CN104388347A - 一种高芽孢率高抗逆性饲用枯草芽孢杆菌固态发酵方法 - Google Patents

一种高芽孢率高抗逆性饲用枯草芽孢杆菌固态发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高芽孢率高抗逆性饲用枯草芽孢杆菌固态发酵方法，选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CICC 10453)，采用分段温度控制法利用以麸皮为主的固态培养基发酵培养，发酵后无需烘干，直接收集粉碎过筛，即得枯草芽孢杆菌固体成品。本发明所得菌剂成品中有效枯草芽孢杆菌达到1.0×1010CFU/g以上，芽孢率在95％以上，具有极好的耐酸、耐胆盐及耐高温性能。作为饲料添加剂，本产品能够很大程度上避免饲料加工过程中所造成的不必要损失，同时有利于菌剂通过动物胃部苛刻的强酸环境，在肠道内部发挥有利作用。

Description

一种高芽孢率高抗逆性饲用枯草芽孢杆菌固态发酵方法
技术领域
本发明涉及饲用微生物发酵工程技术领域，特别涉及一种高芽孢率高抗逆性的饲用枯草芽孢杆菌固态发酵方法。
背景技术
抗生素在中国具有较高的使用率，其中一半主要应用于医药行业，另一半则应用于养殖业。自20世纪50年代人们发现饲料中添加低浓度的抗生素可以预防动物细菌性疾病的发生并可促进动物生长后，抗生素的应用日益泛滥，继而导致了诸多食品安全及生物安全问题，如药物残留、耐药细菌产生等。
鉴于抗生素滥用引发的一系列问题，人们逐渐将目光转移至微生态制剂。我国动物微生态制剂的研究起步相对较晚，但发展较快。目前国内已有一些科研单位、企业研发并生产出相关饲用微生物，并应用于动物养殖中。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种产芽孢的G+细菌，其菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，对致病菌或内源性感染的条件性致病菌有明显的抑制作用；能够迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进厌氧菌的生长，继而降低肠道pH值，抑制病原微生物的生长；另外枯草芽孢杆菌能够合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性。我国农业部将其列为免做安全鉴定的一级菌种。枯草芽孢杆菌在一定条件下，会生成芽孢。以芽孢状态存在的菌体，具有极强的抗逆性，如耐高温、耐酸碱、耐挤压。芽孢形态能够很大程度上避免饲料加工过程中所造成的不必要损失，有利于储存，同时有利于菌剂通过动物胃部苛刻的强酸环境，在肠道内发挥自身益生功效。
国内目前对枯草芽孢杆菌的研究主要集中在菌种的筛选、抑菌效果和成分分析中，缺乏对枯草芽孢杆菌实际工业生产方面的相关技术指导和技术积累。现有的培养方法发酵枯草芽孢杆菌，芽孢率在80％左右，发酵完毕之后需要烘干或风干，生产效果也不尽理想，如何在保证有效菌数的同时，尽可能提高芽孢率，同时兼顾生产成本，成为困扰枯草芽孢杆菌实际工业生产的瓶颈问题。
发明内容
本发明提供了一种高芽孢率高抗逆性的饲用枯草芽孢杆菌固态发酵方法，能够有效解决目前枯草芽孢杆菌菌剂制备过程中芽孢不足的问题，使其具有极好的耐酸、耐胆盐及耐高温性能，能够很大程度上避免饲料加工过程中所造成的不必要损失，同时有利于菌剂通过动物胃部苛刻的强酸环境，在肠道内部发挥有利作用。
为了解决上述问题，本发明提供一种高芽孢率高抗逆性饲用枯草芽孢杆菌固态发酵方法。具体步骤是：
(1)菌株：选用枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CICC 10453；
(2)种子培养：将步骤(1)所述菌株，在营养琼脂培养基上活化培养；之后在无菌条件下挑取单菌落接种至20mL营养肉汤培养基中振荡培养获得一级种子液；将所述一级种子液接种于营养肉汤培养基中扩大培养得到二级种子液；
(3)固态发酵培养：将所述二级种子液与营养盐溶液共同接种于固态培养基中，充分混合后将其平铺于浅盘中发酵，发酵完毕直接收集，粉碎过40目筛，即得枯草芽孢杆菌固态发酵成品。
其中，所述枯草芽孢杆菌是Bacillus subtilis CICC 10453，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
其中，所述步骤(2)中营养琼脂培养基，组成为牛肉膏0.3％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％，琼脂2.0％，蒸馏水配制，pH 7.2～7.4。
