CN112813001A - 一株枯草芽孢杆菌及其在发酵联产纳豆激酶、乙偶姻和大豆肽中的应用 - Google Patents

一株枯草芽孢杆菌及其在发酵联产纳豆激酶、乙偶姻和大豆肽中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌及其在发酵联产纳豆激酶、乙偶姻和大豆肽中的应用方法。该菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NDF，已于2020年9月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020513。该菌株革兰氏染色呈阳性，产芽孢，细胞形态为杆状。利用本发明菌株，以105g/L葡萄糖作为碳源和180g/L豆浆作为氮源，经30℃发酵25h可得到酶活力为10220IU/mL的纳豆激酶和25.9g/L的乙偶姻。经过提取，最终可得纳豆激酶活力为16378IU/mL，比活为10318IU/mg；产物乙偶姻经气相色谱测得其纯度超过97.0％；大豆肽经质谱检测结果表明，超过98％的肽段的相对分子质量小于1200。本发明在国内外首次实现了采用微生物技术发酵联产纳豆激酶、乙偶姻和大豆肽，原料利用率较高、成本较低，极具开发应用潜力。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其在发酵联产纳豆激酶、乙偶姻和大豆 肽中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株枯草芽孢杆菌及其在发酵联产纳豆激酶、乙偶姻和大豆肽中的应用。
背景技术
纳豆是一种由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)发酵大豆制得的传统食品，其制备方法是将浸泡过的大豆种子蒸煮，然后接种特定的枯草芽孢杆菌菌种并进行孵育。在这个过程中，会产生一种丝氨酸蛋白酶，称之为纳豆激酶(Nattokinase)，这种酶具有溶解血栓、降低血粘度、改善血液循环、软化和增加血管弹性等作用(Dabbagh et al.,2014)。乙偶姻(Acetoin)即3-羟基-2-丁酮，具有特有的奶油香味，多用于面包、奶油、干酪、甜点等的香味增强剂，同时也可用于配制奶油、乳品、酸奶和草莓型香精等，另外在化妆品、药物、化学合成等领域也有重要的用途(Xiao and Lu,2014)。大豆肽是将大分子的大豆蛋白质利用生物技术制成的含2～10个氨基酸残基的小分子肽段。大豆肽不仅具有良好的溶解性、低粘度、抗凝胶形成性，而且在体内消化吸收快、利用效率高；大豆肽具有低抗原性，不会产生过敏反应，能促进肌红细胞复原和脂肪代谢；另外，大豆肽还具有抗氧化性等生理活性。因此，可将大豆肽应用于保健饮料，也可用于病员食品、减肥食品、婴幼儿食品等(Chatterjee etal.,2018)。
由上述可见，纳豆激酶、乙偶姻和大豆肽是三种非常有价值的产品。根据以往报道，需要采用不同的技术分别进行制备，生产成本较高，原料利用率较低、容易造成浪费。国内外至今未见有同时生产三种产品的技术的相关报道。
参考文献：
Dabbagh F,Negahdaripour M,Berenjian A,et al.(2014)Nattokinase:production and application.Appl Microbiol Biotechnol 98:9199–9206.
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发明内容
针对上述目前现状，本发明提供一株枯草芽孢杆菌及其在发酵联产纳豆激酶、乙偶姻和大豆肽中的应用方法，使三者产量和收率均达到较高水平，大大简化了生产工艺，提高了原料利用率，降低了生产成本，在国内外首次在技术上实现了同时生产制备纳豆激酶、乙偶姻和大豆肽，具有非常高的应用开发价值。
本发明提供的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NDF，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国·武汉·武汉大学(湖北省武汉市武昌区八一路299号)，保藏编号为CCTCC M 2020513，保藏日期为2020年9月18日。
本发明提供一株枯草芽孢杆菌，并利用这株枯草芽孢杆菌发酵联产纳豆激酶、乙偶姻和大豆肽。本发明提供的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NDF革兰氏染色呈阳性，产芽孢，细胞形态为杆状。通过对本发明菌株的16S rDNA进行测序，并将本发明菌株的16SrDNA序列与GenBank数据库中已收录的细菌菌株的16S rDNA序列进行核苷酸序列同源性比对，发现本发明菌株的16S rDNA序列与多株已知枯草芽孢杆菌菌株的16S rDNA序列的同源性为100％。本发明菌株的16S rDNA序列已提交到GenBank数据库中，登录号为MW092175。
采用本发明提供的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NDF，发酵联产纳豆激酶、乙偶姻和大豆肽的方法，其涉及的实施步骤如下：
