CN111607541B - 一种虹鳟源枯草芽孢杆菌菌株及其筛选方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种虹鳟源枯草芽孢杆菌菌株及其筛选方法和应用，首先从健康虹鳟肠道中筛选鉴定获得枯草芽孢杆菌RT‑BS07株，对菌株的生物学特性进行了分析，并通过体内试验评价其对虹鳟的促生长和抗感染等方面的益生功能。本发明所得RT‑BS07株具有安全、耐酸耐盐、能较好粘附在宿主肠道上、能抑制致病菌生长的特点；能有效促进虹鳟体长、体质量、脾脏重量和肠道长度的增长；能有效提高虹鳟相关组织中免疫和消化相关酶活性；能有效促进虹鳟相关组织中生长及免疫相关基因的上调表达；能提高虹鳟机体抗感染能力，经嗜水气单胞菌攻毒感染后，实验组死亡率比对照组低30％。

Description

一种虹鳟源枯草芽孢杆菌菌株及其筛选方法和应用

技术领域

本发明涉及一种虹鳟源枯草芽孢杆菌菌株及其筛选方法和应用，属于微生物技术领域。

背景技术

益生菌源于希腊文Probiotics一词，是“共生”的意思，意味着“在动物之间的生命维持上起到相互补益的作用”，与Antibiotics(抗生素)相对立。具体来说，益生菌是通过定植在生物体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。通过调节宿主黏膜与系统免疫功能或通过调节肠道内菌群平衡，促进营养吸收保持肠道健康的作用，从而产生有利于宿主健康作用的单微生物或组成明确的混合微生物。

水产益生菌具有增强鱼体免疫机能、抑制病原微生物和提高饲料利用率等作用。已有研究表明，益生菌如乳酸菌、芽孢杆菌等可有效调控肠道菌群结构，维持肠道微生态动态平衡，提高鱼体非特异性免疫机能，激活鱼体细胞和体液免疫系统，增强对各种疾病的抵抗能力；同时，益生菌在预防和控制鱼类传染性疾病方面具有重要作用，可通过改变宿主体内的微生物菌群组成，阻断或抑制致病菌在肠道黏膜上黏附、定植和繁殖，其代谢产物亦可限制病原菌的生长；此外，益生菌在调控水质、提高饲料利用率等方面也有重要作用。

目前，我国虹鳟的病害防治主要依赖抗生素等化学药物，容易对生态、环境及食品安全等方面造成不良影响。因此，国内外科学家致力于各种抗生素替代品的研究，绿色环保的益生菌成为研究热点，且益生菌的效果已在鲤鱼、罗非鱼、虹鳟等多种鱼类中得以证实。

由于种质、生境及饲养条件等差异，国外研发及商品化益生菌在我国虹鳟养殖中的现实应用具有一定的局限性和不适应性，不能得到较好的效果和推广。立足我国养殖现状，分离、筛选适用于我国虹鳟养殖应用的益生菌菌株已成为目前迫在眉睫的重要工作之一。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种虹鳟源枯草芽孢杆菌菌株及其筛选方法和应用，首先从健康虹鳟肠道中筛选鉴定出枯草芽孢杆菌RT-BS07株，对菌株的生物学特性进行研究，并通过体内试验评价RT-BS07株对虹鳟促生长及抗感染等方面的益生功能。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种虹鳟源枯草芽孢杆菌菌株，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)RT-BS07，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉大学保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2019916，保藏日期：2019年11月11日。

所述的枯草芽孢杆菌菌株的筛选方法，包括以下步骤：

(1)在无菌条件下，对虹鳟体表进行消毒，解剖获取虹鳟肠道组织，用无菌磷酸盐缓冲液PBS冲洗，采用组织匀浆器破碎肠道组织，得到组织匀浆液，将组织匀浆液收集于1mL无菌生理盐水中，梯度稀释后取100μL涂布于选择性培养基表面，于恒温培养箱中28℃倒置培养；挑取平板上的单菌落，通过划线培养法进行纯培养，直到获得纯培养物，将纯培养物接种到LB液体培养基内，28℃摇菌扩大培养18h，将所得菌液保存于18％的灭菌甘油内，-80℃冷冻保存；

