CN110144310B - 一株具有缓解肠炎和促进肠道发育作用的枯草芽孢杆菌和应用 - Google Patents

一株具有缓解肠炎和促进肠道发育作用的枯草芽孢杆菌和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株具有缓解肠炎和促进肠道发育作用的枯草芽孢杆菌，名称为RZ001，分类名称为Bacillus subtilis.，保藏编号为：CGMCC NO：17116，保藏日期：2019年1月7日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本菌株具有修复和增强黏膜屏障功能、具有治疗炎症性肠炎的功能，还可以促进肠道发育，该菌株有望用于制备预防和治疗肠道炎症及促进发育的药品及发酵食品，具有非常广泛的应用前景。

Description

一株具有缓解肠炎和促进肠道发育作用的枯草芽孢杆菌和 应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其是一株具有缓解肠炎和促进肠道发育作用的枯草芽孢杆菌和应用。
背景技术
炎症性肠病(inflammatory bowel diseases，IBD)是一种原因不明的慢性非特异性肠道炎性疾病，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)、克罗恩病(Crohn′sdisease，CD)，其发病率逐年增长，但发病机制尚不明确，具有复发高的特点，严重影响患者的生活质量。肠道微生态紊乱导致免疫失衡可能为IBD发病的重要环节，易感人群肠道中的菌群突破肠上皮屏障，免疫系统被各种微生物抗原激活，炎症细胞因子活化从而导致结肠黏膜组织产生炎症反应。
肠道屏障是肠道能够抵御有害物质如致病微生物及毒素进入人体其它组织、器官和血液的重要屏障。正常肠道黏膜屏障由机械屏障、化学屏障、免疫屏障与生物屏障共同组成。其中机械屏障的主要构成包括肠黏膜上皮分泌的黏蛋白(mucin，MUC)，其在人结肠和直肠组织中存在的主要形式是分泌性黏蛋白，黏蛋白-2(mucin2，MUC2)在肠道表面形成一层黏液层，具有拮抗致病菌肠道黏附和侵袭的作用，对肠道微生态平衡具有重要作用。肠上皮细胞紧密连接(tightjunction，TJ)是肠机械屏障的另一个重要组成部分。一旦TJ受损，肠上皮细胞间的通透性增加，细菌内毒素和大分子物质就可通过紧密连接进入体循环，与多种疾病的发生发展有关。闭锁蛋白(occludin，OCLN)、封闭蛋白1(claudin-1，CLDN1)、闭锁小带蛋白1(zonula occluden-1，ZO-1)是三种重要的紧密连接蛋白，在TJ中发挥着重要作用。因此，MUC2和CLDN1、OCLN、ZO-1在肠道的表达对肠道屏障具有重要意义。
婴儿时期是肠道菌群建立的关键时期，如果此时肠道菌群构造合理、代谢平衡，那么今后机体免疫系统及肠道发育将更加完善。2009年，Sato等人描述了小肠隐窝上皮细胞和干细胞的三维培养成肠上皮类器官，称为“enteroid”。在该模型中，肠道隐窝经过肠道隐窝出芽，形成无间充质来源的连接隐窝的绒毛状上皮结构域。类器官可以不断产生肠上皮的所有细胞谱系，可以作为一种研究肠道发育分化的体外模型。
UC的治疗主要以氨基水杨酸类制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂为主，虽然治疗效果确切，但副作用不容忽视，益生菌作为对机体有益的微生物，在预防和治疗多种肠道疾病方面广泛应用，包括腹泻、肠易激综合征、新生儿坏死性小肠结肠炎、麸质不耐症、胃肠炎和复发的慢性肠炎等。婴幼儿时期是机体各项功能形成和完善的时期，也是肠道微生态形成的重要阶段。来自无菌动物的研究表明，体内定植的微生物对动物早期肠道形态发育，肠上皮细胞增殖、免疫系统分化等肠道发育过程有重要影响，通过微生物干预，尤其是益生菌干预，有效地增强肠道的消化吸收能力，促进肠道黏膜屏障、免疫快速成熟，进而提高机体防疫能力，对于婴幼儿的健康发育具有重要意义。因此，开发筛选一种能够缓解结肠炎症、促进机体肠道发育的益生菌具有重要意义。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一株具有缓解肠炎和促进肠道发育作用的枯草芽孢杆菌和应用，该菌株具有修复和增强黏膜屏障功能、具有治疗炎症性肠炎的功能，还可以促进肠道发育，该菌株有望用于制备预防和治疗肠道炎症及促进发育的药品，具有非常广泛的应用前景。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一株具有缓解肠炎和促进肠道发育作用的枯草芽孢杆菌，名称为RZ001，分类名称为Bacillus subtilis.，保藏编号为：CGMCC NO：17116，保藏日期：2019年1月7日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
