程中实时在线监测电导率和游离氨基氮浓度,通过两者协同反馈控制来实时调控过程工艺,整个发酵过程中,电导率均控制在0.5~20.0mS/cm,游离氨基氮浓度均控制在0.2~10.0g/L,不刻意进行分阶段精细调控。
通过调整无机盐、氮源补加量来控制电导率在工艺范围。当电导率无法通过补料控制在范围时则通过调整转速、通气比和罐压中的至少一者来维持电导率在工艺范围内。当电导率低于工艺下限时,下调转速、通气比和罐压中的至少一者,当下调后电导率水平仍低于下限时,则提高无机盐补加量或者停止或降低氮源补加量。当电导率水平高于上限时,则上调转速、通气比和罐压中的至少一者,当上调后电导率仍然偏高,说明无机盐补入偏多,则停止或者降低无机盐补加量或者提高氮源补加量。其中,无机盐补料为硫酸镁,补料配制浓度为2%。氮源补料为玉米浆和硝酸铵按质量比1:1复配,补料配制浓度为2%。
通过调整转速、通气比和罐压中的至少一者来控制游离氨基氮浓度在工艺范围。当游离氨基氮浓度低于工艺下限时,则下调转速、通气比和罐压中的至少一者,当下调后游离氨基氮浓度仍低于下限时,则需要补加氮源或者提高补加氮源流速。当游离氨基氮浓度高于工艺上限时,则上调转速、通气比和罐压中的至少一者,当上调后游离氨基氮浓度仍高于上限时,则停止补加或者降低补加氮源流速。其中,氮源补料为玉米浆和硝酸铵按质量比1:1复配,补料配制浓度为2%。
当纳豆激酶合成速率下降为1200IU/(mL*h)时终止发酵。使用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶活力,发酵终止时纳豆激酶活力达9210IU/mL,转化率达57%。
实施例13:50L罐发酵生产工艺
(1)菌株活化:同实施例2。
(2)摇瓶培养:同实施例2。
(3)种子罐培养:同实施例2。
(4)发酵培养:当种子罐培养菌体OD600为10.3时移至容积为50L的发酵罐中进行发酵培养,接后装液量为25L,接种量为3%。所述发酵培养基配方:蛋白胨5g/L、氯化钠5g/L、黄豆饼粉25g/L、硫酸锌2g/L、磷酸氢二钾2g/L,于122°C灭菌25min,灭菌前pH调至4.50。所述发酵罐培养条件包括温度31°C,罐压0.04MPa,通气比0.5VVM,转速200rpm,发酵过程中通过补加氨水的方式调节发酵液pH于4.50,并补加浓度为400g/L的甘油溶液以将发酵体系中甘油浓度控制在5g/L。
所述发酵过程中实时在线监测发酵液CO2释放率与游离氨基氮浓度,通过两者协同反馈控制来实时调控过程工艺,整个发酵过程中CO2释放率均控制在0.5%~15.0%,游离氨基氮浓度均控制在0.2~10.0g/L,不刻意进行分阶段精细调控。
通过调节转速、通气比和罐压中的至少一者来控制CO2释放率在工艺范围内。当CO2释放浓度低于下限时,则上调转速、通气比和罐压中的至少一者,当上调后CO2释放浓度仍偏低,则需要补加氮源;当CO2释放浓度高于上限时,则下调转速、通气比和罐压中的至少一者,如下调后CO2释放率仍然偏高,则需停止补加或者降低补加氮源。氮源补料为花生豆粕和硝酸铵按质量比1:1复配,补料配制浓度为5%。
通过调整转速、通气比和罐压中的至少一者来控制游离氨基氮浓度在工艺范围。当游离氨基氮浓度低于工艺下限时,则下调转速、通气比和罐压中的至少一者,当下调后游离氨基氮浓度仍低于下限时,则需要补加氮源或者提高补加氮源流速。当游离氨基氮浓度高于工艺上限时,则上调转速、通气比和罐压中的至少一者,当上调后游离氨基氮浓度仍高于上限时,则停止补加或者降低补加氮源流速。其中,氮源补料为花生豆粕和硝酸铵按质量比1:1复配,补料配制浓度为5%。
当纳豆激酶合成速率下降为1000 IU/(mL*h)时终止发酵。使用纤维蛋白平板法测定产物的活力,发酵终止时纳豆激酶活力达9850IU/mL,转化率达56%。
对比例1
按照实施例10的方法制备纳豆激酶,不同的是,在发酵培养8~16h期间,将CO2释放率控制在22.0%±0.1%,其余条件同实施例10。
当纳豆激酶合成速率下降为560IU/(mL*h)时终止发酵。使用纤维蛋白平板法测定产物的活力,发酵终止时纳豆激酶活力仅为6500IU/mL,转化率仅为43%,也就说部分周期CO2释放率未控制在工艺范围时发酵水平偏低,转化率偏低。
对比例2
