CN113773997A - 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis S-2及合生制剂的配伍方法及应用 - Google Patents

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis S-2及合生制剂的配伍方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物工程技术领域，特别涉及一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis S‑2及其合生制剂的配伍方法及应用，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2021年9月3日，保藏编号为：CCTCC NO：M20211135，分类学命名Bacillus subtilis。该枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis S‑2及其对应的L‑Ala营养性萌发剂配伍后，能够显著促进了该菌的生长，促进其在细胞水平的抗炎以及屏障功能，抵抗肠毒性大肠杆菌攻毒对动物肠道的损伤，因此能应用到抗炎、屏障功能及抵抗肠毒性大肠杆菌对肠道损伤中。

Description

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis S-2及合生制剂的配伍方 法及应用
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，特别涉及一种枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis S-2及其合生制剂的配伍方法及应用。
背景技术
芽孢杆菌是一类好氧或兼性厌氧能够产生具有抗逆性内生孢子的革兰氏阳性杆状菌。芽孢杆菌响应于营养缺乏、代谢产物积累或温度变化等不良环境因子，形成的一种休眠体内生孢子——芽孢。芽孢的一般结构包括芽孢外壁、芽孢衣、芽孢外膜、皮层、芽孢壁、芽孢内膜和芽孢核。相比于营养细胞，芽孢对外界不利环境如高温、干燥、极端pH值、辐射和一些有毒化学物品等有极强的耐受能力。在一定条件下，芽孢在休眠状态下可以保持活力数年至数十年之久。尽管芽孢长期保持休眠，但芽孢对外界环境依然敏感，一旦其探测到外部存在可诱导萌发的条件，芽孢就开始萌发，逐渐恢复到营养细胞状态。
芽孢在通过萌发剂处理可以促进其芽孢萌发，可诱导芽孢萌发的萌发剂主要分为两类：营养型萌发剂和非营养型萌发剂。其中营养型萌发剂主要包括单氨基酸、糖类和嘌呤核苷酸类等；非营养型萌发剂主要包括溶菌酶、盐、高压、2,6吡啶二羧酸钙以及阳离子表面活性剂如十二烷胺等。一些化学混合物也可以触发芽孢的萌发，如用天门冬氨酸、葡萄糖、果糖和氯化钾配成的混合剂(AGFK)可以用来作为枯草杆菌芽孢萌发的萌发剂。芽孢和促进萌发的萌发剂混合后数秒钟之内，萌发剂快速跨过芽孢衣和皮层到达芽孢内膜的表面，与位于芽孢内膜上的受体蛋白(如GerA、GerB、Ger等)相互作用，进一步传导萌发信号，激发芽孢进入萌发状态。萌发后的芽孢通透性増加，芽孢核内各种阳离子释放并且水分子进入芽孢核替换原有的吡啶二羧酸钙，存在于芽孢皮层的肽聚糖被酶水解，随后芽孢核逐渐完全水合化，开始进行新陈代谢及大分子合成活动，芽孢萌发成为一个新的营养细胞并开始其生长阶段。芽孢萌发后对外界环境的抵抗能力消失，代谢活性也被激活。
芽孢杆菌作为益生菌广发应用于食品、药物以及饲料添加剂中，芽孢杆菌具有多种益生活性。在实际应用中，基于芽孢的稳定性，芽孢杆菌作为益生菌是以芽孢形式来使用。芽孢经摄入后在体内萌发生长代谢，以芽孢体、营养体或者营养体和芽孢体共存等形式存在而发挥相应的作用。合生制剂是指由活的微生物和能被宿主微生物(包括宿主原有的和补充的)选择性利用的底物组成的混合物，可为宿主带来健康益处。因此，如果基于芽孢杆菌菌株自身的萌发特性，通过添加其特异性的营养萌发剂作为合生制剂与其配伍，进而来促进芽孢在体内的萌发和代谢活性，就能有效的提高芽孢杆菌作为益生菌对肠道屏障的保护效果，对芽孢类的生物制剂生产具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种益生芽孢杆菌的选择方法及与其对应的营养型萌发剂作为合生制剂的应用，合生制剂通过芽孢杆菌与特异性的萌发剂的协同作用，能够有效促进芽孢在动物体内的萌发，增强芽孢杆菌的益生特性，促进动物的新陈代谢，增强动物生长性能，抑制肠道病原微生物的定植，同时本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis S-2及其合生制剂，显著促进了枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis S-2的生长，能应用于促进其在细胞水平的抗炎以及屏障功能，抵抗肠毒性大肠杆菌攻毒对动物肠道的损伤。