(2)采用分子生物学方法对菌株进行种属鉴定，选取16S rDNA作为目标基因，选择引物进行PCR扩增，结合理化特性分析，鉴定菌株属于枯草芽孢杆菌，并命名为枯草芽孢杆菌RT-BS07。

所述步骤(1)选择性培养基为枯草芽孢杆菌优化培养基；步骤(2)中引物序列为：27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’和1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

所述步骤(2)中PCR扩增体系为：2×premix 25μL，10pmol/μL的27F和10pmol/μL的1492R引物各2μL，细菌基因组DNA为模板1μL，质量为50ng，加水补足至50μL；PCR扩增的反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。

所述的枯草芽孢杆菌菌株制备的含益生菌饵料。

所述的含益生菌饵料的制备方法，取出-80℃冷冻保存的枯草芽孢杆菌RT-BS07菌种的冻存菌液，取5μL上述冻存菌液接种于5mL的LB液体培养基中，于28℃下120rpm的转速摇菌培养12h，得到培养液，然后取2mL培养液加入2L的LB液体培养基中，继续摇菌培养18h，制备菌悬液；

将菌悬液于4℃条件下4000rpm转速离心10min，收集菌体，用无菌磷酸盐缓冲液PBS重悬，用PBS反复洗涤3次，去除培养基干扰，最终调节PBS菌悬液浓度为1×10¹¹～2×10¹¹CFU/mL，将菌悬液稀释100倍，将饲料与菌悬液稀释液按照质量体积比为10：1的比例均匀混合，并反复翻动保持通风阴干，最终得到菌浓度为1×10⁸～2×10⁸CFU/g的含益生菌饵料。

所述的枯草芽孢杆菌菌株在促进虹鳟机体生长性能方面的应用。

所述的枯草芽孢杆菌菌株在提高虹鳟相关组织中消化酶及免疫相关酶活性方面的应用。

所述的枯草芽孢杆菌菌株在促进虹鳟相关组织中生长及免疫相关基因表达水平方面的应用。

所述的枯草芽孢杆菌菌株在提高虹鳟机体抗感染能力方面的应用。

本发明有益效果：

本发明从健康虹鳟肠道中分离筛选出益生菌，用于提高虹鳟生长、非特异性免疫水平和抗病力，为益生菌在虹鳟健康养殖中的高效、安全应用提供理论基础和技术支撑。经实验筛选并比较分析，获得了一株具有耐酸耐盐、能较好粘附在宿主肠道上皮细胞上，能抑制致病菌生长的虹鳟肠道的枯草芽孢杆菌菌株RT-BS07株。

本发明所得的RT-BS07株对虹鳟安全，并能有效促进虹鳟体长、体质量、脾脏重量和肠道长度的增长；能够有效提高虹鳟相关组织内免疫和消化相关酶活性；能够有效促进虹鳟机体相关组织生长及免疫相关基因的上调表达；能够提高虹鳟机体抗感染能力，攻毒试验表明，感染嗜水气单胞菌后的实验组鱼的死亡率比对照组低30％。

附图说明

图1RT-BS07株培养及革兰氏染色图；

其中，(a)为分离得到的RT-BS07株在固体培养基上的菌落分布图，(b)为(a)中RT-BS07株经革兰氏染色后的显微观察图；

图2RT-BS07株荚膜及芽孢观察结果分析图；

其中，(a)为荚膜显微观察图，(b)为芽孢显微观察图；

图3PCR凝胶电泳图谱；

其中，C为阴性对照，M为DNA分子质量标准(DL2000)，1为RT-BS07株；

图4RT-BS07株抑菌效果分析图；

图5RT-BS07株生长特性分析图；

其中，(a)不同盐度梯度下，(b)不同温度梯度下，(c)不同酸碱度梯度下；

图6RT-BS07株对虹鳟肠道粘附性的微观观察图；

其中，(a)前肠观察结果，(b)中肠观察结果，(c)后肠观察结果；

图7实验鱼体长及体质量增长情况分析图；

其中，*表示显著，**表示极显著；网格柱状图为对照组，斜线柱状图为实验组，下图同；

图8实验鱼肝脏及脾脏重量增长情况分析图；

图9实验鱼肠道长度增长情况分析图；

图10实验鱼不同组织中酶活性测定分析图；

其中，(a)碱性磷酸酶，(b)酸性磷酸酶，(c)超氧化物歧化酶，(d)丙二醛，(e)溶菌酶；图11实验鱼不同组织中IL-1β基因和GH-2基因的表达情况分析图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1 枯草芽孢杆菌菌株RT-BS07的筛选及鉴定