而且，所述枯草芽孢杆菌是从健康新生儿粪便中分离获得的；
或者，所述枯草芽孢杆菌的基因序列为SEQ ID No.1。
而且，所述枯草芽孢杆菌具有修复和增强黏膜屏障功能；
或者，所述枯草芽孢杆菌能够提高人结肠细胞中黏液层重要黏蛋白2mucin2(MUC2)和紧密连接蛋白中闭锁蛋白occludin(OCLN)、封闭蛋白1claudin-1(CLDN1)、闭锁小带蛋白1zonula occluden-1(ZO-1)的表达，改善结肠炎小鼠的症状，抑制炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β的释放，改善小鼠结肠长度的变化；
所述枯草芽孢杆菌RZ001能够促进小鼠肠道类器官的生长，促进小鼠肠道的发育进而促进肠道功能的完善。
如上所述的具有缓解肠炎和促进肠道发育作用的枯草芽孢杆菌在制备预防和/或治疗结肠炎的药物中的应用。
而且，所述药物为益生菌制剂。
如上所述的具有缓解肠炎和促进肠道发育作用的枯草芽孢杆菌在制备促进肠道发育的药物中的应用。
而且，所述药物为微生态制剂。
而且，所述药物为包含枯草芽孢杆菌及药学上通常使用的矫味剂、润滑剂、填充剂、崩解剂的载体组成的复合物。
本发明取得的优点和积极效果是：
1、本发明枯草芽孢杆菌RZ001具有修复和增强黏膜屏障功能。
2、本发明枯草芽孢杆菌RZ001具有治疗炎症性肠炎的功能，其治疗炎症性肠炎效果显著。
3、本发明枯草芽孢杆菌RZ001可以促进肠道发育。
4、本发明的枯草芽孢杆菌RZ001能够显著上调人结肠细胞中黏液层重要黏蛋白2(mucin2，MUC2)和紧密连接蛋白中闭锁蛋白(occludin，OCLN)、封闭蛋白1(claudin-1，CLDN1)、闭锁小带蛋白1(zonula occluden-1，ZO-1)的表达，改善小鼠腹泻、便血、体重减轻等结肠炎症状，改善小鼠结肠长度的变化，抑制炎症因子(IL-6，TNF-α，IL-1β)的过度表达。此外，枯草芽孢杆菌RZ001可以促进小鼠肠道类器官的生长，促进小鼠肠道的发育进而促进肠道功能的完善。本发明枯草芽孢杆菌RZ001有望用于制备预防和治疗肠道炎症及促进发育的药品，具有非常广泛的应用前景。
5、本发明枯草芽孢杆菌RZ001能够应用在预防与治疗炎症性肠炎、促进动物肠道发育相关的微生态制剂中，为研发预防和治疗结肠炎的益生菌制剂提供理论支持，为研发促进肠道发育的微生态制剂提供理论支持。
附图说明
图1为本发明中菌株RZ001发酵液上清对CLDN1、OCLN、ZO-1mRNA水平的影响图；
图2为本发明中菌株RZ001的灌胃影响图；其中，图2A为灌胃RZ001对小鼠体重的影响图；图2B为灌胃RZ001对小鼠结肠长度的影响图；图2C为灌胃RZ001对小鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α细胞因子的影响图；
图3为本发明中菌株RZ001的促进肠道发育的作用研究结果图；其中，图3A为RZ001发酵液上清对HT-29细胞中MUC2 mRNA的影响图；图3B为RZ001发酵液上清对MUC2蛋白水平的影响图；图3C为HK-RZ001对肠类器官中MUC2 mRNA的影响图；图3D为HK-RZ001对MUC2蛋白水平的影响图；图3E为类器官的EDU染色图；图3F为小鼠小肠组织进行H&E染色图。
具体实施方式
下面结合通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一株具有缓解肠炎和促进肠道发育作用的枯草芽孢杆菌，名称为RZ001，分类名称为Bacillus subtilis.，保藏编号为：CGMCC NO：17116，保藏日期：2019年1月7日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
较优地，所述枯草芽孢杆菌是从健康新生儿粪便中分离获得的；
或者，所述枯草芽孢杆菌的基因序列为SEQ ID No.1。
较优地，所述枯草芽孢杆菌具有修复和增强黏膜屏障功能；
