CN103238829A - 一种纳豆激酶肠溶胶囊及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及保健食品领域，具体地，本发明涉及一种纳豆激酶肠溶胶囊及其制备方法。本发明的纳豆激酶肠溶胶囊，其中，所述胶囊外包有甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物包衣，胶囊纳豆激酶冻干粉含量为0.15-0.2g/粒，纳豆激酶活性为600-800FU/粒；其中，所述纳豆激酶冻干粉经由鹰嘴豆纳豆食品制备获得，所述鹰嘴豆纳豆食品经由枯草芽孢杆菌LSSE-22发酵所得，其中，所述枯草芽孢杆菌LSSE-22(Bacillus subtilis)，其保藏编号为：CGMCC No.4970。本发明的纳豆激酶肠溶胶囊在模拟胃酸环境中不崩解，保持良好的外观，酶活无损失，在模拟肠道环境中缓慢释放，8h达到完全释放。解决了纳豆激酶胃酸失活问题，并实现其在肠道环境中的控制释放。

Description

一种纳豆激酶肠溶胶囊及其制备方法

技术领域

本发明涉及保健食品领域，具体地，本发明涉及一种纳豆激酶肠溶胶囊及其制备方法。

背景技术

纳豆激酶是由枯草芽孢杆菌合成的一种溶栓酶，该酶可由微生物发酵大量制备，价格低廉；来源于纳豆食品，可口服、安全副作用小；该酶具有高效的双重溶栓活性，不仅可以直接降解纤维蛋白，而且可激活人体纤溶酶原，产生内源性纤溶酶；体内试验显示该酶作用持久，半衰期长。因其诸多优势，成为近年来溶栓类产品的开发热点(详见参考文献1：Peng Y，Yang X，Zhang Y.Microbial fibrinolytic enzymes：anoverview of source，production，properties，and thrombolytic activity in vivo.ApplMicrobiol Biotechnol，2005，69：126-132)。

纳豆激酶对pH环境比较敏感，在pH＜5的情况下，活性逐渐丧失，暴露在胃酸(PH1.2-3)的环境下1h，几乎完全失活。通过聚谷氨酸微胶囊技术包裹纳豆激酶，未解决胃酸失活的问题(详见参考文献2：Hsieh，CW，Lu WC，Hsieh，WC，Huang YP，Lai CH，Ko WC.Improvement of the stability of nattokinase using[gamma]-polyglutamicacid as a coating material for microencapsulation.LWT-Food Science and Technology，2009，42：144-149)。目前市场上存在的纳豆激酶产品以胶囊为主，通过对收集到的8种纳豆激酶胶囊进行检测，均不具备耐酸性，在模拟胃酸环境下保持2h，胶囊迅速崩解，酶活完全丧失。纳豆激酶酸性失活现象是制约其口服效果的重要因素。有文献报道，通过甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯聚合物包衣技术制备纳豆激酶肠溶片剂，解决了纳豆激酶片剂胃酸失活的问题(详见参考文献3：Law D，Zhang Z.Stabilizationand target delivery of nattokinase using compression coating.Drug Dev Ind Pharm，2007，33：495-503)。甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物是一种新型的肠溶包衣材料，具有较好的抗酸活性，然而未见将该聚合物应用到纳豆激酶产品包衣的报道。

因此，本发明期望运用甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物对纳豆激酶胶囊进行包衣处理，制备纳豆激酶肠溶胶囊，通过对纳豆激酶进行抗酸保护，希望解决纳豆激酶胃酸失活问题，并实现其在肠道环境中的控制释放。

发明内容

本发明的目的是提供一种纳豆激酶肠溶胶囊。

本发明的另一目的是提供上述纳豆激酶肠溶胶囊的制备方法。

本发明的纳豆激酶肠溶胶囊，其中，所述胶囊外包有甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物包衣，胶囊纳豆激酶冻干粉含量为0.15-0.2g/粒，纳豆激酶活性为600-800FU/粒；

