CN105820988A - 一株芽孢杆菌及其在高温发酵生产乙偶姻和2,3-丁二醇中的应用 - Google Patents

一株芽孢杆菌及其在高温发酵生产乙偶姻和2,3-丁二醇中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株芽孢杆菌及其在高温发酵生产乙偶姻和2,3‑丁二醇中的应用。该菌株为芽孢杆菌Bacillus sp.H15‑1CGMCC No.12389，革兰氏染色呈阳性，产芽孢，细胞形态为杆状，可在40–60℃生长，50℃时增殖最快。利用本发明菌株，以脱胚玉米粉水解液为主要原料，采用机械搅拌通风发酵罐在50℃发酵68h可以产生50.8g/L的乙偶姻和32.1g/L的2,3‑丁二醇。本发明提供的高温发酵生产乙偶姻和2,3‑丁二醇的方法具有原料成本低、发酵过程抗杂菌污染、节约冷却水、操作粗放等优点。

Description

一株芽孢杆菌及其在高温发酵生产乙偶姻和2,3-丁二醇中的 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株芽孢杆菌及其应用。
背景技术
乙偶姻即3-羟基-2-丁酮，在食品、香料、化妆品、手性合成等领域有重要的用途(Xiao and Lu,2014)。2,3-丁二醇在化工合成、食品、燃料、防冻等领域有重要的用途(Jiet al.,2011)。乙偶姻和2,3-丁二醇可由可再生原料发酵生产，是重要的新兴平台化合物(Xu et al.,2012)。两者是某些细菌中乙偶姻代谢途径的产物，可以在细胞内通过2,3-丁二醇脱氢酶的作用相互转化。乙偶姻和2,3-丁二醇在发酵产物中往往同时存在，但它们两者沸点相差较大，可以通过蒸馏很容易地相互分离。
发酵法生产乙偶姻和2,3-丁二醇具有良好的市场前景，吸引了大量国内外开发研究人员，取得了一些研究进展。但迄今绝大多数发酵法生产乙偶姻和2,3-丁二醇的研究文献报道都是采用中温(30–40℃)发酵法(Xiao and Lu,2014)，为了防止发酵过程中污染杂菌，培养基要经过高温蒸汽灭菌，这就必然涉及一系列灭菌设备，操作繁琐、消耗大量的蒸汽和冷却水，而且高温灭菌容易引起大量的糖损失和产生很多影响正常发酵的有害化学物质。一般发酵过程是放热的，所以中间过程也需要消耗冷却水(Cripps et al.,2009)。虽然发酵过程中采取各种措施控制污染，但往往仍存在不同程度的倒灌率，有时甚至影响到正常生产运行(Skinner and Leathers,2004)。
研究者通常将温度为45–65℃的发酵方法称为高温发酵法，近年来开始受到研究重视(Cripps et al.,2009)。一般情况下环境中的杂菌在45℃以上就很难生长或被杀死，因此高温发酵可以较好地解决污染杂菌问题。较高的发酵温度还可以加快反应速率、节约冷却水、操作粗放，甚至可以免灭菌(Qin et al.,2009)。因此高温发酵较中温发酵而言具有独到的优势，极具开发潜力。
迄今国内外高温发酵生产乙偶姻和2,3-丁二醇的研究报道非常少，本发明人所在课题组曾采用一株Geobacillus菌高温发酵生产这两种产物(Xiao et al.,2012)，并获授权中国发明专利1项(ZL 201210060900.6)，但该方法的发酵培养基采用葡萄糖、蛋白胨、酵母粉等原料，成本非常高，不适合低成本、大规模工业生产的需要。
参考文献:
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发明内容
针对上述目前研究和生产现状的缺点与不足，本发明提供一株芽孢杆菌及其在高温发酵生产乙偶姻和2,3-丁二醇中的应用方法。
本发明提供的芽孢杆菌Bacillus sp.H15-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.12389，保藏日期为2016年4月25日。
开发高温发酵生产乙偶姻和2,3-丁二醇技术的关键之一就是筛选获得嗜热并且高产乙偶姻和2,3-丁二醇的菌株。本发明提供的菌株芽孢杆菌Bacillus sp.H15-1革兰氏染色呈阳性，产芽孢，细胞形态为杆状；55℃条件下，采用Luria-Bertani固体培养基培养6小时，可得到直径大小约为2-3mm、表面有褶皱的灰白色菌落。通过对本发明菌株的16SrDNA进行测序，并将本发明菌株的16S rDNA序列和EzTaxon数据库中已收录的细菌模式菌株的16S rDNA序列进行核苷酸序列同源性比对，发现本发明菌株的16S rDNA序列与已知芽孢杆菌(Bacillus)属的菌株的16S rDNA序列的同源性大于99％。本发明菌株的16S rDNA序列已提交到GenBank数据库中，登录号为KX094416。本发明菌株芽孢杆菌Bacillus sp.H15-1可在40–60℃范围内生长，50℃时增殖最快，表明此菌株为嗜热菌株。