1.RT-BS07株的分离及纯化培养

选择青海、辽宁等冷水鱼主养区的代表性虹鳟养殖场为采样地点，对虹鳟肠道中的益生菌进行初步筛选分离。在无菌条件下，对虹鳟体表进行消毒，解剖获取虹鳟肠道组织，无菌磷酸盐缓冲液PBS冲洗3次后，采用组织匀浆器破碎肠道组织，得到组织匀浆液，将组织匀浆液收集于1mL无菌生理盐水中，梯度稀释后取100μL涂布于选择性培养基表面，置于恒温培养箱中28℃倒置培养。挑取平板上的单菌落，通过划线培养法进行纯培养，直到获得纯培养物。将纯培养物接种到LB液体培养基内，28℃摇菌扩大培养18h，将所得菌液保存于质量分数为18％的灭菌甘油内，-80℃冷冻保存。

所述选择性培养基为枯草芽孢杆菌优化培养基(Bacillus SubtilisOptimization Medium)，编号M1318B，购自山东拓普生物工程有限公司。

2.RT-BS07株菌体特征观察

纯化培养后结果如图1所示，形态学观察发现，分离到的益生菌RT-BS07株菌落表面粗糙不透明，呈污白色，在液体培养基中生长时常形成皱壁，进行革兰氏染色可见紫色短杆菌。

选用染色试剂盒(购自北京雷根(Leagene)生物技术有限公司)对益生菌RT-BS07株的夹膜和芽孢进行观察，按试剂盒说明书进行操作。

经染色，观察益生菌RT-BS07株夹膜及芽孢如图2所示：所获RT-BS07株有宽厚透亮的荚膜，可见清晰细胞壁；有芽孢，卵圆形或圆形，位于菌体中央，菌体细胞膨大，菌体蓝黑色，芽孢红色，约占菌体2/3大小。

3.RT-BS07株理化特性的鉴定分析

参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对RT-BS07株的理化特性进行分析鉴定。结果如表1所示：

表1 RT-BS07株理化特征分析结果

生化项目	结果	生化项目	结果
				厌氧生长	-	接触酶	+
淀粉水解	+	明胶液化	+
				V-P实验	+	MR	-
硝酸盐还原	+	葡萄糖产气	+
				硫化氢	-	水杨苷	+
5％NaCl	+	7％NaCl	-

注：“+”表示反应为阳性或生长；“-”表示反应为阴性或不生长。

由表1实验结果分析可知，RT-BS07株符合枯草芽孢杆菌的理化特性，初步鉴定RT-BS07株为枯草芽孢杆菌。

4.RT-BS07株分子生物学鉴定

选取16S rDNA作为目标基因，对RT-BS07株进行菌株分子生物学鉴定。所选通用引物序列为：

27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’

1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’

PCR扩增体系为：2×premix 25μL，27F(10pmol/μL)和1492R引物(10pmol/μL)各2μL，细菌基因组DNA为模板1μL(约50ng)，加水补足至50μL；扩增反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。扩增结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示，选取阳性扩增的目的条带进行序列测定。

PCR扩增所有试剂购自TOYOBO东洋纺(上海)生物科技有限公司，引物合成及序列测定由吉林省库美生物科技有限公司完成。

由图3可见，阴性对照无目的条带扩增，待测菌株扩增产物在1600bp处有单一阳性扩增条带，故可判定扩增成功。测定所得序列采用Blast方法与Genbank数据库中已有序列进行比对，结合上述菌株理化特性鉴定结果，确定本申请分离的菌株属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

