CN115927268A

CN115927268A - 一种纳豆激酶固态发酵半连续生产工艺

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Publication number: CN115927268A
Application number: CN202310115923.0A
Authority: CN
Inventors: 朱志春; 陈必钦; 徐鲁明; 左明雨; 白杨; 李丹; 詹光煌
Original assignee: Jindawei Biotechnology Jiangsu Co ltd; INNER MONGOLIA KINGDOMWAY PHARMACEUTICAL CO Ltd; Xiamen Kingdomway Group Co
Current assignee: Jindawei Biotechnology Jiangsu Co ltd; INNER MONGOLIA KINGDOMWAY PHARMACEUTICAL CO Ltd; Xiamen Kingdomway Group Co
Priority date: 2023-02-08
Filing date: 2023-02-08
Publication date: 2023-04-07

Abstract

本发明涉及一种纳豆激酶固态发酵半连续生产工艺，包括发酵培养，所述发酵培养是将含有能够产生纳豆激酶的微生物的种子液，接种到发酵罐中，通入含氧气体发酵，所述发酵罐中设有固态培养基和氨气在线监测仪，通过氨气在线监测仪检测所述发酵罐中的氨气浓度，通过氨气浓度反馈调控过程供氧及补加料液，从而将发酵过程中所述发酵罐内的氨气浓度控制在0.01～15g/L。所述纳豆激酶固态发酵半连续生产工艺，以氨气检测结果进行实时控制，可以保证发酵的效率高，产物品质稳定，发酵形成的发酵产物中纳豆激酶的酶活高达19980IU/g，纳豆激酶合成速率可维持在3000IU/g·h以上，适用于工业大规模生产，具有极好的运用前景。

Description

一种纳豆激酶固态发酵半连续生产工艺

技术领域

本发明涉及纳豆激酶发酵生产领域，尤其是一种纳豆激酶固态发酵半连续生产工艺。

背景技术

纳豆激酶具有溶栓性、半衰期长、特异性强和副作用小等优点，被作为膳食补充剂在美国、加拿大和欧洲等地销售，市场潜力巨大。目前纳豆激酶的生产主要是微生物发酵法，包括固体发酵法和液体发酵法，所得产物具备生物活性高和易于吸收等优点。

纳豆激酶研究的主要方向是以液体发酵生产为主，但该方法存在许多不足。在液态发酵培养基的选择上，碳源主要为葡萄糖、麦芽糖、木糖等，而氮源则集中为大豆蛋白、蛋白胨、酵母膏、豆渣等，另外还要添加适量的无机盐，如磷酸盐、硫酸镁、氯化钙等。液态培养基成分复杂，而固态发酵培养基成分单一，一般选择黄豆，大豆等，同时培养基中无游离水，限制了一些杂菌的生长。液态发酵装置主要采用通风式发酵罐，可以自动控制温度、压力、溶解氧浓度及pH值，即发酵过程可以自动化控制，但对设备要求高，能耗高，还会产生大量的发酵废水。固态发酵装置简单，培养基与空气的接触面大，空气通过固体层的阻力较液体层要小，氧气充足，这一优点使得人们在固态发酵中可采用高底物浓度进行生产，从而得到高浓度产物。固态发酵技术生产纳豆激酶具有低成本、无污染、产率高等优点。采用固态发酵生产纳豆激酶具有很大的优势。

目前报道的纳豆固态发酵工艺相对较简易，一般控制培养环境湿度和温度，专利申请CN101597600A公开了一种纳豆激酶固体发酵方法中，提到控制发酵温度在42～45℃，湿度为100％，可以提高活菌数。CN102618522A公开了一种采用鹰嘴豆工业化生产纳豆激酶的方法中，提到起始含水量为50％～60％，培养温度为36～42℃，相对湿度为60％～75％，物料的厚度控制在10～20cm。

液态发酵能实时监测pH值、溶氧、基质浓度等，监测的指标具有代表性，实时反馈发酵过程变化，而固态发酵不易实现类似的控制，因为固态发酵通常处于相对紧密的发酵环境下培养，难以监测，如果打开取样检测，又会破坏发酵环境，打扰发酵进程，因此现有技术中固态发酵无法实现实时监测并调整工艺，容易引起不可逆的影响，严重影响纳豆激酶生产水平。现有报道显示，纳豆固态发酵批与批之间结果差异较大，如没有合理的工艺控制策略，固态发酵工艺重现性相较液态发酵差较多。此外，液体发酵可以根据培养基基质中浓度进行连续或者分次补料，通过搅拌物料混合均匀，基质可以与微生物充分接触，而固态发酵无法实现，所以存在单批固体发酵培养基的原料利用率低的问题，造成原料浪费。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有的纳豆固态发酵存在的上述问题，提供一种纳豆激酶固态发酵半连续生产工艺，通过在线监测氨气浓度来反馈调控过程供氧及补料。进一步地，当发酵终止后加入浸提液，除去产物及菌体，留下未利用完全的培养基，重新接种并补充营养继续发酵，根据总氮、碳源及无机盐浓度进行补充，待合成速率明显变缓后终止发酵，从而实现半连续发酵。