或者，所述枯草芽孢杆菌能够提高人结肠细胞中黏液层重要黏蛋白2mucin2(MUC2)和紧密连接蛋白中闭锁蛋白occludin(OCLN)、封闭蛋白1claudin-1(CLDN1)、闭锁小带蛋白1zonula occluden-1(ZO-1)的表达，改善结肠炎小鼠的症状，抑制炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β的释放，改善小鼠结肠长度的变化；
所述枯草芽孢杆菌RZ001能够促进小鼠肠道类器官的生长，促进小鼠肠道的发育进而促进肠道功能的完善。
如上所述的具有缓解肠炎和促进肠道发育作用的枯草芽孢杆菌在制备预防和/或治疗结肠炎的药物中的应用。
较优地，所述药物为益生菌制剂。
如上所述的具有缓解肠炎和促进肠道发育作用的枯草芽孢杆菌在制备促进肠道发育的药物中的应用。
较优地，所述药物为微生态制剂。
较优地，所述药物为包含枯草芽孢杆菌及药学上通常使用的矫味剂、润滑剂、填充剂、崩解剂的载体组成的复合物。
具体地，相关制备及检测步骤如下：
一、菌株的筛选与鉴定
(1)菌株的分离与纯化
首先将新生儿粪便样本梯度稀释，将10-5、10-6混悬液分别涂布于MRS固体(48gMRS肉汤溶于1L蒸馏水中、1.5％琼脂粉)培养基中，37℃条件下普通培养箱培养48h，待菌落长出后，挑选出单个菌落于MRS固体培养基上进行3次划线纯化，把较大的单菌落挑选出来并保存其菌种。
(2)菌株的鉴定
通过形态、生理生化和分子鉴定相结合的方法对上述保存菌种的形态特征、生理生化特征以及16S r RNA基因序列的进行鉴定。
相关结果：
菌株的形态特征：
菌株菌体呈球状；革兰氏染色呈阳性，有芽孢。MRS平板培养基上菌落粗糙，呈圆形或近圆形，凸起，平铺，呈白色，不透明。
菌株的生理生化特征：
能产生蛋白酶、纤维素酶，能使淀粉水解，能够利用葡萄糖、甘露醇、木糖、蔗糖、L-阿拉伯糖，但不能利用肌醇、乳糖；V-P实验、明胶液化实验和氧化酶实验均呈阳性。
菌株的16S r RNA基因序列如序列表中序列1所示。
该菌株与NCBI中GenBank的Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168的同源性达99％。
结果显示该菌种为枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌RZ001。
二、枯草芽孢杆菌RZ001修复和增强黏膜屏障能力分析
(1)枯草芽孢杆菌RZ001样品的制备
将保存在-80℃枯草芽孢杆菌RZ001菌种常温下解冻，按2％接种于LB液体培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl)中，经过二次活化，每次培养12h，最终接菌于100mL培养基中，同时将100mL空白培养基做为对照组，12h后离心，取上清，50℃旋蒸1.5h左右，倒入玻璃培养皿中，放入-80℃冰箱24h，于冻干机中冻干处理。冻干样品重悬于细胞培养基中。用于细胞实验。
(2)细胞培养
HT-29细胞用含10％FCS的F12培养基(含1×105U/L青霉素和100mg/L链霉素)，在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养。24h换液，以后每2、3天更换一次培养液。细胞长满后，用2.5g/L胰酶消化后传代。
(3)实验设计
通过real-time RCR检测枯草芽孢杆菌RZ001发酵上清对肠道黏膜屏障中OCLN、CLDN1、ZO-1mRNA水平的影响。
实时荧光定量RCR(real-time RCR)：
HT-29细胞以104/mL的密度均匀铺种在六孔板中培养两天，经加入5mg/mL样品处理24h后，Trizol法提取HT-29细胞中RNA，用M-MLV逆转录酶逆转录2μg样品。real-time RCR半定量法检测OCLN，CLDN1，ZO-1基因的表达。PCR体系：7.6μL DDW，10μL Mix(2×SYBRGreen qPCR Mix)，0.4μL ROX(50×ROX Reference Dye)，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，1μL cDNA模板。PCR反应条件：95℃预变性2min，95℃变性10s，60℃退火30s，95℃延伸1min，共40个循环，95℃终止反应15s。引物序列如表1。
表1 real-time RCR引物
Figure GDA0003754934720000061