其中，所述纳豆激酶冻干粉经由鹰嘴豆纳豆食品制备获得，所述鹰嘴豆纳豆食品经由枯草芽孢杆菌LSSE-22发酵所得，其中，所述枯草芽孢杆菌LSSE-22(Bacillussubtilis)，其保藏编号为：CGMCC No.4970。

上述枯草芽孢杆菌LSSE-22(Bacillus subtilis)，于2011年6月22日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.4970。

本发明的纳豆激酶肠溶胶囊，在不同pH的酸性环境下保持2h，酶活均没有损失；在模拟胃酸环境中不崩解，保持良好的外观，酶活无损失，在模拟肠道环境中缓慢释放，8h达到完全释放。

本发明的纳豆激酶肠溶胶囊的制备方法，包括以下步骤：

1)纳豆激酶冻干粉制备：向鹰嘴豆纳豆食品中添加2倍体积(v/w)的30％-50％的乙醇溶液，200r/min，浸提1h。5000-10000g离心10-50min，收集上清液，继续添加无水乙醇至75％，沉淀纳豆激酶，5000-10000g离心10-50min，冷冻干燥，获得纳豆激酶冻干粉；

2)肠溶胶囊制备：按照0.15-0.2g/粒的规格装填纳豆激酶明胶胶囊，通过5-15％的甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物的乙醇溶液浸泡3-5次，40℃-50℃鼓风干燥1h，制得纳豆激酶肠溶胶囊。

根据本发明的纳豆激酶肠溶胶囊的制备方法，其中，所述鹰嘴豆纳豆食品的制备方法，包括以下步骤：

1)将枯草芽孢杆菌LSSE-22菌株接在LB液体培养基上37℃培养12h后放置于无菌管中，-70℃冷冻保藏；

2)制备种子液；

3)制备鹰嘴豆发酵底物；

4)发酵培养：按照2％-5％(v/w)的接种量，将种子液加入鹰嘴豆发酵底物中混匀，31-37℃静止培养36-48h，获得鹰嘴豆纳豆食品。

根据本发明的纳豆激酶肠溶胶囊的制备方法，其中，所述种子液制备方法包括以下步骤：

1)将冷冻保藏的菌种接种到LB固体培养基平板上，37℃培养12h，使其活化；

2)将活化的菌种转接到LB液体种子培养基中，37℃，180rpm培养8-14h，制得种子液。

根据本发明的纳豆激酶肠溶胶囊的制备方法，其中，所述鹰嘴豆发酵底物制备方法包括以下步骤：

1)精选：去除变色、霉烂、虫蛀的豆子，除去其中杂物，并用水清洗；

2)浸泡：加入5倍体积(v/w)的水，室温浸泡12h；

3)沥水，使豆子的初始含水量为50％-70％；

4)蒸煮：将完整豆子或者经破碎处理的豆子在115℃高温高压蒸煮30min，制得豆类发酵底物。

本发明所提供的纳豆激酶肠溶胶囊及其制备方法，具有较强的创新性和实用性，其优点如下：

(1)首次通过甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物对鹰嘴豆纳豆食品来源纳豆激酶明胶胶囊进行包衣处理，制备纳豆激酶肠溶胶囊，该胶囊在不同pH的酸性环境下保持2h，酶活均没有损失。

(2)体外释放试验表明，本发明所制备纳豆激酶肠溶胶囊在模拟胃酸环境中不崩解，保持良好的外观，酶活无损失，在模拟肠道环境中缓慢释放，8h达到完全释放。解决了纳豆激酶胃酸失活问题，并实现其在肠道环境中的控制释放。

附图说明

图1为纳豆激酶冻干粉及纳豆激酶肠溶胶囊的抗酸性能，其中对照组为纳豆激酶冻干粉。

图2为纳豆激酶肠溶胶囊在模拟胃肠道环境中的释放曲线。

枯草芽孢杆菌LSSE-22(Bacillus subtilis)，于2011年6月22日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.4970。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行详细说明，但所有实施例并不对本发明构成任何限制。