一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis S-2，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2021年9月3日，保藏编号为：CCTCC NO：M20211135，分类学命名Bacillus subtilis。
一种益生芽孢杆菌与其合生制剂的制备方法，具体步骤为：
步骤1.益生芽孢杆菌的芽孢的制备：菌株采用产孢培养基进行扩大培养，取单菌落接种于斜面进行培养，用无菌水洗涤斜面菌体并制得芽孢悬液，离心收集芽孢菌体，将菌体重悬在缓冲液中并用分光光度计调初始OD600 nm值至1.0；
步骤2.益生芽孢杆菌与营养性萌发剂的孵育：使用在肠道内潜在的若干种营养介质作为营养性萌发剂，各个萌发剂均用缓冲液溶解；将步骤1中OD600 nm值至1.0的芽孢悬液分成两份，一份置于密封试管中，加热处理使芽孢中的DPA全部释放，冷却后离心处理得到上清液备用；另一份芽孢悬液离心处理，去上清液后加入等量的含有营养性萌发剂的缓冲液孵育，然后取样并离心处理得到上清液，分别检测不同处理条件下的两份上清液的DPA荧光强度；
步骤3.益生芽孢杆菌萌发潜力的评估：步骤2中DPA荧光强度的检测结果用相对荧光强度来表示，所述相对荧光强度是指用使用含有营养性萌发剂的缓冲液孵育处理的荧光强度与未使用含有营养性萌发剂的缓冲液孵育处理的荧光强度的比值，相对荧光强度数值超过50％即认为该菌株在对应的营养性萌发剂条件下具有萌发响应的能力；
步骤4.益生芽孢杆菌与对应的营养性萌发剂的配伍：将芽孢杆菌菌粉与该菌种对应的营养性萌发剂相混合，每1亿个芽孢中添加营养性萌发剂的浓度不低于0.1mmol，所述与该菌种对应的营养性萌发剂是指该菌种在对应的营养性萌发剂条件下具有萌发响应的能力，与该菌种对应的营养性萌发剂即为该菌株的合生制剂。
而且，益生芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis S-2时，与该菌种对应的营养性萌发剂为L-Ala。
而且，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis S-2与其对应的营养性萌发剂混合后在抗炎、屏障功能及抵抗肠毒性大肠杆菌对肠道损伤中的应用。
而且，步骤2中的若干种营养介质包括糖类、氨基酸类、盐离子和复合型萌发剂，其中糖类至少包括D-葡萄糖，D-果糖，蔗糖；氨基酸类至少包括L-Val，L-Gln，L-Arg，L-Pro，L-Lys，L-Gly，L-Glu，L-His，L-Asp，L-Try，L-Ala；复合型萌发剂至少包括AGFK，即100mM L-Asp+10mM D-葡萄糖+10mM D-果糖+10mM KCl。
而且，步骤1和步骤2中的缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
本发明的有益效果在于：
提供的含有芽孢杆菌的微生物合生制剂通过芽孢杆菌与特异性的萌发剂的协同作用，能够有效促进芽孢在动物体内的萌发，增强芽孢杆菌的益生特性，促进动物的新陈代谢，增强动物生长性能，抑制肠道病原微生物的定植。筛选出的枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis S-2及其对应的L-Ala营养性萌发剂配伍后，能够显著促进了该菌的生长，促进其在细胞水平的抗炎以及屏障功能，抵抗肠毒性大肠杆菌攻毒对动物肠道的损伤，因此能应用到抗炎、屏障功能及抵抗肠毒性大肠杆菌对肠道损伤中。
附图说明
图1为本发明实施例不同萌发剂诱导Bacillus subtilis S-2芽孢萌发响应情况；
图2为本发明实施例Bacillus subtilis S-2芽孢在L-Ala预处理后对生长促进的生长曲线；
图3为本发明实施例L-Ala处理增强了Bacillus subtilis S-2芽孢在IPEC-J2细胞水平上炎性因子的转录因子表达水平；
图4为本发明实施例L-Ala处理增强了Bacillus subtilis S-2芽孢在IPEC-J2细胞水平上的屏障保护作用；
图5为本发明实施例L-Ala处理增强了Bacillus subtilis S-2芽孢促进肠毒性大肠杆菌攻毒的SD大鼠生长性能。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行详细具体说明，本发明的内容不局限于以下实施例。
一种益生芽孢杆菌与其合生制剂的配伍方法及应用，包括以下步骤：
(1)益生芽孢杆菌的芽孢的制备：芽孢杆菌菌株采用产孢培养基(含0.05mMMnCl2，0.7mM CaCl2，1.0mM MgCl2的80％肉膏培养基)进行扩大培养。取单菌落接种于斜面，37℃培养48-60h，镜检观察90％以上均为芽孢体，用无菌水洗涤斜面菌体，80℃水浴加热15min。将制备的芽孢悬液6000rpm离心10min收集芽孢菌体，用无菌水洗涤两次后，将菌体重悬在Tris-HCl缓冲液中并用分光光度计调初始OD600 nm值至1.0左右。