利用RZ001菌株发酵液上清处理HT-29细胞24h后，利用real-time RCR方法检测mRNA水平，结果发现RZ001发酵液上清能上调CLDN1、OCLN、ZO-1的mRNA表达水平(结果如图1所示，*P<0.05)
结果显示，本发明提供的枯草芽孢杆菌RZ001具有修复和增强黏膜屏障功能。
三、枯草芽孢杆菌RZ001对炎症性肠炎的缓解作用
(1)动物和饲养
将购自中国食品药品监督管理实验动物资源研究所的24只雄性C57BL/6小鼠，置于25℃、55％湿度、12h光照/黑暗周期的对照条件下，饲喂标准实验室食品。
(2)实验流程
一周适应期，给与无限制食物和饮用水。适应期后，对实验组先灌胃枯草芽孢杆菌RZ001(109CFU/mL)保护一周，100μL/鼠/天；空白组和模型组灌胃同等体积PBS。在此一周内所有小鼠饮用纯净水。第8天开始，空白组饮用纯净水，其他小鼠自饮2.5％(w/v)右旋糖酐硫酸钠盐(DSS)(分子量36000-50000；MP Biomedicals)一周诱导UC模型，建模一周内灌胃不间断，一边建模一边治疗。实验过程中每两天记录体重。实验结束，眼球法取血后将其脱臼处死，取结肠。
(3)体重记录
为了评价枯草芽孢杆菌RZ001对结肠炎的影响，小鼠每天口服1×108CFU RZ001，然后连续7天自由饮用含2.5％DSS的饮用水。与DSS组相比，RZ001组明显缓解了小鼠体重的减轻(*p<0.05)(结果如图2A所示)。
(4)比较结肠长度
结肠变短是实验性结肠炎的一个特征。如图2B所示，口服枯草芽孢杆菌RZ001可显著增加实验性结肠炎小鼠的结肠长度。
(5)炎症因子检测
应用ELISA检测了枯草芽孢杆菌RZ001对UC小鼠血清中结肠炎相关炎症因子的调节作用。具体是在最后一天小鼠被处死前，眼球法取血，分离出血清，并使用ELISA检测各组小鼠血清中炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α的水平。如图2C所示，灌胃RZ001组血清中IL-6、IL-1β和TNF-α明显低于DSS组。
综上，结果显示，本发明提供的枯草芽孢杆菌RZ001具有治疗炎症性肠炎的功能，其治疗炎症性肠炎效果显著。
四、枯草芽孢杆菌RZ001促进肠道发育的作用研究
(1)类器官的培养
从4周龄的小鼠体内分离小肠隐窝，在特定的培养基中进行培养。简而言之，在小鼠胃附近取约20cm的肠段，用预冷的D-PBS反复冲洗肠道内容物并除去小肠上的脂肪。然后将小肠剪成2mm长的片段，置于含有15mLD-PBS的离心管中，反复吹打肠道碎片3次，然后使其重力沉降并弃去上清。如此重复15～20次，直至上清液澄清。重悬组织碎片于25mL的细胞解离试剂中，室温缓慢摇晃15min，然后重力沉降并弃去上清液。加入10mL 0.1％BSA-PBS，上下吹打3次，然后重力沉降。轻轻吸取上清于70μm的细胞筛中进行过滤。4℃，290r/min离心5min，弃去上清。沉淀加入10mL预冷DMEM/F12培养基进行垂悬。显微镜下进行计数，取所需体积离心后，用完全培养基进行垂悬。取预热的48孔细胞培养板，每孔加入50μL垂悬液和基质胶的混合液，于37℃孵育10min。然后沿孔壁加入200μL的完全培养基，置于37℃培养箱中培养，每3天换1次培养基。
(2)细胞培养
培养方法同步骤二中的(2)中的方法。
(3)动物和饲养
刚出生C57BL/6乳鼠，由母鼠自由喂养，母鼠置于25℃、55％湿度、12h光照/暗周期的对照条件下，饲喂标准实验室食品(即由购买小鼠的研究所即中国食品药品监督管理实验动物资源研究所提供的普通小鼠食料)。
(4)实验设计
real-time RCR、酶联免疫吸附法检测RZ001发酵液上清对HT-29细胞中杯状细胞标志分泌物MUC2表达的影响，从体外细胞实验检测RZ001发酵液上清对MUC2表达的影响。然后，从4周龄小鼠小肠中分离肠隐窝，在基质胶(Matrigel)(Biocoat，356231)中培养，大概一天后类器官形成球形时，加入热灭活HK-RZ001(1×104CFU/well)，观察其生长状态，3天后进行EDU、real-time RCR、ELISA实验，检测HK-RZ001对肠细胞增殖和肠杯状细胞分化的影响。最后通过体内(乳鼠)实验检测RZ001对肠道发育的影响。具体是从出生第二天到第15天，对乳鼠灌胃RZ001(1×108CFU/d)，然后处死小鼠，取小肠组织做H&E染色检测，观察绒毛长度及密度。
(a)real-time RCR