其中，营养肉汤培养基，组成为牛肉膏0.3％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％，蒸馏水配制，pH 7.2～7.4。
其中，所述步骤(2)中营养琼脂培养基活化培养条件为37℃倒置培养16～24h；一级种子培养条件为37℃，160～180rpm振荡培养4～8h；二级种子培养条件为接种量1～5％，37℃，160～180rpm振荡培养3～6h。
其中，所述步骤(2)中一级种子液的浓度为1×109CFU/mL；二级种子液的浓度为2×109CFU/mL。
其中，所述步骤(3)中固态培养基制备方法：以质量计，70～90％麦麸，10～30％稻壳，121℃灭菌30min。
其中，所述步骤(3)中营养盐溶液的配制：0.5～1.0％葡萄糖、0.5～1.0％蛋白胨、0.2～0.8％硫酸铵、0.5～1.5％磷酸二氢钾、0.01～0.04％硫酸锰，自来水配制，调节pH值至6～8，115℃灭菌20min。
其中，所述步骤(3)中二级种子液、营养盐与固态培养基质量比为0.05～0.2：0.4～0.7：1。
其中，所述步骤(3)中浅盘发酵高度为2cm～4cm。
其中，所述步骤(3)中发酵分为两个阶段，菌体生长阶段与芽孢生成阶段；菌体生长阶段培养条件为：32～37℃发酵24～36h；芽孢生成阶段培养条件为：37～40℃发酵12～24h。
其中，所述步骤(3)中枯草芽孢杆菌固态发酵成品水分不高于14％。
与现有技术相比，本发明的优越性为：
本发明采用分阶段温度控制法在保证菌体密度的同时，极大的提高了菌体的芽孢产率，通过本发明发酵生产出的产品具有良好的耐酸、耐胆盐及耐高温性，由此可以确保产品在经制粒及动物胃环境后仍然具有较高的存活率，从而在动物肠道中发挥其益生功能。
本发明提供的浅盘发酵工艺，解决了芽孢率低及热量积聚导致的菌体生长代谢停滞问题，种子培养周期短，发酵结束可直接收集粉碎，无须烘干，大大缩短了生产周期及发酵后烘干所需能耗。
本发明中用于枯草芽孢杆菌固体发酵的原料主要为麸皮、稻壳粉，原料成本低廉，同时生产过程中无有毒物质残留，能够变废为宝，适合大规模商业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
实施例1，
(1)菌株：选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CICC 10453)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；
(2)将步骤(1)中所述菌株在营养琼脂培养基上三区划线，37℃培养24h；
在无菌条件下挑取单菌落接种至20mL营养肉汤培养基中，37℃、180rpm振荡培养5h获得一级种子液；
以5％接种量，将一级种子液接种于营养肉汤培养基中，37℃、180rpm振荡培养4h，得到二级种子液；
上述营养琼脂培养基，组成为牛肉膏0.3％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％，琼脂2.0％，蒸馏水配制，pH 7.2～7.4；营养肉汤培养基，组成为牛肉膏0.3％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％，蒸馏水配制，pH 7.2～7.4；
(3)将二级种子液、营养盐溶液共同接种于固态培养基中，三者的比例为0.05：0.7：1，充分混合后将其平铺于不锈钢托盘中，料层厚度为2cm，32℃发酵36h后改变发酵条件为37℃发酵24h；
上述固态培养基制备方法：以质量计，80％麦麸，20％稻壳，121℃灭菌30min；营养盐溶液的配制：1.0％葡萄糖、1.0％蛋白胨、0.5％(NH4)2SO4、1.0％KH2PO4、0.02％MnSO4，自来水配制，调节pH值至7.2，115℃灭菌20min。
(4)将步骤(3)的发酵产物直接收集粉碎过40目筛，真空包装。
(5)菌落计数。
成品菌落计数方法参考中华人民共和国国家标准GB/T26428-2010饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测。
产品测定结果如下：有效活菌数为1.7x1010cfu/克发酵干料，芽孢率100％，水分13.04％。
实施例2，
(1)菌株：选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CICC 10453)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；