本发明经过深入的研究，惊奇地发现，以在线监测到的发酵罐中的氨气浓度为依据，调控发酵过程的供氧及补料，可以很好地指导发酵进程，提高发酵产物中纳豆激酶的酶活。氨气是发酵罐中菌株分解后产生，除此之外，微生物活动还会产生醇类、酯类、有机酸、二氧化碳等物质。发明人发现，在众多代谢产物中，只有氨气指标与产品中纳豆激酶的酶活存在关联性，而醇类、酯类、二氧化碳、有机酸等物质则与产物纳豆激酶合成没有相关性。进一步的地，通过控制不同发酵阶段(发酵时间)的氨气浓度，可以实现对发酵进程的控制，并且实现重复发酵，在补充新鲜培养基后，纳豆激酶发酵水平稳定，可以保持较高的生产效率，提高产能，进而完成了本发明。

具体方案如下：

一种纳豆激酶固态发酵半连续生产工艺，包括发酵培养，所述发酵培养是将含有能够产生纳豆激酶的微生物的种子液，接种到发酵罐中，通入含氧气体发酵，通过氨气浓度反馈调控过程供氧及补加氮源，从而将发酵过程中发酵罐内的氨气浓度控制在0.01～15g/L，具体为，在发酵培养0～8h期间，将氨气浓度控制在0.01～5g/L；在发酵培养8～16h期间，将氨气浓度控制在4～15g/L；在发酵培养16h～发酵结束，将氨气浓度控制在3～10g/L。

本发明中，所述种子液中含有能够进行纳豆激酶的生产菌株，比如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏号为CCTCC:M20211444、纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)，菌种保藏号为CCTCC:M2012496等。上述2种菌株不够成对本发明的限制，只要菌株能够进行纳豆激酶的生产即可。

所述种子液可以是市售产品，也可以自行制备，工艺流程包括菌种活化、摇瓶培养、种子罐培养，培养基配方没有特殊限制，可以是适于纳豆激酶发酵的常规培养基，在具体实施例中可以采用以下条件：

1)菌种活化

用接种环从冻存管蘸取菌液至平板上划线，于25～45℃培养12～48h后获得成熟的单菌落。

平板培养基配方：蛋白胨5～20g/L、氯化钠5～20g/L、葡萄糖5～20g/L、琼脂粉5～20g/L，平板培养基于121～123℃灭菌15～35min，灭菌前pH调至5.0～8.0。

2)摇瓶培养

用接种铲将培养好的单菌落接入摇瓶培养基中，培养条件：转速100～300rpm，温度25～40℃，培养12～48h。

种子培养基配方：蛋白胨5～20g/L、氯化钠5～20g/L、葡萄糖5～20g/L、种子培养基于121～123℃灭菌15～35min，灭菌前pH调至5.0～8.0。

3)种子罐培养

当摇瓶种子液OD₆₀₀达5～20移至种子罐，接种量为0.1％～20.0％。

种子罐培养条件：罐压0.02～0.08MPa，通气比0.3～2.5，转速100～800rpm，温度25～45℃，培养周期6～32h。

种子罐培养基配方：蛋白胨5～20g/L、氯化钠5～20g/L、葡萄糖5～20g/L、种子罐培养基于121～123℃灭菌15～35min，灭菌前pH调至5.0～8.0。

当种子罐种子液OD₆₀₀达5～20移至发酵罐进行发酵培养，优选地，所述种子罐种子液的OD₆₀₀为8～18，更优选为10～15，可以是11，12，13，14。

本发明中，所述发酵罐的发酵容积0.001～50m³，优选为1～40m³。小规模发酵可以是1L，5L，10L，50L，100L，1000L，大规模发酵可以采用5m³，15m³，20m³，25m³，30m³，35m³，40m³。

进一步的，所述种子液的接种质量体积比为0.1％～20％，优选为1～18％，更优选为5～15％。接种质量体积比是指种子液的质量与固体培养基的体积之比。在具体的实施例中，种子液的接种质量体积比可以为6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％。

本发明中，发酵培养采用含氧气体，优选为空气，发酵培养初始条件为：罐压0.01～0.08Mpa，通气量按质量体积比0.1～3.0，转速1～200rpm，发酵温度25～45℃；优选地，发酵培养初始条件为：罐压0.02～0.06Mpa，通气量按质量体积比0.5～2.5，转速10～180rpm，发酵温度28～40℃。

本发明中，所述固态培养基的组分包括：黄豆或黄豆饼粉100～500g/Kg，氯化钠1～10g/Kg，硫酸锌1～10g/Kg，泛酸钙0.1～5g/Kg，磷酸氢二钠1～15g/Kg，葡萄糖或甘油5～100g/Kg，硫酸铵1～15g/Kg。需要说明的是，本发明适用的固态培养基不局限于上面的组成，根据菌株的差异可以采用其他适宜的组成，参照常规固体发酵培养基。