实施例2 枯草芽孢杆菌菌株RT-BS07的生物学特性分析

1.RT-BS07株的体外抑菌特性分析

以多粘菌素B为阳性对照，PBS为阴性对照，选取虹鳟养殖过程中常见病害微生物，比较分析了RT-BS07株对杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、温和气单胞菌(A.sobria)、维氏气单胞菌(A.veronii)、鲁氏耶尔森菌(Yersinia ruckeri)和嗜水气单胞菌(A.hydrophila)等菌株(所用菌株具体信息见：张枭,李绍戊,王荻,曹永生,卢彤岩.鲁氏耶尔森菌qPCR快速检测方法的建立和应用[J].中国水产科学,2017,24(6):1254-1260.)的拮抗抑菌作用。

具体测定方法为：将选取的代表性病原微生物添加到固体培养基中倒板后，牛津杯打孔，每个孔添加100μL益生菌RT-BS07株菌液或相应阴/阳性对照样品，28℃培养24小时后观察抑菌现象，并测量抑菌圈直径，计算抑菌面积后形成图4。

由图4可见，阳性对照多粘菌素B形成了明显的抑菌圈，抑菌面积约为1.8cm²，而阴性对照PBS未形成抑菌圈。本研究分离的RT-BS07株对温和气单胞菌、杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鲁氏耶尔森菌等绝大多数环境中的条件致病菌和致病性微生物都具有较强的拮抗和抑菌作用，且对温和气单胞菌抑菌效果最强。

2.RT-BS07株的产酶特性分析

针对芽孢杆菌产酶特点，选取蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和脂肪酶测试试剂盒对RT-BS07株的产酶特性进行分析。测试试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司，按检测试剂盒说明书的步骤进行操作。

经计算测得RT-BS07株蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和脂肪酶活性如表2所示：

表2 RT-BS07株产酶特性测定

由表2结果可见，RT-BS07株可分泌具有较高酶活性的蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶，能有效提高对饲料中植物性碳水化合物的降解，促进饲料营养物质的消化，可用于后期对虹鳟益生效果分析和应用实验。

3、RT-BS07株的基本生物学特性分析

(1)RT-BS07株的抗逆特性分析

比较不同温度、盐度及pH值条件下RT-BS07株的生长特性并测定其生长曲线。分别设置1％、2％、3％、4％、6％和8％的盐度梯度；18℃、23℃、33℃和38℃的温度梯度；pH为2、4、6、8和10的酸碱度梯度进行比较分析，结果如图5所示。

由图5可知，RT-BS07株在低于6％的盐度下均可生长，在1％的低盐度下生长最快最好，但3％盐度以下都可以正常生长；RT-BS07株在18℃的低温下基本不生长，但是在38℃以下的高温下均可正常生长；RT-BS07株对酸度也耐受力较强，在pH值4-8之间均可正常生长，且4-6之间生长良好。由此可见，所选菌株RT-BS07耐盐耐酸耐高温，具备良好的生长活性特征。

(2)RT-BS07株的粘附性分析

①RT-BS07株荧光标记：

a)按说明书要求，将5mg的CFDA-SE溶解于8969μL二甲基亚砜，经0.22μm滤膜过滤制得母液，浓度为1mmol/L，保存于-20℃待用；

b)益生菌RT-BS07株培养液4℃，12000转/分钟离心5分钟后，用无菌磷酸盐缓冲液PBS冲洗3次，并悬浮于PBS溶液中，使得菌浓度为1×10⁹CFU/mL；

c)将CFDA-SE母液添加至1mL菌悬液中，使其浓度为20μmol/L，此混合物在37℃下避光孵育20分钟后，12000转/分钟离心10分钟，PBS洗涤3次去除多余的CFDA-SE。