(2)益生芽孢杆菌与营养性萌发剂的孵育：使用糖类、氨基酸类、盐离子等可能在肠道内存在的营养介质作为萌发剂。糖类包括D-葡萄糖，D-果糖，蔗糖；氨基酸类：L-Val，L-Gln，L-Arg，L-Pro，L-Lys，L-Gly，L-Glu，L-His，L-Asp，L-Try，L-Ala；以及复合型萌发剂：AGFK(100mM L-Asp+10mM D-葡萄糖+10mM D-果糖+10mM KCl)；各萌发剂均用Tris-HCl缓冲液溶解并配制其浓度为100mM。将OD600 nm值至1.0左右的芽孢悬液分成两份，一份用来置于具塞密封试管中(防止液体溢出或蒸发引起体积变化，干扰结果测定)，121℃处理20分钟以便芽孢中的DPA全部得到释放，冷却后6000rpm离心处理5分钟得到上清液备用，另一份在取一定量的芽孢悬液6000rpm离心处理5分钟，去上清，然后加入等量的含有营养性萌发剂的Tris-HCl缓冲液孵育30分钟，然后取样6000rpm离心处理5分钟得到上清液。分别测定两种处理条件下的DPA荧光强度。
(3)上清液中释放的DPA的荧光检测：将上清液稀释后与EuCl3和环己二胺四乙酸充分混合均匀，采用荧光分光光度计测定上述混合溶液的荧光强度，测定过程中激发波长范围260～280nm，发射波长范围610～630nm；
(4)益生芽孢杆菌萌发潜力的评估：实验结果用各菌株萌发后荧光强度与高温高压处理下荧光强度的比值来表示，即相对荧光强度，相对荧光强度值超过50％被认为菌株具有一定的萌发响应的能力。相对值越高，菌株的萌发潜力越大。
(5)益生芽孢杆菌与对应的营养性萌发剂的配伍：将制备得到的芽孢杆菌菌粉与其对应的营养性萌发剂相混合，每1亿个芽孢中添加营养性萌发剂的浓度不低于0.1mmol。
一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis S-2，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2021年9月3日，保藏编号为：CCTCC NO：M20211135，分类学命名Bacillus subtilis。其16SrDNA序列为SEQ ID NO:1所示。
实施例1
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis S-2对不同营养性萌发剂的响应
实验室保存菌株Bacillus subtilis S-2用LB活化。挑取单菌落接种于斜面培养基，37℃恒温培养48-60h，镜检后90％以上为芽孢体，用无菌水洗涤斜面菌体，80℃水浴加热15min。将制备的芽孢悬液6000rpm离心10min收集芽孢体，用无菌水洗涤两次后，将菌体重悬在50mM pH＝8的Tris-HCl缓冲液中并用分光光度计调节初始OD600 nm值为1.0。用50mMpH＝8的Tris-HCl溶液配置浓度为100mM不同萌发剂Glucose、L-Ala、L-Gln、L-Asp、L-Val、L-Lys、L-Glu、AGFK、KBr。取一定体积的Bacillus subtilis S-2的芽孢悬液6000rpm离心10min，弃去上清，加入等体积的各萌发剂，37℃条件下振荡2h以保证芽孢悬液与萌发剂充分混合均匀。每个实验处理三个平行。萌发诱导后，将菌液12000rpm离心3min收集上清液进行荧光检测。以相对荧光强度反应其萌发率，相对荧光强度越大，萌发率越高。图1为不同萌发剂萌发诱导Bacillus subtilis S-2的萌发率，Bacillus subtilis S-2对L-Ala、L-Gln、L-Vla均有萌发响应，对其余萌发剂均无萌发响应，其中对L-Ala具有显著响应。
实施例2
L-Ala对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis S-2生长的影响
Bacillus subtilis S-2芽孢悬液经100mM L-Ala处理萌发后，12000rpm离心3min，去上清，用无菌水洗涤两次，取萌发后的菌体接种于合成培养基，将不同处理的枯草芽孢杆菌接种于含合成培养基(10g/L葡萄糖，10g/L尿素，5g/L柠檬酸二胺，1.5g/LKHPO4，1.5g/LNaNO3；pH 7.0)的锥形瓶中，37℃振荡培养24h，每隔3h取样测OD600nm值，绘制生长曲线。实验共设置两组，(1)对照组：芽孢悬液12000rpm离心3min，去上清，取菌体接种于合成培养基；(2)L-Ala萌发组：每个实验处理三个平行。图2反映了L-Ala萌发处理对Bacillussubtilis S-2的生长曲线的影响，Bacillus subtilis S-2芽孢经L-Ala诱导萌发后生长显著加快。