本发明的关键技术之一在于，控制所述发酵罐内的氨气浓度为0.01～15g/L，优选地，氨气浓度控制在0.01～13g/L，根据不同发酵时间，氨气的浓度不同。

具体地，在发酵培养0～8h期间，将氨气浓度控制在0.01～5g/L，优选为0.1～4g/L，例如可以是0.5g/L，1g/L，1.5g/L，2g/L，2.5g/L，3g/L；在发酵培养8～16h期间，将氨气浓度控制在4～15g/L，优选为5～13g/L，例如可以是6，7，8，9，10，11，12；在发酵培养16h～发酵结束，将氨气浓度控制在3～10g/L，优选为4～8g/L，例如可以4.5g/L，5g/L，5.5g/L，6g/L，6.5g/L，7g/L，7.5g/L。通过分阶段控制精细控制，可以显著提高每个批次的纳豆激酶发酵水平，进而提高纳豆激酶发酵的平均水平，实现产量提高。

本发明中，氨气的浓度对菌株自身并无影响，理论上当氨气浓度超过100g/L可能造成环境污染，不利于生物生长，因此，本发明中将氨气浓度控制在0.01～15g/L，不存在对菌株生长不利的情况。经过反复试验验证，通过控制氨气浓度在上述区间，有利于改善发酵中纳豆激酶的发酵水平，2个因素表现出高度相关，从而实现了将用氨气检测指标，来指导提高纳豆激酶的发酵水平，从而实现实时监测控制。

本发明中，通过氨气浓度反馈调控过程供氧及补加氮源，具体包括：通过调整供氧量和氮源的量，来使发酵罐中氨气浓度达到工艺设置范围，此外根据发酵需要还可以补加碳源、无机盐，以维持微生物生长。

其中：如果氨气浓度低于工艺下限时，说明菌体生长速率偏慢，消耗基质速率偏低，此时需要提高供氧，具体可以上调转速、通气比和罐压中的至少一者来提高供氧；如果上调供氧后氨气浓度仍小于工艺下限时，需要补入氮源。如果氨气浓度高于工艺下限时，说明菌体生长速率偏快，消耗基质速率偏快，此时需要降低供氧或者降低或停止补加氮源。

具体实现方式有：

补加氮源，所述氮源包括黄豆、黄豆饼粉、豆粕粉、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、酵母膏、牛肉浸膏、蛋白胨中的一种或多种，所述氮源的浓度为1～30wt％，优选为3～25wt％。在具体的实施中，氮源的浓度可以是5wt％，10wt％，12wt％，14wt％，16wt％，18wt％，20wt％，23wt％，24wt％。

补加碳源，所述碳源为葡萄糖或者甘油中至少一种，所述碳源的浓度为100～600g/L，在具体的实施中，碳源的浓度为200g/L，300g/L，350g/L，400g/L，450g/L，500g/L。补加所述碳源后所述发酵罐中的碳源浓度控制在0.1～15g/L，优选为1～10g/L，在具体的实施中补加碳源后所述发酵罐中的碳源浓度可以为2g/L，3g/L，4g/L，5g/L，6g/L，7g/L，8g/L，9g/L。

补加无机盐，所述无机盐包括硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠，氯化钙，硫酸锌、硫酸铜中的一种或多种，所述无机盐的浓度为1～15wt％，在具体的实施中，无机盐的浓度为3wt％，5wt％，8wt％，9wt％，10wt％，11wt％，13wt％。补加所述无机盐后所述发酵罐中的培养基的电导率控制在0.1～10ms/cm，优选为1～8ms/cm，在具体的实施中，电导率控制2ms/cm，3ms/cm，3.5ms/cm，4ms/cm，4.5ms/cm，5ms/cm，6ms/cm，7ms/cm。

本发明中，通过纤维蛋白平板法测定过程纳豆激酶含量。将含有纤维蛋白原和凝血酶的琼脂糖平板进行打孔，并将标准品--尿激酶和样品点入孔内进行反应。用梯度稀释的标准品绘制标准曲线：标准液酶活性为纵坐标，对应平板上反应圈的面积为横坐标。将样品在平板的反应圈面积代入标准曲线得到相应酶活性。

当所述发酵罐中的纳豆激酶合成速率＜1000～3000IU/g·h时终止当前批次的发酵，加入浸提液，除去菌体及产物，补充新鲜无菌所述固态培养基，重复所述发酵培养过程；优选地，当所述发酵罐中的纳豆激酶合成速率＜2500IU/g·h；更优选地，当所述发酵罐中的纳豆激酶合成速率＜2000IU/g·h，终止当前批次的发酵。在上述条件下终止当前批次的原因是产酶速率低时菌体产生大量副产物，降解纳豆激酶，影响发酵产量。

本发明中，所述浸提液为水或者盐溶液，所述盐溶液含氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的至少一种，所述盐溶液的浓度为1～50g/L，优选为5～30g/L，更优选为10～25g/L。