实施例1 纳豆激酶冻干粉的制备

1、鹰嘴豆纳豆食品制备：

1)用冷冻保藏的枯草芽孢杆菌LSSE-22为原始菌种；其中，所述枯草芽孢杆菌LSSE-22(Bacillus subtilis)，其保藏编号为：CGMCC No.4970；

2)斜面菌种活化：将冷冻保藏的菌种，转接到LB固体平板，37℃培养12h；

3)种子液培养：将LB固体平板活化的种子转接到LB液体培养基，37℃，180rpm培养8-14h；

4)鹰嘴豆底物制备：

a、鹰嘴豆精选：去除变色、霉烂、虫蛀的鹰嘴豆，除去其中混有的砂石、土块等杂物，并用水清洗两边；

b、浸泡：加入5倍体积(v/w)水，室温浸泡12h；

c、沥水：沥去浸泡后的鹰嘴豆中多余的水分，初始含水量为50％-70％；

d、蒸煮：将完整豆子或者经破碎处理的豆子115℃高温高压蒸煮30min，冷却至室温；

5)发酵培养：按照2％-5％(v/w)的接种量，加入鹰嘴豆中混匀，31-37℃静止培养36-48h，获得鹰嘴豆纳豆食品。

2、冻干粉制备：以鹰嘴豆纳豆食品为原料，向其中添加2倍体积(v/w)的30％-50％的乙醇溶液，200r/min，浸提1h。5000-10000g离心10-50min，收集上清液，继续添加无水乙醇至75％，沉淀纳豆激酶，5000-10000g离心10-50min，冷冻干燥48h。

3、活性检测：纳豆激酶活性检测通过纤维蛋白溶解法进行，向试管中依次加入0.4mL纤维蛋白原溶液(0.72％，w/v)，1.4mL Tris-HCl(50mM，pH 7.8)，37℃温浴5min，然后加入0.1mL凝血酶溶液(20U/mL)，37℃温浴10min，再加入0.1mL的稀释酶样品，37℃温浴60min，加入2mL三氯乙酸(0.2M)静止20min终止反应，4000g离心15min，取上清于275nm比色测定吸光度，1个单位的纤维蛋白降解酶活(FU)相当于每分钟275nm处吸光度增加0.01所需要的酶量。经检测，纳豆激酶冻干粉中纳豆激酶活性为3250.82-4000.58FU/g。

实施例2 纳豆激酶肠溶胶囊的制备

纳豆激酶肠溶胶囊制备：将纳豆激酶冻干粉，按照0.15g/粒的规格装填纳豆激酶明胶胶囊，通过5％的甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物的乙醇溶液进行浸泡包衣3次，40℃鼓风干燥1h。所制胶囊纳豆激酶活性为600FU/粒。

实施例3 纳豆激酶肠溶胶囊的制备

纳豆激酶肠溶胶囊制备：将纳豆激酶冻干粉，按照0.2g/粒的规格装填纳豆激酶明胶胶囊，通过10％的甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物的乙醇溶液进行浸泡包衣3次，40℃鼓风干燥1h。所制胶囊纳豆激酶活性为800FU/粒。

实施例4 纳豆激酶肠溶胶囊的制备

纳豆激酶肠溶胶囊制备：将纳豆激酶冻干粉，按照0.2g/粒的规格装填纳豆激酶明胶胶囊，通过15％的甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物的乙醇溶液进行浸泡包衣5次，50℃鼓风干燥1h。所制胶囊纳豆激酶活性为800FU/粒。

实施例5 纳豆激酶肠溶胶囊特性试验

1、抗酸试验：以0.2g纳豆激酶冻干粉为对照，将对照及纳豆激酶肠溶胶囊分别暴露在不同的pH环境条件下：pH 1.2(0.1mol/L HCl，pH 2.5(0.01mol/L HCl)，pH 5.0(50mmol/L乙酸缓冲液体系)，pH 7.4(50mmol/L磷酸缓冲液体系)，37℃，100r/min处理2h，然后将各缓冲液pH调至7.4，通过200r/min进行5h均质处理，检测酶活。结果如图1所示，纳豆激酶冻干粉在pH 1.2和pH 2.5的条件下，酶活完全丧失；纳豆激酶胶囊在所测的各种酸性pH条件下，酶活没有显著性变化，说明所制备的纳豆激酶肠溶胶囊具有良好的抗酸效果，对纳豆激酶起到了较好的保护作用。

