CN1451745A - 利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶及其生产方法和用途 - Google Patents
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Abstract
利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶及其生产方法和用途，是一种在生物技术领域利用菌种产物生产药品原料的技术方案。野生的纳豆菌的发酵产物中，纳豆激酶的产量极低，提取工艺复杂。利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtitis)Hw4－1CGMCC№0718生产的纳豆激酶，属于丝氨酸蛋白酶类，由275个氨基酸组成，分子量27730道尔顿，等电点pI值为8.6。上述产品的生产方法，利用大豆蛋白胨等氮源、多糖类物质和无机盐进行发酵，将发酵液中加入乙醇或者加固体硫酸铵沉淀，离心后干燥粉碎，得到纳豆激酶的粗干粉，经凝胶层析后得到纯化产品。本产品用于治疗心脑血管疾病或者作为心血管疾病易发人群的保健品。
Description
技术领域：本发明涉及一种在生物技术领域利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶及其生产方法和用途。
背景技术：1987年日本学者发现日本传统食品中含有一种具有高活性的纤溶酶，称其为纳豆激酶(Nattokinase)。
野生的纳豆菌的发酵产物中，纳豆激酶的产生量极低，提取工艺复杂，产品的性能不稳定，不适合作为生物工程需要的生产原料。
发明内容：本发明的目的是提供一种利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶及其生产方法和该纳豆激酶用途。
上述的目的通过以下的技术方案实现：
一种利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶，菌种是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtitis)Hw4-1CGMCC№0718，该酶属于丝氨酸蛋白酶类，由275个氨基酸组成，分子量27730道尔顿，等电点pI值为8.6。
一种利用枯草芽孢杆菌培养产生上述纳豆激酶的方法，其特征是：利用大豆蛋白胨等氮源、多糖类物质和无机盐进行发酵，发酵温度为36.5-37.5℃，发酵周期16-50小时，pH6.5-7.5。经过离心、超滤后，将上清液中加入冷乙醇使其含量达70-80％，或者加固体硫酸铵使饱和度达60-70％，低温沉淀后离心，干燥粉碎，得到纳豆激酶的粗干粉，经凝胶层析后得到纯化产品。
上述的利用枯草芽孢杆菌培养产生上述纳豆激酶的方法，所述的氮源、多糖类物质和无机盐可以选择：
a.固体发酵：采用大豆作为发酵基质。
b.液体发酵：多糖类物质采用麦芽糖、木糖、蔗糖，使用量为：1-8％(重
量比)，或者利用麦芽汁作为碳源，增加0.1-2％(重量比)酵母膏，
氮源采用大豆蛋白胨、豆饼粉，使用量1-10％(重量比)，或者利用豆
浆作为发酵物质。
c.所述的无机盐：KH2PO4 0.1％，K2HPO4 0.3％，MgSO4·5H2O 0.05％，
CaCl2·H2O 0.02％。
上述的利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶的用途，将利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶按照常用的酶单位加入到淀粉或者糊精中，其加入量为每200毫克装量中含5000-10000U纳豆激酶，制成肠溶胶囊，用于治疗心脑血管疾病药品。
一种上述的利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶的用途，将利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶按照常用的酶单位加入到丹参粉、地龙粉中，其重量配比为：纳豆激酶100-150万酶单位，丹参粉50克，地龙粉30克，制成肠溶胶囊或者口服液，用于治疗心脑血管疾病药品。
一种上述的利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶的用途，将纳豆激酶的纯化产品经冷冻干燥制成医用注射针剂。