如步骤二中的(3)中的实时荧光定量RCR的方法测HT-29细胞中MUC2 mRNA(结果如图3A所示)、类器官中MUC2 mRNA(结果如图3C所示)水平的影响。
利用RZ001菌株发酵液上清处理HT-29细胞24h后，利用real-time RCR方法检测mRNA水平，结果发现RZ001发酵液上清能上调HT-29细胞中的MUC2 mRNA水平的表达(如图3A，*P<0.05)。
热灭活HK-RZ001(1×104CFU/well)加入肠类器官72h后，利用real-time RCR方法检测mRNA水平，结果发现HK-RZ001能上调类器官中的MUC2 mRNA水平(如图3C，*P<0.05)。
(b)酶联免疫吸附(ELISA)实验
HT-29细胞以104/mL的密度均匀铺种在六孔板中培养两天，经加入5mg/mL冻干的发酵液上清处理24h后，收集细胞培养基上清，采用酶联免疫吸附法检测细胞培养基上清中MUC2水平，试剂盒采用人MUC2 ELISA检测试剂盒(ImmunoWay，KE1700)。检测方法按说明书进行。
从小肠中分离肠隐窝，在基质胶中培养，大概一天后类器官形成球形时，加入热灭活HK-RZ001(1×104CFU/well)，观察其生长状态，3天后取培养基上清进行ELISA实验。试剂盒采用鼠MUC2 ELISA检测试剂盒(科赛博，CSB-E15065m)。检测方法按说明书进行。
5mg/mL发酵液上清处理HT-29细胞24h后，利用ELISA方法检测细胞培养基中MUC2的含量，结果如图3B所示，枯草芽孢杆菌RZ001发酵液上清可使MUC2蛋白的表达量上调，与对照组(CON)相比，具有统计学意义(*P<0.05)。
HK-RZ001(1×104CFU/well)加入肠类器官72h后，利用ELISA方法检测细胞培养基中MUC2的含量，结果如图3D所示，HK-RZ001可使类器官MUC2蛋白的表达量上调，与对照组(CON)相比，具有统计学意义(*P<0.05)。
(c)EDU细胞增殖实验
从小肠中分离肠隐窝，在基质胶中培养，大概一天后类器官形成球形时，加入热灭活HK-RZ001(1×104CFU/well)，观察其生长状态，3天后用细胞增殖试剂盒(RiboBio，C10310-3)做EDU细胞增殖实验。检测方法按说明书进行。在Zeiss 710激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞DNA含量。应用image J软件对各类型器官中EdU+细胞的数量进行分析。
HK-RZ001(1×104CFU/well)加入肠类器官72h后，用EDU细胞增殖实验检验HK-RZ001对肠细胞增殖的影响。如图3E所示，EdU阳性细胞数量显著增加。
(d)绒毛长度评价
为了进一步评价RZ001对肠道发育的影响，进行乳鼠实验并进行了H&E染色。与对照组(PBS组)对比，实验组(RZ001组)小肠组织学分析显示绒毛更长，密度更大(结果如图3F所示)。
结果显示，本发明提供的枯草芽孢杆菌RZ001具有促进肠道发育的功能且效果显著。
五、统计分析
实验数据结果以“平均值±标准差”表示，数据由Graphpad Prism 5.0进行统计分析，*、**分别表示有统计学差异P<0.05、P<0.01。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
<110>天津科技大学
<120>一株具有缓解肠炎和促进肠道发育作用的枯草芽孢杆菌
<160>1
<210>1
<211>1412
<212>DNA
<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RZ001
<400>1
CTCATAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGGAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCAAACAAGCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTTGCATGT。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一株具有缓解肠炎和促进肠道发育作用的枯草芽孢杆菌和应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1412
<212> DNA/RNA
<213> 枯草芽孢杆菌的基因序列(Unknown)
<400> 1