终止当前批次的发酵后，通过补充新鲜无菌固态培养基可以再次启动第二批次发酵，以促进纳豆激酶合成速率保持在较高水平，例如可以是3500～4000IU/g·h。为了实现这一点，可以控制所述发酵罐中的初始总氮浓度在10～100g/L，优选为30～80g/L，可以是40g/L，50g/L，60g/L，70g/L；初始总糖或者甘油浓度在5～100g/L，优选为20～80g/L，可以是30g/L，40g/L，50g/L，60g/L，70g/L；初始无机盐浓度通过电导率来表征，即电导率控制在5～20ms/cm，优选为8～18ms/cm，可以是10ms/cm，12ms/cm，13ms/cm，14ms/cm，15ms/cm，16ms/cm。

本发明中，在经过多个批次重复发酵后，例如经过3～20个批次之后，发酵罐中的纳豆激酶发酵水平偏低，即使补加料液也难以升高，此时应该终止生产，可以清空发酵罐，重新开始新一批生产。具体的，当某一批次的纳豆激酶发酵水平较第一批次低20～60％时，可以终止半连续生产，优选地，当某一批次的纳豆激酶发酵水平较第一批次低30～50％时终止半连续生产。

有益效果：

本发明中，以氨气检测结果进行实时地调控，可以保证发酵的效率高，产物品质稳定，发酵形成的发酵产物中纳豆激酶的酶活高达19980IU/g，纳豆激酶合成速率可维持在3000IU/g·h以上，适用于工业大规模生产。

再则，通过检测氨气浓度低于设定值，进行加料调整，可以提高整体发酵效果，保持较高的纳豆激酶合成速率。

进一步地，本发明中一批原料在发酵结束后可以重复使用，原料利用率高，节省生产成本。

总之，本发明解决了纳豆激酶固态发酵难以实时控制的困难，开创了以氨气作为监测标准并指导调控的先河，通过及时监测干预，可以保持高效的发酵水平，产物酶活性高，具有较好的市场运用前景。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在下面的实施例中，如未明确说明，“％”均指重量百分比。

实施例所采用的菌株为纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)，保藏号CCTCC:M2012496。

实施例1：50L罐生产工艺

1)菌种活化

用接种环从冻存管蘸取菌液至平板上划线，于30℃培养24h后获得成熟的单菌落。

所述平板培养基配方：蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、葡萄糖10g/L、琼脂粉10g/L，平板培养基于121～123℃灭菌25min，灭菌前pH调至5.0。

2)摇瓶培养

用接种铲将培养好的单菌落接入摇瓶培养基中，培养条件：转速200rpm，温度30℃，培养24h。

所述种子培养基配方：蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、葡萄糖10g/L，摇瓶培养基于121～123℃灭菌25min，灭菌前pH调至5.0。

3)种子罐培养

当摇瓶种子液OD₆₀₀达10移至种子罐，接种量为5％。

种子罐培养条件：罐压0.04MPa，通气比2.0，培养温度30℃，转速500rpm，培养周期24h。

所述种子培养基配方：蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、葡萄糖10g/L，种子培养基于121～123℃灭菌25min，灭菌前pH调至5.0。

4)发酵培养

当种子罐种子液OD₆₀₀达15移至发酵罐，接种为8％，为质量体积比。

固体发酵培养初始条件：罐压0.02Mpa，通气量按质量体积比1.0，转速50rpm，发酵温度30℃。

发酵培养基组分：黄豆250g/Kg，氯化钠10g/Kg，硫酸锌10g/Kg，泛酸钙0.1g/Kg，磷酸氢二钠15g/Kg，葡萄糖30g/Kg、硫酸铵15g/Kg。

过程补加氮源、碳源、无机盐，其中补加氮源浓度为20％，过程根据氨气浓度来反馈补加氮源；补加葡萄糖浓度为600g/L，过程葡萄糖浓度控制在14～15g/L；补加无机盐浓度为15％，过程根据电导率来补无机盐，电导率控制在9～10ms/cm。

补加无机盐为硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠，三者质量比例为1：1：2。

补加氮源为黄豆、豆粕粉，二者质量比例为3：1。

发酵过程根据氨气浓度来控制补加氮源及供氧，过程氨气浓度控制如下：

1)在发酵培养0～8h期间，将氨气浓度控制在0.01～1.5g/L。

2)在发酵培养8～16h期间，将氨气浓度控制在14～15g/L。

3)在发酵培养16h～发酵结束，将氨气浓度控制在3～4g/L。

如果氨气浓度低于工艺下限时，则通过上调转速、通气比和罐压中的至少一者来提高供氧。当上调转速、通气比和罐压中的至少一者仍低于下限值时，则需要补加氮源。当氨气浓度大于上限时，则下调转速、通气比和罐压中的至少一者来降低供氧，如下调后氨气浓度仍然偏高，则需停止补加或者降低补加氮源。