第一步，活化菌株：将本发明提供的菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NDF划线接种到Luria-Bertani固体培养基上，置于37℃的恒温箱中培养8–12h，至菌落生长丰满。所述Luria-Bertani固体培养基每升中含有：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，20g琼脂粉。
第二步，制备液体种子：用接种环挑取上述步骤获得的菌落，接种到Luria-Bertani液体培养基中，37℃摇床培养10h。采用体积为250mL的挡板摇瓶，装液量为50mL；采用回旋式摇床，转速设定在150rpm。所述Luria-Bertani液体培养基每升中含有：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠。
第三步，发酵联产纳豆激酶、乙偶姻和大豆肽：将上述步骤获得的液体种子按5％体积比接种到灭菌后的发酵培养基中，采用体积为6L的发酵罐，装液量为4L；通气量1vvm，转速设定在600rpm；发酵温度设定在30℃。在发酵过程中不定时多次取样检测葡萄糖的利用情况以及纳豆激酶和乙偶姻的产生情况。采用纤维蛋白平板法检测纳豆激酶活性、气相色谱法检测乙偶姻的产量。
制备4L所述发酵培养基的方法为：取720g大豆用自来水洗净、浸泡10小时，沥干，添加约2600mL自来水磨制豆浆，过80目筛除豆渣，向豆浆中添加440g葡萄糖后定容至4L。试验或生产时可根据生产规模的需要，参考此比例进行发酵培养基的制备。
第四步，提取纳豆激酶、乙偶姻和大豆肽：30℃发酵培养25h时收集部分发酵液，以8000rpm离心10min，收集发酵液上清液。将发酵液上清液依次过0.45μm微滤膜、30K超滤膜、3K超滤膜。发酵液上清液原液、各步截留液和滤过液均采用纤维蛋白平板法检测纳豆激酶活性及牛血清蛋白为基准测定蛋白质含量，采用SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白纯度，最终确定由3K超滤膜截留得到的截留液为纳豆激酶。
由3K超滤膜得到的滤过液置于旋转蒸发仪中，抽真空，在45℃条件下旋转蒸发，收集馏分用于乙偶姻制备，收集釜底液用于大豆肽制备。用等体积的二氯甲烷对收集到的馏分萃取4次，将有机相合并，并于35℃抽真空旋转蒸发开始去除二氯甲烷。当釜底剩余物体积为旋转蒸发开始时总体积的约2％时，终止旋转蒸发过程。收集釜底剩余物并置于室温下自然挥发，继续除去产物中残余的二氯甲烷，其间用气相色谱仪检测二氯甲烷去除进度。最后，采用气相色谱归一法计算产物乙偶姻的纯度。上述釜底液经过冷冻干燥法处理得到大豆肽，采用质谱法测定大豆肽的分子量分布。
本发明在国内外首次实现了发酵联产纳豆激酶、乙偶姻和大豆肽，原料利用率较高、成本较低，极具开发应用潜力。
附图说明
图1是枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NDF发酵过程曲线；图2是纯化制备纳豆激酶蛋白SDS-PAGE凝胶电泳结果图，1–5各泳道依次为：发酵液上清液原液、30K膜截留物、30K膜滤过液、3K膜截留物、3K膜滤过液；图3是本发明制备所得的乙偶姻产物经气相色谱仪(配置氢火焰离子化检测器)测得的纯度表征图；图4是制备得到的大豆肽各肽段的相对分子质量排布图。
具体实施方式
实施例1：菌株筛选
1.1菌株初筛
将纳豆样品加入到无菌水中，搅拌，80℃水浴30min，然后取上清液适当稀释后涂布到酪蛋白初筛平板上，在37℃培养24h。待平板中出现溶解圈后，挑取水解圈面积较大的菌落于新平板上重新划线培养，经多次划线分离得到纯的菌株。所述酪蛋白初筛固体培养基每升中含有：5g酪蛋白，1g葡萄糖，1g酵母提取物，1g K2HPO4，0.5g KH2PO4，0.1gMgSO4 .7H2O，20g琼脂粉。调培养基pH至7.0。
1.2菌株复筛
将上述实验得到的菌株，接种到种子培养基中，在37℃摇瓶培养24h，然后用移液器取2％的种子液转接于灭菌后的复筛发酵培养基中，于37℃、150rpm的摇床中培养48h。取发酵液点样于纤维蛋白平板上检测酶活，筛选相对酶活最高的菌株，并用气相色谱仪检测发酵液中乙偶姻的含量。所述种子培养基每升中含有：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10gNaCl；所述复筛培养基每升中含有：20g大豆蛋白胨，20g葡萄糖，0.5g K2HPO4，0.5g KH2PO4，0.5g MgSO4 .7H2O，0.5g CaCl2。
经过复筛，发现1株细菌纳豆激酶及乙偶姻产量较高，将此菌株命名为NDF，即为本发明菌株。将得到的目的菌株采用斜面传代法、低温甘油法、低温真空干燥法等常规方法保存备用。
实施例2：菌株鉴定与保藏
将实施例1得到的菌株NDF进行检验，其革兰氏染色呈阳性，产芽孢，细胞形态为杆状；37℃条件下，采用Luria-Bertani固体培养基培养8h，可得到直径大小约为2～3mm、表面有褶皱的灰白色菌落。