ctcataaggt tacctcaccg acttcgggtg ttacaaactc tcgtggtgtg acgggcggtg 60
tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg gcatgctgat ccgcgattac tagcgattcc 120
agcttcacgc agtcgagttg cagactgcga tccgaactga gaacagattt gtgggattgg 180
cttaacctcg cggtttcgct gccctttgtt ctgtccattg tagcacgtgt gtagcccagg 240
tcataagggg catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttgt caccggcagt 300
caccttagag tgcccaactg aatgctggca actaagatca agggttgcgc tcgttgcggg 360
acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccacct gtcactctgc 420
ccccgaaggg gacgtcctat ctctaggatt gtcagaggat gtcaagacct ggtaaggttc 480
ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc cgtcaattcc 540
tttgagtttc agtcttgcga ccgtactccc caggcggagt gcttaatgcg ttagctgcag 600
cactaagggg cggaaacccc ctaacactta gcactcatcg tttacggcgt ggactaccag 660
ggtatctaat cctgttcgct ccccacgctt tcgctcctca gcgtcagtta cagaccagag 720
agtcgccttc gccactggtg ttcctccaca tctctacgca tttcaccgct acacgtggaa 780
ttccactctc ctcttctgca ctcaagttcc ccagtttcca atgaccctcc ccggttgagc 840
cgggggcttt cacatcagac ttaaggaacc gcctgcgagc cctttacgcc caataattcc 900
ggacaacgct tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag ccgtggcttt 960
ctggttaggt accgtcaagg taccgcccta ttcgaacggt acttgttctt ccctaacaac 1020
agagctttac gatccgaaaa ccttcatcac tcacgcggcg ttgctccgtc agactttcgt 1080
ccattgcgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg tctcagtccc 1140
agtgtggccg atcaccctct caggtcggct acgcatcgtt gccttggtga gccattacct 1200
caccaactag ctaatgcgcc gcgggtccat ctgtaagtgg tagccgaagc caccttttat 1260
gtttgaacca tgcggttcaa acaagcatcc ggtattagcc ccggtttccc ggagttatcc 1320
cagtcttaca ggcaggttac ccacgtgtta ctcacccgtc cgccgctaac atcagggaag 1380
caagctccca tctgtccgct cgacttgcat gt 1412
<210> 2
<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 引物hMuc2-f(Unknown)
<400> 2
tgcccttgcg tccataac 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 引物hMuc2-r(Unknown)
<400> 3