当纳豆激酶合成速率＜1500IU/g·h终止发酵，无菌条件下加入无菌水浸提产物并除去菌体，随后加入新鲜培养基，初始总氮浓度为40g/L，初始葡萄糖浓度为40g/L，初始无机盐电导率为10ms/cm，按8％接种量重新接入种子进行发酵，工艺同上，以此重复发酵，直至纳豆激酶发酵水平较第一批低30％时终止半连续发酵。

使用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶发酵水平，从表1可以看出，半连续发酵7批次纳豆激酶发酵水平稳定，发酵水平与第一批次发酵水平相近。

表1实施例1半连续发酵各批次纳豆激酶发酵水平

实施例2：12m³罐生产工艺

(1)菌种活化：同实施例1。

(2)摇瓶培养：同实施例1。

(3)种子罐培养：同实施例1。

(4)发酵培养：

当种子罐种子液OD₆₀₀达15移至发酵罐，接种为10％，为质量体积比。

固体发酵培养初始条件：罐压0.02Mpa，通气量按质量体积比0.5，转速15rpm，发酵温度30℃。

发酵培养基组分：黄豆饼粉300g/Kg，氯化钠5g/Kg，硫酸锌5g/Kg，泛酸钙0.2g/Kg，磷酸氢二钠10g/Kg，葡萄糖40g/Kg、硫酸铵10g/Kg。

过程补加氮源、碳源、无机盐，其中补加氮源浓度为25％，过程根据氨气浓度来反馈补加氮源；补加葡萄糖浓度为500g/L，过程葡萄糖浓度控制在0.1～2g/L；补加无机盐浓度为10％，过程根据电导率来补无机盐，电导率控制在0.1～1ms/cm。

补加无机盐包括硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸铜，三者质量比例为1：3：2。

补加氮源包括黄豆饼粉、牛肉浸膏，二者质量比例为2：1。

1)在发酵培养0～8h期间，将氨气浓度控制在3～5g/L。

2)在发酵培养8～16h期间，将氨气浓度控制在5～7g/L。

3)在发酵培养16h～发酵结束，将氨气浓度控制在8～10g/L。

通过调节转速、通气比和罐压中的至少一者来控制氨气在工艺范围内。当上调转速、通气比和罐压中的至少一者仍低于下限值时，则需要补加氮源。当氨气浓度大于上限时，则下调转速、通气比和罐压中的至少一者，如下调后活氨气浓度仍然偏高，则需停止补加或者降低补加氮源。

当纳豆激酶合成速率＜2000IU/g·h时终止发酵，无菌条件下加入9g/L氯化钠溶液去除产物和菌体，随后加入新鲜培养基，初始总氮浓度为50g/L，初始葡萄糖浓度为30g/L，初始无机盐电导率为10ms/cm，按10％接种量重新接入种子进行发酵，工艺同上，以此重复连续发酵，直至纳豆激酶发酵水平较第一批低40％终止半连续发酵。

使用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶发酵水平，从表2可以看出，连续发酵7批次纳豆激酶发酵水平稳定，发酵水平与第一批次发酵水平相近。

表2实施例2半连续发酵各批次纳豆激酶发酵水平

实施例3：50m³罐生产工艺

(1)菌种活化：同实施例1。

(2)摇瓶培养：同实施例1。

(3)种子罐培养：同实施例1。

(4)发酵培养：

当种子罐种子液OD₆₀₀达20移至发酵罐，接种为15％，为质量体积比。

固体发酵培养初始条件：罐压0.01Mpa，通气量按质量体积比0.3，转速10rpm，发酵温度40℃。

发酵培养基组分：豆粕粉200g/Kg、黄豆饼粉200g/Kg，氯化钠5g/Kg，硫酸锌5g/Kg，泛酸钙0.2g/Kg，磷酸氢二钠10g/Kg，甘油60g/Kg、硫酸铵15g/Kg。

过程补加氮源、碳源、无机盐，其中补加氮源浓度为30％，过程根据氨气浓度来反馈补加氮源；补加甘油浓度为500g/L，过程甘油浓度控制在0.1～2g/L；补加无机盐浓度为10％，过程根据电导率来补无机盐，电导率控制在0.1～1ms/cm。

补加无机盐包括硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙，三者质量比例为1:3:1。

补加氮源包括酵母膏、牛肉浸膏、蛋白胨，三者质量比例为1:2:3。

发酵过程根据氨气浓度来控制补加氮源及供氧，过程氨气浓度控制如下。

1)在发酵培养0～8h期间，将氨气浓度控制在0.01～1g/L。

2)在发酵培养8～16h期间，将氨气浓度控制在6～8g/L。

3)在发酵培养16h～发酵结束，将氨气浓度控制在5～7g/L。

当纳豆激酶合成速率＜3000IU/g·h时终止发酵，无菌条件下加入15g/L磷酸二氢钾溶液去除产物和菌体，随后加入新鲜培养基，初始总氮浓度为100g/L，初始甘油浓度为80g/L，初始无机盐电导率为15ms/cm，按15％接种量重新接入种子进行发酵，工艺同上，以此重复连续发酵，直至纳豆激酶发酵水平较第一批低50％终止半连续发酵。