通过对本发明菌株的16S rDNA进行测序，并将本发明菌株的16S rDNA序列与GenBank数据库中已收录的细菌菌株的16S rDNA序列进行核苷酸序列同源性比对，发现本发明菌株的16S rDNA序列与多株已知枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株的16S rDNA序列的同源性为100％，同时考虑到该菌株来源于纳豆，而纳豆是由枯草芽孢杆菌发酵大豆制得的食品，因此将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
本发明菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NDF已于2020年9月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020513。
实施例3：采用枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NDF发酵联产纳豆激酶、乙偶姻和大豆肽
3.1活化菌株
将本发明提供的菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NDF划线接种到Luria-Bertani固体培养基上，置于37℃的恒温箱中培养8～12h，至菌落生长丰满。所述Luria-Bertani固体培养基每升中含有：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，20g琼脂粉。
3.2制备液体种子
用接种环挑取上述步骤获得的菌落，接种到Luria-Bertani液体培养基中，37℃摇床培养10h。采用体积为250mL的挡板摇瓶，装液量为50mL；采用回旋式摇床，转速设定为150rpm。所述Luria-Bertani液体培养基每升中含有：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠。
3.3发酵联产纳豆激酶、乙偶姻和大豆肽
将上述步骤获得的液体种子按5％体积比接种到4L灭菌后的发酵培养基中，采用容积为6L的发酵罐，通气量1vvm，转速600rpm，温度30℃。制备4L所述发酵培养基的方法为：取720g大豆用自来水洗净、浸泡10小时，沥干，添加约2600mL自来水磨制豆浆，过80目筛除豆渣，向豆浆中添加440g葡萄糖后定容至4L。在发酵过程中不定时多次取样检测葡萄糖的利用情况以及纳豆激酶和乙偶姻的产生情况(附图1)。采用纤维蛋白平板法检测纳豆激酶活性、气相色谱法检测乙偶姻的产量、质谱法测定大豆肽的分子量分布。发酵培养25h时收集部分发酵液，以8000rpm离心10min，收集上清液。
3.4提取纳豆激酶、乙偶姻和大豆肽
将上述步骤获得的上清液依次过0.45μm微滤膜、30K超滤膜、3K超滤膜。发酵液上清液原液、各步截留液和滤过液采用纤维蛋白平板法检测纳豆激酶活性及牛血清蛋白为基准测定蛋白质含量。附图2是纯化制备纳豆激酶蛋白电泳结果图，由3K超滤膜截留得到的截留液为纳豆激酶，酶活力为10220IU/mL。
由3K超滤膜得到的滤过液置于旋转蒸发仪中，抽真空，在45℃条件下旋转蒸发，收集馏分用于乙偶姻制备，收集釜底液用于大豆肽制备。用等体积的二氯甲烷对收集到的馏分萃取4次，将有机相合并，并于35℃抽真空旋转蒸发开始去除二氯甲烷。当釜底剩余物体积为旋转蒸发开始时总体积的约2％时，终止旋转蒸发过程。收集釜底剩余物并置于室温下自然挥发，继续除去产物中残余的二氯甲烷，其间用气相色谱仪检测二氯甲烷去除进度。最后，采用气相色谱归一法计算产物乙偶姻的纯度。上述釜底液经过冷冻干燥法处理得到大豆肽，采用质谱法测定大豆肽的分子量分布。
利用本发明所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NDF，采用上述方法，30℃发酵25h后，纤维蛋白平板法测得纳豆激酶酶活力为10220IU/mL；可以由105g/L的葡萄糖产生25.9g/L的乙偶姻，经过提取，最终可得到的纳豆激酶活力为16378IU/mL，比活为10318IU/mg，计算可得酶活回收率为14.9％；采用气相色谱仪(配置氢火焰离子化检测器)归一法测得产物乙偶姻的纯度超过97.0％(附图3)，计算可得提取回收率为33.6％；大豆肽质谱检测结果表明，超过98％的肽段的相对分子质量小于1200，计算可得提取回收率为2.4％。
本发明在国内外首次实现了采用发酵法联产纳豆激酶、乙偶姻和大豆肽，可按实施例类似的方法进行扩大生产，极具开发应用潜力。

Claims (3)

1.芽孢杆菌Bacillus subtilis NDF，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC M 2020513。
2.权利要求1所述的芽孢杆菌Bacillus subtilis NDF在发酵联产纳豆激酶、乙偶姻和大豆肽中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：利用所述芽孢杆菌Bacillus subtilisNDF发酵联产纳豆激酶、乙偶姻和大豆肽，所采用的氮源原料为豆浆。
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