(2)将步骤(1)中所述菌株在营养琼脂培养基上三区划线，37℃培养24h；
在无菌条件下挑取单菌落接种至20mL营养肉汤培养基中，37℃、180rpm振荡培养6h获得一级种子液；
以1％接种量，将一级种子液接种于营养肉汤培养基中，37℃、180rpm振荡培养6h，得到二级种子液；
上述营养琼脂培养基，组成为牛肉膏0.3％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％，琼脂2.0％，蒸馏水配制，pH 7.2～7.4；营养肉汤培养基，组成为牛肉膏0.3％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％，蒸馏水配制，pH 7.2～7.4；
(3)将二级种子液、营养盐溶液共同接种于固态培养基中，三者的比例为0.2∶0.4∶1，充分混合后将其平铺于不锈钢托盘中，料层厚度为4cm，35℃发酵30h后改变发酵条件为40℃发酵12h。
上述固体发酵培养基制备方法：以质量计，80％麦麸，20％稻壳，121℃灭菌30min。营养盐溶液的配制：1.0％葡萄糖、0.5％蛋白胨、0.4％(NH4)2SO4、0.5％KH2PO4、0.02％MnSO4，自来水配制，调节pH值至6.5，115℃灭菌20min。
(4)将步骤(3)中的发酵产物直接收集粉碎过40目筛，真空包装。
(5)菌落计数。产品测定结果如下：有效活菌数为1.4x1010cfu/克发酵干料，芽孢率100％，水分8.02％。
实施例3，
(1)菌株：选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CICC 10453)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；
(2)将步骤(1)中所述菌株在营养琼脂培养基上三区划线，37℃培养24h；
在无菌条件下挑取单菌落接种至20mL营养肉汤培养基中，37℃、160rpm振荡培养8h获得一级种子液；
以2％接种量，将一级种子液接种于营养肉汤培养基中，37℃、160rpm振荡培养4h，得到二级种子液；
上述营养琼脂培养基，组成为牛肉膏0.3％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％，琼脂2.0％，蒸馏水配制，pH 7.2～7.4；营养肉汤培养基，组成为牛肉膏0.3％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％，蒸馏水配制，pH 7.2～7.4；
(3)将二级种子液、营养盐溶液共同接种于固态培养基中，三者的比例为0.15∶0.65∶1，充分混合后将其平铺于不锈钢托盘中，料层厚度为2cm，32℃发酵36h后改变发酵条件为38℃发酵24h。
上述固体发酵培养基制备方法：以质量计，90％麦麸，10％稻壳，121℃灭菌30min；营养盐溶液的配制：0.5％葡萄糖、0.5％蛋白胨、0.5％(NH4)2SO4、0.5％KH2PO4、0.02％MnSO4，自来水配制，调节pH值至8.0，115℃灭菌20min。
(4)将步骤(3)中的发酵产物直接收集粉碎过40目筛，真空包装。
(5)菌落计数。
产品测定结果如下：有效活菌数为1.5×1010/克发酵干料，芽孢率96％，水分12.63％。
实施例4，抗逆性能测定
(1)耐高温性
对照组：无菌称取10g样品，加入到含有90mL生理盐水的三角瓶中，20℃200r/min振荡摇匀0.5h。十倍梯度稀释法倾注平板测定活菌数。
试验组：将含有90mL无菌生理盐水的三角瓶分别置于90℃水浴锅中预热20～30min，使瓶内温度与水浴锅温度一致，称取10g样品加至相应的三角瓶中，处理5分钟后迅速在冰浴中冷却，20℃200r/min振荡0.5小时后通过梯度稀释法倾注平板测定活菌数。
测定结果：经过90℃处理5min后，样品中菌株存活率为92％。
(2)耐酸性
对照组：无菌称取10g样品，加入到含有90mL生理盐水的三角瓶中，37℃恒温培养箱培养2h后，20℃200r/min振荡摇匀0.5h通过十倍梯度稀释法倾注平板测定活菌数。
试验组：取一定量的生理盐水，加入1mol/L的HCl溶液调节pH值至2.5，三角瓶分装为90mL/瓶，121℃灭菌15min。冷却后每瓶中加入1g胃蛋白酶(模拟胃环境)。无菌环境下取10g样品，加入人工制备的酸液中，37℃恒温培养箱培养2h后，将pH回调至正常生理盐水pH，20℃200r/min振荡摇匀0.5h通过十倍梯度稀释法测定活菌数。