使用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶发酵水平，从表3可以看出，连续发酵8批次纳豆激酶发酵水平稳定，发酵水平与第一批次发酵水平相近。

表3实施例3半连续发酵各批次纳豆激酶发酵水平

实施例4：20m³罐生产工艺

(1)菌种活化：同实施例1。

(2)摇瓶培养：同实施例1。

(3)种子罐培养：同实施例1。

(4)发酵培养：

当种子罐种子液OD₆₀₀达15移至发酵罐，接种为20％，为质量体积比。

固体发酵培养初始条件：罐压0.08Mpa，通气量按质量体积比2.5，转速100rpm，发酵温度40℃。

发酵培养基组分：黄豆饼粉200g/Kg，氯化钠10g/Kg，硫酸锌5g/Kg，泛酸钙0.2g/Kg，磷酸氢二钠10g/Kg，葡萄糖60g/Kg、硫酸铵15g/Kg。

过程补加氮源、碳源、无机盐，其中补加氮源浓度为30％，过程根据氨气浓度来反馈补加氮源；补加葡萄糖浓度为200g/L，过程葡萄糖浓度控制在8～10g/L；补加无机盐浓度为15wt％，过程根据电导率来补无机盐，电导率控制在6～8ms/cm。

补加氮源包括黄豆饼粉、牛肉浸膏，二者质量比例为2：1。

1)在发酵培养0～8h期间，将氨气浓度控制在0.02～1g/L。

2)在发酵培养8～16h期间，将氨气浓度控制在6～8g/L。

3)在发酵培养16h～发酵结束，将氨气浓度控制在3～4g/L。

当纳豆激酶合成速率＜2000IU/g·h时终止发酵，无菌条件下加入9g/L氯化钠溶液去除产物和菌体，随后加入新鲜培养基，初始总氮浓度为80g/L，初始葡萄糖浓度为50g/L，初始无机盐电导率为15ms/cm，按10％接种量(质量体积比)重新接入种子进行发酵，工艺同上，以此重复连续发酵，直至纳豆激酶发酵水平较第一批低40％终止半连续发酵。

使用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶发酵水平，从表4可以看出，连续发酵8批次纳豆激酶发酵水平稳定，发酵水平与第一批次发酵水平相近。

表4实施例4半连续发酵各批次纳豆激酶发酵水平

实施例5：25m³罐生产工艺

(1)菌种活化：同实施例1。

(2)摇瓶培养：同实施例1。

(3)种子罐培养：同实施例1。

(4)发酵培养：

当种子罐种子液OD₆₀₀达15移至发酵罐，接种为5％，为质量体积比。

固体发酵培养初始条件：罐压0.04Mpa，通气量按质量体积比1.0，转速150rpm，发酵温度25℃。

过程补加氮源、碳源、无机盐，其中补加氮源浓度为10wt％，过程根据氨气浓度来反馈补加氮源；补加葡萄糖浓度为100g/L，过程葡萄糖浓度控制在13～15g/L；补加无机盐浓度为5wt％，过程根据电导率来补无机盐，电导率控制在9～10ms/cm。

补加氮源包括黄豆饼粉、牛肉浸膏，二者质量比例为2：1。

1)在发酵培养0～8h期间，将氨气浓度控制在0.01～1g/L。

2)在发酵培养8～16h期间，将氨气浓度控制在13～15g/L。

3)在发酵培养16h～发酵结束，将氨气浓度控制在9～10g/L。

当纳豆激酶合成速率＜2000IU/g·h时终止发酵，无菌条件下加入9g/L氯化钠溶液去除产物和菌体，随后加入新鲜培养基，初始总氮浓度为30g/L，初始葡萄糖浓度为20g/L，初始无机盐电导率为8ms/cm，按10％接种量(质量体积比)重新接入种子进行发酵，工艺同上，以此重复连续发酵，直至纳豆激酶发酵水平较第一批低30％终止半连续发酵。

使用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶发酵水平，从表5可以看出，连续发酵8批次纳豆激酶发酵水平稳定，发酵水平与第一批次发酵水平相近。

表5实施例5半连续发酵各批次纳豆激酶发酵水平

对比例1：12m³罐生产工艺

(1)菌种活化：同实施例1。

(2)摇瓶培养：同实施例1。

(3)种子罐培养：同实施例1。

(4)发酵培养：

在发酵培养8～16h期间，将氨气浓度控制在16～17g/L，其余实验条件与实施例2相同。

使用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶发酵水平，从表6可以看出，在发酵培养8～16h期间氨气浓度控制超出4～15g/L范围后，其纳豆激酶发酵水平对比实施例2明显偏低。