按照实施例10的方法制备纳豆激酶,不同的是,在发酵培养8~16h期间,将游离氨基氮浓度控制在15.0±0.1g/L,其余条件同实施例10。
当纳豆激酶合成速率下降为560IU/(mL*h)时终止发酵。使用纤维蛋白平板法测定产物的活力,发酵终止时纳豆激酶活力仅为7300IU/mL,转化率仅为45%,也就说部分周期游离氨基氮浓度未控制在工艺范围时发酵水平偏低,转化率偏低。
对比例3
按照实施例11的方法制备纳豆激酶,不同的是,在发酵培养0~8h期间,将电导率控制在22.0±0.1mS/cm,其余条件同实施例11。
当纳豆激酶合成速率下降为610IU/(mL*h)时终止发酵。使用纤维蛋白平板法测定产物的活力,发酵终止时纳豆激酶活力仅为6500IU/mL,转化率仅为43%,也就说部分周期电导率未控制在工艺范围时发酵水平偏低,转化率偏低。
对比例4
按照实施例11的方法制备纳豆激酶,不同的是,在发酵培养8~16h期间,将游离氨基氮浓度控制在14.0±0.1g/L,其余条件同实施例11。
当纳豆激酶合成速率下降为610IU/(mL*h)时终止发酵。使用纤维蛋白平板法测定产物的活力,发酵终止时纳豆激酶活力仅为7000IU/mL,转化率仅为45%,也就说部分周期游离氨基氮浓度未控制在工艺范围时发酵水平偏低,转化率偏低。
对比例5
按照对比例2的方法制备纳豆激酶,不同的是,仅实时在线监测并调控发酵液CO2释放率,而未对游离氨基氮浓度进行在线监测并调控,在发酵培养0~8h期间,将CO2释放率控制在4.2%±0.1%;在发酵培养8~16h期间,将CO2释放率控制在4.0%±0.1%;在发酵培养16h~发酵结束,将CO2释放率控制在4.3%±0.1%,其余条件同对比例2。在发酵期间不定期取样测定游离氨基氮浓度,发现游离氨基氮浓度存在小于0.2g/L或大于11.0g/L的情况。
当纳豆激酶合成速率下降为560IU/(mL*h)时终止发酵。使用纤维蛋白平板法测定产物的活力,发酵终止时纳豆激酶活力仅为6100IU/mL,转化率仅为41%,也就说仅调控CO2释放率这一参数无法大幅提升纳豆激酶合成菌体的活力,发酵水平偏低,转化率偏低。
对比例6
按照对比例1的方法制备纳豆激酶,不同的是,仅实时在线监测并调控游离氨基氮浓度,而未对CO2释放率进行在线监测并调控,在发酵培养0~8h期间,将游离氨基氮浓度控制在4.6±0.1g/L;在发酵培养8~16h期间,将游离氨基氮浓度控制在4.3±0.1g/L;在发酵培养16h~发酵结束,将游离氨基氮浓度控制在5.0±0.1g/L,其余条件同对比例1。在发酵期间不定期取样测定CO2释放率,发现CO2释放率存在小于0.5%或大于15.0%的情况。
当纳豆激酶合成速率下降为560IU/(mL*h)时终止发酵。使用纤维蛋白平板法测定产物的活力,发酵终止时纳豆激酶活力仅为5900IU/mL,转化率仅为39%,也就说仅调控游离氨基氮浓度这一参数无法大幅提升纳豆激酶合成菌体的活力,发酵水平偏低,转化率偏低。
对比例7
按照对比例4的方法制备纳豆激酶,不同的是,仅实时在线监测并调控发酵液电导率,而未对游离氨基氮浓度进行在线监测并调控,在发酵培养0~8h期间,将电导率控制在19.9±0.1mS/cm;在发酵培养8~16h期间,将电导率控制在11.0±0.1mS/cm;在发酵培养16h~发酵结束,将电导率控制在5.9±0.1mS/cm,其余条件同对比例4。在发酵期间不定期取样测定游离氨基氮浓度,发现游离氨基氮浓度存在小于0.2g/L或大于11.0g/L的情况。
当纳豆激酶合成速率下降为610IU/(mL*h)时终止发酵。使用纤维蛋白平板法测定产物的活力,发酵终止时纳豆激酶活力仅为5300IU/mL,转化率仅为37%,也就说仅调控电导率这一参数无法大幅提升纳豆激酶合成菌体的活力,发酵水平偏低,转化率偏低。
对比例8
按照对比例3的方法制备纳豆激酶,不同的是,仅实时在线监测并调控游离氨基氮浓度,而未对电导率进行在线监测并调控,在发酵培养0~8h期间,将游离氨基氮浓度控制在7.4±0.1g/L;在发酵培养8~16h期间,将游离氨基氮浓度控制在6.2±0.1g/L;在发酵培养16h~发酵结束,将游离氨基氮浓度控制在7.2±0.1g/L,其余条件同对比例3。在发酵期间不定期取样测定电导率,发现电导率存在小于0.5mS/cm或大于20.0mS/cm的情况。