2、体外释放试验：将纳豆激酶肠溶胶囊暴露在模拟胃酸条件下(pH 1.2，0.1mol/LHCl)，37℃，100r/min处理2h，然后将其转移到模拟肠道环境中(pH 7.4，50mmol/L磷酸缓冲液体系)，37℃，100r/min处理继续处理8h，每隔1h，取样检测纳豆激酶酶活，结果如图2所示，在模拟胃酸条件下，纳豆激酶肠溶胶囊保持完整的外形，未释放纳豆激酶；当转移到模拟肠道环境后，纳豆激酶肠溶胶囊缓慢崩解，纳豆激酶逐渐释放，在8h，纳豆激酶完全释放。说明所制备的肠溶胶囊可保护纳豆激酶免受胃酸失活，实现了纳豆激酶在肠道环境中的控制释放。

Claims (5)

1.一种纳豆激酶肠溶胶囊，其特征在于，所述胶囊外包有甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物包衣，胶囊纳豆激酶冻干粉含量为0.15-0.2g/粒，纳豆激酶活性为600-800FU/粒；

其中，所述纳豆激酶冻干粉经由鹰嘴豆纳豆食品制备获得，所述鹰嘴豆纳豆食品经由枯草芽孢杆菌LSSE-22发酵所得，其中，所述枯草芽孢杆菌LSSE-22(Bacillussubtilis)，其保藏编号为：CGMCC No.4970。

2.一种纳豆激酶肠溶胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)纳豆激酶冻干粉制备：向鹰嘴豆纳豆食品中添加2倍体积(v/w)的30％-50％的乙醇溶液，200r/min，浸提1h；5000-10000g离心10-50min，收集上清液，继续添加无水乙醇至75％，沉淀纳豆激酶，5000-10000g离心10-50min，冷冻干燥，获得纳豆激酶冻干粉；

2)肠溶胶囊制备：按照0.15-0.2g/粒的规格装填纳豆激酶明胶胶囊，通过5-15％的甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物的乙醇溶液进行浸泡包衣3-5次，40℃-50℃鼓风干燥1h，制得纳豆激酶肠溶胶囊。

3.根据权利要求2所述纳豆激酶肠溶胶囊的制备方法，其特征在于，所述鹰嘴豆纳豆食品的制备方法，包括以下步骤：

1)将枯草芽孢杆菌LSSE-22菌株接在LB液体培养基上37℃培养12h后放置于无菌管中，-70℃冷冻保藏；

2)制备种子液；

3)制备鹰嘴豆发酵底物；

4)发酵培养：按照2％-5％(v/w)的接种量，将种子液加入鹰嘴豆发酵底物中混匀，31-37℃静止培养36-48h，获得鹰嘴豆纳豆食品。

4.根据权利要求3所述的纳豆激酶肠溶胶囊的制备方法，其特征在于，所述种子液制备方法包括以下步骤：

1)将冷冻保藏的菌种接种到LB固体培养基平板上，37℃培养12h，使其活化；

2)将活化的菌种转接到LB液体种子培养基中，37℃，180rpm培养8-14h，制得种子液。

5.根据权利要求3所述的纳豆激酶肠溶胶囊的制备方法，其特征在于，所述鹰嘴豆发酵底物制备方法包括以下步骤：

1)精选：去除变色、霉烂、虫蛀的豆子，除去其中杂物，并用水清洗；

2)浸泡：加入5倍体积(v/w)的水，室温浸泡12h；

3)沥水，使豆子的初始含水量为50％-70％；

4)蒸煮：将完整豆子或者经破碎处理的豆子在115℃高温高压蒸煮30min，制得豆类发酵底物。

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