表6对比例1半连续发酵各批次纳豆激酶发酵水平

对比例2：12m³罐生产工艺

(1)菌种活化：同实施例1。

(2)摇瓶培养：同实施例1。

(3)种子罐培养：同实施例1。

(4)发酵培养：

在发酵培养0～8h期间，将氨气浓度控制在6～7g/L，其余实验条件与实施例2相同。

使用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶发酵水平，从表7可以看出，在发酵培养0～8h期间的氨气浓度控制超出0.01～5g/L范围后，其纳豆激酶发酵水平对比实施例2明显偏低。

表7对比例2半连续发酵各批次纳豆激酶发酵水平

对比例3：12m³罐生产工艺

(1)菌种活化：同实施例1。

(2)摇瓶培养：同实施例1。

(3)种子罐培养：同实施例1。

(4)发酵培养：

在发酵培养16h～发酵结束期间，将氨气浓度控制在11～12g/L，其余实验条件与实施例2相同。

使用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶发酵水平，从表8可以看出，在发酵培养16h～发酵结束期间的氨气浓度控制超出3～10g/L范围后，其纳豆激酶发酵水平对比实施例2明显偏低。

表8对比例3半连续发酵各批次纳豆激酶发酵水平

对比例4：12m³罐生产工艺

(1)菌种活化：同实施例1。

(2)摇瓶培养：同实施例1。

(3)种子罐培养：同实施例1。

(4)发酵培养：

在发酵培养8～16h期间，将氨气浓度控制在2～3g/L，其余实验条件与实施例2相同。

使用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶发酵水平，从表9可以看出，在发酵培养8～16h期间氨气浓度控制超出4～15g/L范围后，其纳豆激酶发酵水平对比实施例2明显偏低。

表9对比例4半连续发酵各批次纳豆激酶发酵水平

对比例5：12m³罐生产工艺

(1)菌种活化：同实施例1。

(2)摇瓶培养：同实施例1。

(3)种子罐培养：同实施例1。

(4)发酵培养：

在发酵培养0～8h期间，将氨气浓度控制在8～9g/L，其余实验条件与实施例2相同。

使用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶发酵水平，从表10可以看出，在发酵培养0～8h期间氨气浓度控制超出0.01～5g/L范围时，其纳豆激酶发酵水平对比实施例2明显偏低。

表10对比例5半连续发酵各批次纳豆激酶发酵水平

对比例6：12m³罐生产工艺

(1)菌种活化：同实施例1。

(2)摇瓶培养：同实施例1。

(3)种子罐培养：同实施例1。

(4)发酵培养：

在发酵培养16h～发酵结束期间，将氨气浓度控制在1～2g/L，其余实验条件与实施例2相同。

使用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶发酵水平，从表11可以看出，在发酵培养16h～发酵结束期间氨气浓度控制超出3～10g/L范围时，其纳豆激酶发酵水平对比实施例2明显偏低。

表11对比例6半连续发酵各批次纳豆激酶发酵水平

对比例7：50L罐生产工艺

(1)菌种活化：同实施例1。

(2)摇瓶培养：同实施例1。

(3)种子罐培养：同实施例1。

(4)发酵培养：

发酵过程根据氨气浓度来控制补料及供氧，整个发酵过程氨气浓度控制为0.01～15g/L，不刻意进行分段精细调控。其余实验条件同实施例1。

使用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶发酵水平，从表12可以看出，其纳豆激酶发酵水平相比实施例1明显偏低。

表12对比例7半连续发酵各批次纳豆激酶发酵水平

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims

1.一种纳豆激酶固态发酵半连续生产工艺，其特征在于：包括发酵培养，所述发酵培养是将含有能够产生纳豆激酶的微生物的种子液，接种到发酵罐中，通入含氧气体发酵，通过氨气浓度反馈调控过程供氧及补加氮源，从而将发酵过程中发酵罐内的氨气浓度控制在0.01～15g/L，具体为，在发酵培养0～8h期间，将氨气浓度控制在0.01～5g/L；在发酵培养8～16h期间，将氨气浓度控制在4～15g/L；在发酵培养16h～发酵结束，将氨气浓度控制在3～10g/L。

2.根据权利要求1所述纳豆激酶固态发酵半连续生产工艺，其特征在于：所述种子液中含有枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌中至少一种；所述种子液的接种质量体积比为0.1％～20％，优选为1～18％，更优选为5～15％。

3.根据权利要求1所述纳豆激酶固态发酵半连续生产工艺，其特征在于：所述含氧气体为空气，发酵培养初始条件为：罐压0.01～0.08Mpa，通气量按质量体积比0.1～3.0，转速1～200rpm，发酵温度25～45℃；

优选地，发酵培养初始条件为：罐压0.02～0.06Mpa，通气量按质量体积比0.5～2.5，转速10～180rpm，发酵温度28～40℃。

4.根据权利要求1所述纳豆激酶固态发酵半连续生产工艺，其特征在于：所述发酵培养的培养基为固态培养基，所述固态培养基的组分包括：黄豆或黄豆饼粉100～500g/Kg，氯化钠1～10g/Kg，硫酸锌1～10g/Kg，泛酸钙0.1～5g/Kg，磷酸氢二钠1～15g/Kg，葡萄糖或甘油5～100g/Kg，硫酸铵1～15g/Kg。