cagtgtccgt caaagtcgta g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 引物hOCLN-f(Unknown)
<400> 4
cctataaatc cacgccggtt c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 引物hOCLN-r(Unknown)
<400> 5
tcaaagttac caccgctgct g 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 引物hZO-1-f(Unknown)
<400> 6
aacagcccta cccatctcg 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 引物hZO-1-r(Unknown)
<400> 7
cgtggaaagt accctcgtt 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 引物hCLDN1-f(Unknown)
<400> 8
cgatgctttc tgtggctaa 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 引物hCLDN1-r(Unknown)
<400> 9
agtggctgac tttccttgt 19
<210> 10
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 引物hGAPDH-f(Unknown)
<400> 10
acccactcct ccacctttga c 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 引物hGAPDH-r(Unknown)
<400> 11
tccaccaccc tgttgctgta g 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 引物mMUC2-f(Unknown)
<400> 12
gctgacgagt ggttggtgaa tg 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 引物mMUC2-r(Unknown)
<400> 13
gatgaggtgg cagacaggag ac 22
<210> 14
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 引物mGAPDH-f(Unknown)
<400> 14
atggtgaagg tcggtgtgaa 20
<210> 15
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 引物mGAPDH-r(Unknown)
<400> 15
rtggaagatg gtgatgggct t 21

Claims (6)

1.一株具有缓解肠炎和促进肠道发育作用的枯草芽孢杆菌，其特征在于：名称为RZ001，分类名称为Bacillus subtilis.，保藏编号为：CGMCC NO：17116，保藏日期：2019年1月7日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.如权利要求1所述的具有缓解肠炎和促进肠道发育作用的枯草芽孢杆菌在制备预防和/或治疗结肠炎的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的具有缓解肠炎和促进肠道发育作用的枯草芽孢杆菌在制备预防和/或治疗结肠炎的药物中的应用，其特征在于：所述药物为益生菌制剂。
4.如权利要求1所述的具有缓解肠炎和促进肠道发育作用的枯草芽孢杆菌在制备促进肠道发育的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的具有缓解肠炎和促进肠道发育作用的枯草芽孢杆菌在制备促进肠道发育的药物中的应用，其特征在于：所述药物为微生态制剂。
6.根据权利要求4或5所述的具有缓解肠炎和促进肠道发育作用的枯草芽孢杆菌在制备促进肠道发育的药物中的应用，其特征在于：所述药物为包含枯草芽孢杆菌及药学上通常使用的矫味剂、润滑剂、填充剂、崩解剂的载体组成的复合物。
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