这个技术方案有以下有益效果：
1.本发明的纳豆激酶是使用枯草芽孢杆菌高产菌株进行发酵生产的高活性的纳豆激酶，是一种具有较高溶纤性能的蛋白激酶，针对纤维蛋白的降解有特异性的显著效果，经临床检验，该产品具有明显溶解人体血管内血栓的的活性，可以用于多种心脑血管疾病的治疗。
2.产品克服了该类产品只能静脉给药的方式，可以制成口服产品，可以通过肠道吸收进入循环系统，用于血栓治疗，其释放时间长，并可以促进血管内皮细胞产生组织型纤溶酶原激活因子，激活生物体自身的纤溶酶系统，提高血液的纤溶性能。
3.发明的纳豆激酶是使用枯草芽孢杆菌高产菌株进行发酵生产的高活性的纳豆激酶，液体发酵的最高酶活性达每毫克200尿激酶单位，固体发酵达每毫克20尿激酶单位，比野生的菌株高十多倍，并且生产原料易得，成本低，生产工艺稳定，生产周期短，所生产的纳豆激酶的活性高。
4.产品的稳定性明显好于已有的其他原料制成的的产品，在室温下，本产品每月取样一次，检验酶的活性，经过一年酶活性不变。在PH5-10的范围内，其性能十分稳定，并且本产品在50℃以内活性均不下降。
5.通过动静脉旁路血栓法检测的结果表明，加入纳豆激酶的小中大剂量组均与生理盐水对照组产生显著的差异，说明其对于抑制血栓形成有作用，其中特别是中大剂量组，与使用常规产品的对照组相比，有更明显的差异。这说明纳豆激酶除抑制血栓形成外，还具有溶栓效果。同时各剂量组之间具有依赖关系。根据对实验者血液中FIB(纤维蛋白原)、FDP(纤维蛋白降解产物)和D-diver的含量测定，纳豆激酶可以明显降低FIB的含量，使FDP显著增高，由此证实纳豆激酶具有激活纤溶酶的作用。报告附后。
6.经过国家认可的指定单位进行急性毒性检验，该产品符合人用药品的要求。报告附后。
实施例1：
一种利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶，所述的菌种是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtitis)Hw4-1CGMCC№0718，该菌种于2000年10月30日鉴定，并于2002年的2月27日送CGMCC保藏，其存活证明已经提交国家知识产权局。该蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶类，由275个氨基酸组成，分子量27730道尔顿，等电点pI值为8.6。
其枯草芽孢杆菌的菌种特性为：
1.形态特征：于37℃培养1-2天后，菌体为短杆状，有时成链，直形，
(0.5-0.7)×(1.5-1.8)微米，有芽孢，芽孢亚端生，不膨大，椭
圆形，芽孢不多于1个，革兰氏染色为阳性。
2.培养特征：在LB培养基上37℃培养1-2天后，菌落呈乳脂色，边
缘不光滑，表面粗糙，呈皱褶状，菌落不粘，易挑起。
3.生理生化特性：
接触酶+，氧化酶-，VP试验+，VP＜pH6+，VP＞Ph7-，
明胶液化+，分解酪素+，淀粉水解-，硝酸盐还原+。
利用碳水化合物产酸：葡萄糖+，木糖+，L-阿拉伯糖-，甘露醇+
利用葡萄糖产气-，利用柠檬酸盐-，甲基红试验+。
实施例2：.
上述纳豆激酶的生产方法：
利用大豆蛋白胨等氮源、多糖类物质和无机盐进行发酵，发酵温度为36.5-37.5℃，发酵周期16-50小时，pH6.5-7.5。经过离心、超滤后，将上清液中加入冷乙醇使其含量达70-80％，或者加固体硫酸铵使饱和度达60-70％，低温沉淀后离心，干燥粉碎，得到纳豆激酶的粗干粉，经凝胶层析后得到纯化产品。
上述的利用枯草芽孢杆菌培养产生上述纳豆激酶的方法，所述的氮源、多糖类物质和无机盐可以选择：
a.固体发酵：采用大豆作为发酵基质。
b.液体发酵：多糖类物质采用麦芽糖、木糖、蔗糖，使用量为：1-8％(重量比)，最佳量为1.5-4％，或者利用麦芽汁作为碳源，增加0.1-2％(重量比)酵母膏，以提高纳豆激酶的产量。氮源采用大豆蛋白胨、豆饼粉，使用量1-10％(重量比)，其最佳量为2-5％，或者利用豆浆作为发酵物质。
c.所述的无机盐：KH2PO4 0.1％，K2HPO4 0.3％，MgSO4·5H2O 0.05％，CaCl2·H2O 0.02％。
发酵罐培养的条件：
通气量控制为：(1∶0.5)-(1∶1)V/V/min，搅拌200-400rpm，罐温为36.5-37.5℃之间，罐压为0.03-0.05Mpa.