实施例3
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis S-2对E.coli K99动物细胞炎症的缓解作用
(1)IPEC-J2细胞培养及处理：将IPEC-J2细胞以1×106个/mL的密度接种于微孔板上，37℃、5％CO2培养箱中培养，直至细胞长满。孔板长满细胞后，弃去旧培养基，用PBS清洗细胞3次，之后加入用培养基配制的107CFU/mL S-2，于37℃、5％CO2培养箱中共培养。培养16h后，弃去旧培养基，PBS清洗3次后，每孔加入106CFU/mL E.coli K99进行攻毒，37℃、5％CO2培养箱中培养12h；培养结束后，弃去旧培养基，并用PBS清洗3次。之后收集细胞，用于测定相关基因的基因表达及蛋白表达。
试验中，没有经S-2及E.coli K99处理的细胞定为对照组(CON)，单独E.coli K99攻毒处理的细胞定为K99组，而S-2预处理并用E.coli K99攻毒的细胞定为S-2+K99组，用L-Ala诱导过的S-2预处理并用E.coli K99攻毒的细胞定为S-2+K99组，每组共3个重复(孔)。
(2)IPEC-J2细胞炎症相关基因表达测定：经试验处理的细胞用PBS清洗3次，加入Trizol裂解细胞，用异丙醇沉淀法提取RNA置于-80℃保存备用。RNA用于荧光定量PCR(qRT-PCR)分析。按照反转录试剂盒HiScript II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)说明书进行cDNA的合成，产物于-20℃冻存备用。参照NCBI网站Gene Bank中相关基因的序列，设计目的基因引物。荧光定量PCR采用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒测定目的基因的表达量。实时荧光定量PCR结果采用2-△△CT法表示，即△CT＝CT(目的基因)–CT(β-actin)，△△CT＝△CT(处理组)–△CT(对照组)。如图3所示：S-2的加入缓解了E.coliK99感染引起的IPEC-J2细胞炎症，L-Ala萌发增强了S-2缓解E.coli K99感染引起的IPEC-J2细胞炎症的效果。
(3)IPEC-J2细胞紧密连接蛋白表达测定：经试验处理后的细胞，弃去培养基，冷的PBS清洗3次；将细胞置于冰上，加入含1％蛋白酶-磷酸酶抑制剂RIPA蛋白裂解液，轻轻晃动使裂解液均匀分散于细胞表面；放摇床上，冰浴30min；用细胞刮刮取细胞，4℃、12000rpm/min离心15min；取上清，用BCA蛋白定量试剂盒测定细胞蛋白的浓度；根据测定的蛋白浓度，用RIPA裂解液将样品蛋白浓度调成一致；进行Western blot实验，检测紧密连接蛋白ZO-1、occludin和cluadin-1表达量。如图4所示：S-2的加入缓解了E.coli K99感染引起的IPEC-J2细胞屏障损伤，L-Ala萌发增强了S-2缓解E.coli K99感染引起的IPEC-J2细胞屏障损伤。
实施例4
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis S-2对动物生长性能的促进作用
实验采用42只初断奶的SD雄性大鼠。将鼠房温度控制在25℃左右，日照时间为7:00至18:00。SD大鼠单笼饲养，位置摆放在相同环境下。实验共设置4个处理组分别为阳性试验组(攻毒组)和阴性试验组(不攻毒组)，芽孢试验组以及L-Ala芽孢萌发试验组，每个处理6个重复。适应期2天过后，给各SD大鼠称重，给予每笼添加适量饲料及饮水。Bacillussubtilis S-2芽孢采用产孢培养基进行扩大培养；用生理盐水洗涤两次后用一定体积100mM的L-Ala悬浮并调整细胞到一定浓度获得Bacillus subtilis S-2萌发芽孢。第三天开始芽孢试验组和L-Ala芽孢萌发试验组在饮水中添加含107CFU/mL的Bacillus subtilisS-2芽孢的生理盐水，连续口服14天；阳性试验组和阴性试验组饮用正常的生理盐水14天。在第16天时阳性试验组、芽孢试验组每只大鼠进行一次性灌服1mL含0.3％NaHCO3的109CFU/mL肠毒性的E.coli K99；阴性试验组灌服1mL生理盐水。在第2天、第16和18天分别记录试验SD大鼠体重，计算SD大鼠日增重。如图5所示：E.coli K99感染引起SD大鼠日增重的降低，L-Ala萌发组增加了SD大鼠的日增重，增强了S-2缓解E.coli K99感染引起的SD大鼠日增重的降低的效果。
序列表
<110> 中南民族大学
<120> 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis S-2及合生制剂的配伍方法及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1550