测定结果：经胃液环境处理2h后，样品中菌株存活率为98.15％。
(3)耐胆盐性
对照组：无菌称取10g样品，加入到含有90mL生理盐水的三角瓶中，37℃恒温培养箱培养2h后取出20℃200r/min振荡摇匀0.5h。十倍梯度稀释法测定活菌数。
试验组：取90mL生理盐水加入到三角瓶中，加入0.3g猪胆盐，摇匀，121℃灭菌15min，冷却，备用。无菌环境下取10g样品，加入至胆盐溶液中，振荡摇匀，37℃恒温培养箱培养2h后取出20℃200r/min振荡摇匀0.5h，十倍梯度稀释法测定活菌数。
测定结果：经0.3％胆盐环境处理2.5h后，样品中菌株存活率为97.55％。
本发明采用分段温度控制法，利用以麸皮为主的固态培养基发酵培养，发酵后无需烘干，直接收集粉碎过40目筛，即得枯草芽孢杆菌固体成品。本发明所得菌剂成品中有效枯草芽孢杆菌达到1.0×1010CFU/g以上，芽孢率在95％以上，具有极好的耐酸、耐胆盐及耐高温性能。作为饲料添加剂，本产品能够很大程度上避免饲料加工过程中所造成的不必要损失，同时有利于菌剂通过动物胃部苛刻的强酸环境，在肠道内部发挥有利作用。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种高芽孢率高抗逆性饲用枯草芽孢杆菌固态发酵方法，其特征在于，具体步骤是：
(1)菌株：选用枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CICC10453；
(2)种子培养：将步骤(1)所述菌株，在营养琼脂培养基上活化培养；之后在无菌条件下挑取单菌落接种至20mL营养肉汤培养基中振荡培养获得一级种子液；将所述一级种子液接种于营养肉汤培养基中扩大培养得到二级种子液；
(3)固态发酵培养：将所述二级种子液与营养盐溶液共同接种于固态培养基中，充分混合后将其平铺于浅盘中发酵，发酵完毕直接收集，粉碎过40目筛，即得枯草芽孢杆菌固态发酵成品。
2.根据权利要求1所述的高芽孢率高抗逆性饲用枯草芽孢杆菌固态发酵方法，其特征在于，所述步骤(2)中营养琼脂培养基，组成为牛肉膏0.3％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％，琼脂2.0％，蒸馏水配制，pH7.2～7.4；
所述步骤(2)中营养肉汤培养基，组成为牛肉膏0.3％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％，蒸馏水配制，pH7.2～7.4。
3.根据权利要求1所述的高芽孢率高抗逆性饲用枯草芽孢杆菌固态发酵方法，其特征在于，所述步骤(2)中营养琼脂培养基活化培养条件为37℃倒置培养16～24h；一级种子培养条件为37℃，160～180rpm振荡培养4～8h；二级种子培养条件为接种量1～5％，37℃，160～180rpm振荡培养3～6h。
4.根据权利要求1所述的高芽孢率高抗逆性饲用枯草芽孢杆菌固态发酵方法，其特征在于，所述步骤(2)中一级种子液的浓度为1×109CFU/mL；二级种子液的浓度为2×109CFU/mL。
5.根据权利要求1所述的高芽孢率高抗逆性饲用枯草芽孢杆菌固态发酵方法，其特征在于，所述步骤(3)中固态培养基制备方法：以质量计，70～90％麦麸，10～30％稻壳，121℃灭菌30min。
6.根据权利要求1所述的高芽孢率高抗逆性饲用枯草芽孢杆菌固态发酵方法，其特征在于，所述步骤(3)中营养盐溶液的配制：0.5～1.0％葡萄糖、0.5～1.0％蛋白胨、0.2～0.8％硫酸铵、0.5～1.5％磷酸二氢钾、0.01～0.04％硫酸锰，自来水配制，调节pH值至6～8，115℃灭菌20min。
7.根据权利要求1所述的高芽孢率高抗逆性饲用枯草芽孢杆菌固态发酵方法，其特征在于，所述步骤(3)中，二级种子液、营养盐与固态培养基的质量比为0.05～0.2∶0.4～0.7∶1。
8.根据权利要求1所述的高芽孢率高抗逆性饲用枯草芽孢杆菌固态发酵方法，其特征在于，所述步骤(3)中浅盘发酵高度为2cm～4cm。
9.根据权利要求1所述的高芽孢率高抗逆性饲用枯草芽孢杆菌固态发酵方法，其特征在于，所述步骤(3)中发酵分为两个阶段，菌体生长阶段与芽孢生成阶段；菌体生长阶段培养条件为：32～37℃发酵24～36h；芽孢生成阶段培养条件为：37～40℃发酵12～24h。
10.根据权利要求1～9任一所述的高芽孢率高抗逆性饲用枯草芽孢杆菌固态发酵方法，其特征在，步骤(3)中枯草芽孢杆菌固态发酵成品水分不高于14％。
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