本发明提供的利用芽孢杆菌Bacillus sp.H15-1高温发酵生产乙偶姻和2,3-丁二醇的应用方法，其涉及的实施步骤如下：
第一步：活化菌株：将本发明提供的菌株芽孢杆菌Bacillus sp.H15-1划线接种到Luria-Bertani固体培养基上，置于55℃的恒温箱中培养6h以上，至菌落生长丰满。
所述Luria-Bertani固体培养基每升中含有：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，17g琼脂粉。调培养基pH至7.0。
第二步：制备液体种子：用接种环挑取上述步骤获得的菌落，接种到Luria-Bertani液体培养基中，50℃摇床培养10h。采用体积为250mL的挡板摇瓶，每个挡板摇瓶的装液量为50mL；采用回旋式摇床，转速设定在150rpm。
所述Luria-Bertani液体培养基每升中含有：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠。调培养基pH至7.0。
第三步：发酵生产乙偶姻和2,3-丁二醇：将上述步骤获得的液体种子按5％体积比接种到发酵培养基中，50℃发酵培养。用到的反应器为4.2L的机械搅拌通风发酵罐，发酵罐内径为125mm，发酵罐内装有2个六直叶搅拌桨。发酵罐内装入2L发酵培养基，搅拌转速设为600rpm，通风量为0.9vvm，pH在发酵一开始的48h内控制在6.6-7.1，发酵进行到48h以后pH控制在7.7-8.0。在发酵过程中取样并用气相色谱检测产物，监测发酵进程。
所述发酵培养基为在脱胚玉米粉水解液中加入1％的玉米浆粉、3g/L的KH2PO4、0.3g/L的乙酸钠、0.2g/L的CaCl2和0.1g/L的MgSO4。
所述脱胚玉米粉水解液制备过程为：将80-100目的脱胚玉米粉加入到水中，配制成浓度为30％的悬液，并按每克干重脱胚玉米粉加入3U的α-淀粉酶，用饱和Na2CO3溶液调节pH至7.0，加热至75-80℃，并在75-80℃保持20min；然后降低温度至65-70℃，再按每克干重脱胚玉米粉加入7U的α-淀粉酶，并在65-70℃保持1h；然后降低温度至58-60℃，用盐酸溶液调节pH至4.5，再按每克干重脱胚玉米粉加入200U的γ-淀粉酶，并在58-60℃保持1h。整个脱胚玉米粉水解液制备过程保持快速搅拌，以防止局部过热。
所述玉米浆粉为工业上采用亚硫酸浸泡法制造玉米淀粉时得到的副产物“玉米浆”再经喷雾干燥制得的副产品，为发酵工业中常用的一种培养基原料。
利用本发明所述芽孢杆菌Bacillus sp.H15-1，采用上述廉价的发酵培养基和生产方法，50℃发酵68h可以产生50.8g/L的乙偶姻和32.1g/L的2,3-丁二醇，高于多数文献报道，极具实际应用潜力。
附图说明
附图是芽孢杆菌Bacillus sp.H15-1CGMCC No.12389生产乙偶姻和2,3-丁二醇的过程曲线。
具体实施方式
实施例1：菌株富集筛选与分离纯化
1.1环境样品采集
从山东省青岛市胶州湾海滩、唐岛湾公园等地方采集样品。
1.2菌株初筛
将上述样品分别加入到无菌水中，快速搅拌并自然沉降10min，然后取上清液适当稀释后涂布到Luria-Bertani固体培养基上，在60℃培养24h。挑取单菌落，经多次划线分离纯化得到多个纯的菌株。
1.3菌株复筛
将上述实验得到的纯的菌株，分别接种到复筛培养基中，在55℃摇瓶培养24h后，用气相色谱检测产物。所述复筛培养基每升中含有：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，40g葡萄糖。调培养基pH至7.0。
经过复筛，发现来源于胶州湾海滩上一段生锈的钢丝绳样品的1株细菌乙偶姻和2,3-丁二醇产量较高，将此菌株命名为H15-1，即为本发明菌株。将得到的目的菌株采用斜面传代法、低温甘油法、低温真空干燥法等常规方法保存备用。
实施例2：菌株鉴定与保藏