当纳豆激酶合成速率下降为610IU/(mL*h)时终止发酵。使用纤维蛋白平板法测定产物的活力,发酵终止时纳豆激酶活力仅为5200IU/mL,转化率仅为38%,也就说仅调控游离氨基氮浓度这一参数无法大幅提升纳豆激酶合成菌体的活力,发酵水平偏低,转化率偏低。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (12)
1.一种纳豆激酶的制备方法,其特征在于,该方法包括在纳豆激酶的发酵过程中,通过电导率协同游离氨基氮浓度和/或CO2释放率协同游离氨基氮浓度反馈并控制工艺过程,电导率控制在0.5~20.0mS/cm,CO2释放率控制在0.5%~15.0%,游离氨基氮浓度控制在0.2~11.0g/L。
2.根据权利要求1所述的纳豆激酶的制备方法,其特征在于,采用如下方式通过电导率协同游离氨基氮浓度反馈并控制工艺过程:
在发酵培养0~8h期间,将电导率控制在2.0~20.0mS/cm,同时将游离氨基氮浓度控制在1.0~7.5g/L;
在发酵培养8~16h期间,将电导率控制在1.0~8.0mS/cm,同时将游离氨基氮浓度控制在5.5~10.0g/L;
在发酵培养16h~发酵结束,将电导率控制在0.5~6.0mS/cm,同时将游离氨基氮浓度控制在0.2~7.5g/L。
3.根据权利要求1所述的纳豆激酶的制备方法,其特征在于,采用如下方式通过CO2释放率协同游离氨基氮浓度反馈并控制工艺过程:
在发酵培养0~8h期间,将CO2释放率控制在0.5%~8.0%,同时将游离氨基氮浓度控制在0.2~8.0g/L;
在发酵培养8~16h期间,将CO2释放率控制在6.0%~15.0%,同时将游离氨基氮浓度控制在4.0~10.0g/L;
在发酵培养16h~发酵结束,将CO2释放率控制在1.0%~8.0%,同时将游离氨基氮浓度控制在0.5~8.0g/L。
4.根据权利要求1所述的纳豆激酶的制备方法,其特征在于,采用如下方式通过电导率和CO2释放率协同游离氨基氮浓度反馈并控制工艺过程:
在发酵培养0~8h期间,将电导率控制在2.0~20.0mS/cm,将CO2释放率控制在0.5%~8.0%,同时将游离氨基氮浓度控制在0.2~9.0g/L;
在发酵培养8~16h期间,将电导率控制在1.0~8.0mS/cm,将CO2释放率控制在6.0%~15.0%,同时将游离氨基氮浓度控制在3.0~11.0g/L;
在发酵培养16h~发酵结束,将电导率控制在0.5~6.0mS/cm,将CO2释放率控制在1.0%~8.0%,同时将游离氨基氮浓度控制在0.2~9.0g/L。
5.根据权利要求1所述的纳豆激酶的制备方法,其特征在于,所述电导率通过调整无机盐和/或氮源的补加量进行控制,和/或,通过调整转速、通气比和罐压中的至少一者进行控制。
6.根据权利要求1所述的纳豆激酶的制备方法,其特征在于,所述CO2释放率和游离氨基氮浓度通过调整氮源的补加量进行控制,和/或,通过调整转速、通气比和罐压中的至少一者进行控制。
7.根据权利要求5所述的纳豆激酶的制备方法,其特征在于,所述无机盐选自硫酸镁、硫酸铜、硫酸锰、氯化锌和氯化钙中的至少一种。
8.根据权利要求5所述的纳豆激酶的制备方法,其特征在于,所述无机盐的浓度为1%~15%。
9.根据权利要求5或6所述的纳豆激酶的制备方法,其特征在于,所述氮源选自黄豆豆粕、花生豆粕、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、硫酸铵、氯化铵和硝酸铵中的至少一种。
10.根据权利要求5或6所述的纳豆激酶的制备方法,其特征在于,所述氮源的浓度为1%~15%。
11. 根据权利要求5或6所述的纳豆激酶的制备方法,其特征在于,所述转速为50~800rpm,所述通气比为0.3~2.5 VVM,所述罐压为0.02~0.08 MPa。
12. 根据权利要求1~6中任意一项所述的纳豆激酶的制备方法,其特征在于,所述纳豆激酶的发酵所采用的菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和/或纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)。
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