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
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tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc 1140
attcagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg 1200
tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga cagaacaaag 1260
ggcagcgaaa ccgcgaggtt aagccaatcc cacaaatctg ttctcagttc ggatcgcagt 1320
ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg 1380
aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg taacacccga 1440
agtcggtgag gtaacctttt aggagccagc cgccgaaggt gggacagatg attggggtga 1500
agtcgtaaca aggtagccgt atcggaaggt gcggctggat cacctccttt 1550

Claims (6)

1.一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis S-2，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2021年9月3日，保藏编号为：CCTCCNO：M20211135，分类学命名Bacillus subtilis。
2.一种益生芽孢杆菌与其合生制剂的制备方法，其特征在于具体步骤为：
步骤1.益生芽孢杆菌的芽孢的制备：菌株采用产孢培养基进行扩大培养，取单菌落接种于斜面进行培养，用无菌水洗涤斜面菌体并制得芽孢悬液，离心收集芽孢菌体，将菌体重悬在缓冲液中并用分光光度计调初始OD600nm值至1.0；
步骤2.益生芽孢杆菌与营养性萌发剂的孵育：使用在肠道内潜在的若干种营养介质作为营养性萌发剂，各个萌发剂均用缓冲液溶解；将步骤1中OD600nm值至1.0的芽孢悬液分成两份，一份置于密封试管中，加热处理使芽孢中的DPA全部释放，冷却后离心处理得到上清液备用；另一份芽孢悬液离心处理，去上清液后加入等量的含有营养性萌发剂的缓冲液孵育，然后取样并离心处理得到上清液，分别检测不同处理条件下的两份上清液的DPA荧光强度；
步骤3.益生芽孢杆菌萌发潜力的评估：步骤2中DPA荧光强度的检测结果用相对荧光强度来表示，所述相对荧光强度是指用使用含有营养性萌发剂的缓冲液孵育处理的荧光强度与未使用含有营养性萌发剂的缓冲液孵育处理的荧光强度的比值，相对荧光强度数值超过50％即认为该菌株在对应的营养性萌发剂条件下具有萌发响应的能力；
步骤4.益生芽孢杆菌与对应的营养性萌发剂的配伍：将芽孢杆菌菌粉与该菌种对应的营养性萌发剂相混合，每1亿个芽孢中添加营养性萌发剂的浓度不低于0.1mmol，所述与该菌种对应的营养性萌发剂是指该菌种在对应的营养性萌发剂条件下具有萌发响应的能力，与该菌种对应的营养性萌发剂即为该菌株的合生制剂。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：益生芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis S-2时，与该菌种对应的营养性萌发剂为L-Ala。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis S-2与其对应的营养性萌发剂混合后在抗炎、屏障功能及抵抗肠毒性大肠杆菌对肠道损伤中的应用。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤2中的若干种营养介质包括糖类、氨基酸类、盐离子和复合型萌发剂，其中糖类至少包括D-葡萄糖，D-果糖，蔗糖；氨基酸类至少包括L-Val，L-Gln，L-Arg，L-Pro，L-Lys，L-Gly，L-Glu，L-His，L-Asp，L-Try，L-Ala；复合型萌发剂至少包括AGFK，即100mM L-Asp+10mM D-葡萄糖+10mM D-果糖+10mM KCl。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1和步骤2中的缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
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