发酵：
采用固体发酵时，应当精选大豆，泡24小时，121℃灭菌一小时，冷却后进行接种发酵。发酵的相对湿度为80-95％，温度为36-38℃，周期为20小时以上，一般不必超过50小时。
发酵后可以进行提取，用1-2倍量的含2mMCaCI2的生理盐水在低温下搅拌抽提1-2小时后，进行过滤，离心30-40分钟，弃沉淀，收集上清液，加入低温乙醇至乙醇含量达到70-80％，或加入固体硫酸铵至饱和度达到60-70％，低温过夜沉淀，离心后真空抽干，将沉淀粉碎，即得纳豆激酶的粗干粉。
如果采用的是液体发酵，则直接进行低温离心，除去菌体，并超滤浓缩1-10倍，加入低温乙醇至乙醇含量达到70-80％，或加入固体硫酸铵至饱和度达到60-70％，低温过夜沉淀，离心后真空抽干，将沉淀粉碎，即得纳豆激酶的粗干粉。
纯化：
将纳豆激酶粗干粉用Tris·HCl缓冲液溶解后，使用Butyl Sepharose4FF疏水层析柱进行组分分离，收集高活性组分。透析浓缩后，用CM离子交换柱分离，收集活性组分。反渗浓缩后，进行SephadexG-100分子筛凝胶柱层析，收集活性组分。经透析浓缩后，得到纳豆激酶的纯化产品。
实施例3：
上述的利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶的用途，将利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶按照常用的酶单位5000U-10000U加入到淀粉或者糊精中，制成肠溶胶囊，用于治疗血栓类的心脑血管疾病的药品。
每日3次，每次2粒。
实施例4：
一种上述的利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶的用途，将利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶按照常用的酶单位加入到丹参粉、地龙粉中，其重量配比为：纳豆激酶100-150万酶单位，丹参粉50克，地龙粉30克，共同制成纳米级微粒后，制成肠溶胶囊或者口服液，作为心血管疾病易发人群的保健品，用于预防血栓类的心脑血管疾病的药品。
实施例5：
一种上述的利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶的用途，纳豆激酶的纯化产品经冷冻干燥制成医用注射针。
Claims (6)
1.一种利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶，其特征是：所述的菌种是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtitis)Hw4-1CGMCC№0718，该酶属于丝氨酸蛋白酶类，由275个氨基酸组成，分子量27730道尔顿，等电点pI值为8.6。
2.一种利用枯草芽孢杆菌培养产生上述纳豆激酶的方法，其特征是：利用大豆蛋白胨等氮源、多糖类物质和无机盐进行发酵，发酵温度为36.5-37.5℃，发酵周期16-50小时，pH6.5-7.5。经过离心、超滤后将上清液中加入冷乙醇使其含量达70-80％，或者加固体硫酸铵使饱和度达60-70％，低温沉淀后离心，干燥粉碎，得到纳豆激酶的粗干粉，经凝胶层析后得到纯化产品。
3.根据权利要求2所述的利用枯草芽孢杆菌培养产生上述纳豆激酶的方法，其特征是：所述的氮源、多糖类物质和无机盐可以选择：
a.固体发酵：采用大豆作为发酵基质。
b.液体发酵：多糖类物质采用麦芽糖、木糖、蔗糖，使用量为：1-8％(重
量比)，或者利用麦芽汁作为碳源，增加0.1-2％(重量比)酵母膏，
氮源采用大豆蛋白胨、豆饼粉，使用量1-10％(重量比)，或者利用豆
浆作为发酵物质。
c.所述的无机盐：KH2PO4 0.1％，K2HPO4 0.3％，MgSO4·5H2O 0.05％，
CaCl2·H2O 0.02％。
4.一种权利要求1所述的利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶的用途，其特征是：将利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶按照常用的酶单位加入到淀粉或者糊精中，其加入量为每200毫克装量中含5000-10000U纳豆激酶，将其共同制成肠溶胶囊，用于治疗心脑血管疾病药品。
5.一种权利要求1所述的利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶的用途，其特征是：将利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶按照常用的酶单位加入到丹参粉、地龙粉中，其重量配比为：纳豆激酶100-150万酶单位，丹参粉50克，地龙粉30克，共同制成纳米级微粒，制成肠溶胶囊或者口服液，用于防治心脑血管疾病药品。
6.一种权利要求1所述的利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶的用途，其特征是：纳豆激酶的纯化产品经冷冻干燥制成医用注射针剂。
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