5.根据权利要求1所述纳豆激酶固态发酵半连续生产工艺，其特征在于：在发酵培养0～8h期间，将氨气浓度控制在0.1～4g/L；在发酵培养8～16h期间，将氨气浓度控制在5～13g/L；在发酵培养16h～发酵结束，将氨气浓度控制在4～8g/L；

任选地，所述发酵罐的发酵容积为0.001～50m³，优选为1～40m³。

6.根据权利要求5所述纳豆激酶固态发酵半连续生产工艺，其特征在于：所述氮源包括黄豆、黄豆饼粉、豆粕粉、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、酵母膏、牛肉浸膏、蛋白胨中的一种或多种，所述氮源的浓度为1～30wt％，优选为3～25wt％；

任选的，在补加氮源之外，还补加碳源，所述碳源为葡萄糖或者甘油中至少一种，所述碳源的浓度为100～600g/L，补加所述碳源后所述发酵罐中的碳源浓度控制在0.1～15g/L，优选为1～10g/L；

任选的，在补加氮源之外，还补加无机盐，所述无机盐包括硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、氯化钙、硫酸锌、硫酸铜中的一种或多种，所述无机盐的浓度为1～15wt％，补加所述无机盐后所述发酵罐中的培养基的电导率控制在0.1～10ms/cm，优选为1～8ms/cm。

7.根据权利要求5所述纳豆激酶固态发酵半连续生产工艺，其特征在于：如果氨气浓度低于控制浓度下限，则首先提高通气供氧量；如果提高通气供氧量后，氨气浓度仍小于控制浓度下限，则需要补入氮源；如果氨气浓度高于控制浓度上限，则需要降低通气供氧量或者降低或停止补加氮源。

8.根据权利要求1-7任一项所述纳豆激酶固态发酵半连续生产工艺，其特征在于：所述种子液按照以下步骤制备得到：

1)菌种活化

用接种环从冻存管蘸取菌液至平板上划线，于25～45℃培养12～48h后获得成熟的单菌落；

平板培养基包括：蛋白胨5～20g/L、氯化钠5～20g/L、葡萄糖5～20g/L、琼脂粉5～20g/L，平板培养基于121～123℃灭菌15～35min，灭菌前pH调至5.0～8.0；

2)摇瓶培养

将所述成熟的单菌落接入摇瓶中，培养条件：转速100～300rpm，温度25～40℃，培养12～48h，得到摇瓶种子液；

摇瓶培养基的配方包括：蛋白胨5～20g/L、氯化钠5～20g/L、葡萄糖5～20g/L，摇瓶培养基于121～123℃灭菌15～35min，灭菌前pH调至5.0～8.0；

3)种子罐培养

当所述摇瓶种子液OD₆₀₀达5～20移至种子罐，接种量为0.1～20.0wt％；

种子罐培养条件：罐压0.02～0.08MPa，通气比0.3～2.5，转速100～800rpm，温度25～45℃，培养周期6～32h，得到种子罐种子液；

种子罐培养基配方包括：蛋白胨5～20g/L、氯化钠5～20g/L、葡萄糖5～20g/L，种子罐培养基于121～123℃灭菌15～35min，灭菌前pH调至5.0～8.0；

所述种子罐种子液的OD₆₀₀为5～20时移至发酵罐进行所述发酵培养，优选地，所述种子罐种子液的OD₆₀₀为8～18，更优选为10～15。

9.根据权利要求1-7任一项所述纳豆激酶固态发酵半连续生产工艺，其特征在于：当所述发酵罐中的纳豆激酶合成速率＜1000～3000IU/g·h时终止当前批次的发酵，加入浸提液，除去菌体及产物，补充新鲜无菌所述固态培养基，重复所述发酵培养过程；

优选地，当所述发酵罐中的纳豆激酶合成速率＜2500IU/g·h；更优选地，当所述发酵罐中的纳豆激酶合成速率＜2000IU/g·h，终止当前批次的发酵，补充新鲜无菌所述固态培养基后，控制所述发酵罐中的初始总氮浓度在10～100g/L，优选为30～80g/L；初始总糖或者甘油浓度在5～100g/L，优选为20～80g/L；初始无机盐浓度通过电导率来表征，即电导率控制在5～20ms/cm，优选为8～18ms/cm。

10.根据权利要求9所述纳豆激酶固态发酵半连续生产工艺，其特征在于：所述浸提液为水或者盐溶液，所述盐溶液含氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的至少一种，所述盐溶液的浓度为1～50g/L，优选为5～30g/L，更优选为10～25g/L；

任选地，重复所述发酵培养后，当某一批次的纳豆激酶发酵水平较第一批次低20～60％时终止半连续生产，优选地，当某一批次的纳豆激酶发酵水平较第一批次低30～50％时终止半连续生产。