将实施例1得到的菌株H15-1进行检验，其革兰氏染色呈阳性，产芽孢，细胞形态为杆状；55℃条件下，采用Luria-Bertani固体培养基培养6小时，可得到直径大小约为2-3mm、表面有褶皱的灰白色菌落。本发明菌株H15-1可在40–60℃范围内生长，50℃时增殖最快，表明此菌株为嗜热菌株。
通过对本发明菌株的16S rDNA进行测序，并将本发明菌株的16S rDNA序列和EzTaxon数据库中已收录的细菌模式菌株的16S rDNA序列进行核苷酸序列同源性比对，发现本发明菌株的16S rDNA序列与已知芽孢杆菌(Bacillus)属的菌株的16S rDNA序列的同源性大于99％，因此将该菌株鉴定为芽孢杆菌(Bacillus)属。
2016年4月25日将本发明菌株芽孢杆菌Bacillus sp.H15-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12389。
实施例3：利用芽孢杆菌Bacillus sp.H15-1高温发酵生产乙偶姻和2,3-丁二醇的应用方法
具体实施步骤如下：
3.1活化菌株
将本发明提供的菌株芽孢杆菌Bacillus sp.H15-1划线接种到Luria-Bertani固体培养基上，置于55℃的恒温箱中培养6h以上，至菌落生长丰满。
所述Luria-Bertani固体培养基每升中含有：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，17g琼脂粉。调培养基pH至7.0。
3.2制备液体种子
用接种环挑取上述步骤获得的菌落，接种到Luria-Bertani液体培养基中，50℃摇床培养10h。采用体积为250mL的挡板摇瓶，装液量为50mL；采用回旋式摇床，转速设定在150rpm。
所述Luria-Bertani液体培养基每升中含有：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠。调培养基pH至7.0。
3.3发酵生产乙偶姻和2,3-丁二醇
将上述步骤获得的液体种子按5％体积比接种到发酵培养基中，50℃发酵培养。用到的反应器为4.2L的机械搅拌通风发酵罐，发酵罐内径为125mm，发酵罐内装有2个六直叶搅拌桨。发酵罐内装入2L发酵培养基，搅拌转速设为600rpm，通风量为0.9vvm，pH在发酵一开始的48h内控制在6.6-7.1，发酵进行到48h以后时pH控制在7.7-8.0。在发酵过程中取样并用气相色谱检测产物，在68h可以检测到样品中含有50.8g/L的乙偶姻和32.1g/L的2,3-丁二醇，此时即可以停止发酵，收获产物。
所述发酵培养基为在脱胚玉米粉水解液中加入1％的玉米浆粉、3g/L的KH2PO4、0.3g/L的乙酸钠、0.2g/L的CaCl2和0.1g/L的MgSO4。
所述脱胚玉米粉水解液制备过程为：将80-100目的脱胚玉米粉加入到水中，配制成浓度 为30％的悬液，并按每克干重脱胚玉米粉加入3U的α-淀粉酶，用饱和Na2CO3溶液调节pH至7.0，加热至75-80℃，并在75-80℃保持20min；然后降低温度至65-70℃，再按每克干重脱胚玉米粉加入7U的α-淀粉酶，并在65-70℃保持1h；然后降低温度至58-60℃，用盐酸溶液调节pH至4.5，再按每克干重脱胚玉米粉加入200U的γ-淀粉酶，并在58-60℃保持1h。整个脱胚玉米粉水解液制备过程保持快速搅拌，以防止局部过热。
所述玉米浆粉为工业上采用亚硫酸浸泡法制造玉米淀粉时得到的副产物“玉米浆”再经喷雾干燥制得的副产品，为发酵工业中常用的一种培养基原料。

Claims (3)

1.芽孢杆菌Bacillus sp.H15-1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.12389。
2.一种利用权利要求1所述的芽孢杆菌Bacillus sp.H15-1 CGMCC No.12389在高温发酵生产乙偶姻和2,3-丁二醇中的应用。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：利用所述芽孢杆菌Bacillus sp.H15-1CGMCC No.12389高温发酵生产乙偶姻和2,3-丁二醇时的发酵温度为50℃。
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