②RT-BS07株粘附情况观察

a)采集健康虹鳟肠道组织，PBS缓冲液冲洗3次；

b)将孵化后的荧光标记菌液注射于虹鳟肠道中，分前、中、后肠三部分分别用细线结扎；

c)将处理好的肠道组织浸于PBS缓冲液中，37℃孵化6h；

d)取出肠道组织，去除结扎细线，用PBS缓冲液反复冲洗3次；

e)样品速冻固定，冷冻切片观察虹鳟肠道(前，中，后)，观察荧光标记益生菌RT-BS07株在虹鳟肠道中的粘附情况。

虹鳟肠道组织中注入荧光标记的RT-BS07株后，分为前肠、中肠和后肠三部分分别结扎于6孔板中进行孵育，并设立注入PBS缓冲液的平行对照组。

③粘附情况观察结果

经冷冻切片机切片后荧光显微镜观察，结果如图6所示。

由图6所见，虹鳟前、中、后肠中均清晰可见荧光标记的、显绿色荧光的短杆状RT-BS07菌，短杆菌广泛粘附于肠道内粘膜上。表明RT-BS07株对虹鳟肠道具有良好的粘附性，为后期益生效果的产生提供必要保障。

(3)RT-BS07株的药敏特性分析

选取常用药物氟喹诺酮类(左氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星和氧氟沙星)，氨基糖苷类(链霉素、卡那霉素、阿米卡星、庆大霉素、大观霉素和新霉素)，四环素类(四环素和强力霉素)，硝基呋喃类(呋喃唑酮和呋喃妥因)，青霉素类(阿西莫林和氨苄西林)，β－氨基糖苷类(青霉素G和头孢哌酮)，磺胺类(甲氧嘧啶、复方新诺明和磺胺异恶唑)，氯霉素类(氯霉素)，利福平类(利福平)，大环内酯类(红霉素)，共计10大类25种药物进行RT-BS07株的药敏特性分析，药敏判读标准根据美国临床与实验室标准协会(CLSI)标准进行，具体结果见表3。

表3 RT-BS07株药敏特性分析

由表3药敏结果可见，RT-BS07株对10大类25种常用药物中的绝大部分药物(19种，76％)都呈敏感状态；对氟喹诺酮类的恩诺沙星和四环素类的四环素呈中度敏感状态；对已禁用的硝基呋喃类的呋喃唑酮和呋喃妥因、极少用于水产的β－氨基糖苷类的青霉素G和利福平类的利福平呈耐药状态。

实施例3 RT-BS07株对虹鳟的安全性及应用效果评估

1.含益生菌RT-BS07株的饵料的制备及实验鱼免疫投喂

取出-80℃冷冻保存的RT-BS07株菌种，取5μL冻存菌液接种于5mL的LB液体培养基(酵母提取物5g；胰化蛋白胨10g；氯化钠10g；NaOH调pH至7.0，加水定容至1L，于121℃保持15min高压灭菌)中，于28℃下120转/分钟摇菌培养12h，得到培养液，然后取2mL培养液加入2L液体LB培养基中，继续120转/分钟摇菌培养18h制备菌悬液。

选取爱乐银牌鱼饲料作为基础饲料，根据实验鱼大小选取2mm直径的饲料，饲料有效成分包括：45％的粗蛋白，20％的粗脂肪，17.9％的无氮浸出物，1.9％纤维，7.2％的灰分，1.1％的总磷，0.3％的总钠，1％的总钙，并含有10.000IU/kg维生素A，1.000IU/kg的维生素D3，3mg/kg的钙(碘化钙)，5mg/kg的铜(硫酸铜)，12mg/kg的锰(硫酸锰)，70mg/kg的锌(硫酸锌)，并用基础饲料制备含益生菌饵料。

于4℃条件下4000转/分钟离心10分钟收集菌体，用磷酸盐缓冲液PBS重悬，用PBS反复洗涤3次，去除培养基干扰，最终调节PBS菌悬液浓度为1×10¹¹～2×10¹¹CFU/mL，将菌悬液稀释100倍，将饲料与菌悬液稀释液按照质量体积比为10：1的比例均匀混合，并反复翻动保持通风阴干，最终获得含有菌浓度约为10⁸CFU/g的含益生菌饵料。

随机选取健康、非免疫状态下虹鳟幼鱼为实验鱼，分别设立投喂基础饲料的对照组和投喂添加益生菌饲料的实验组，每组30尾，3个平行。对照组投喂基础饲料，实验组投喂含益生菌的饵料，于水温14℃下每日投喂2次，按照2％鱼体质量的投饵量进行投喂，及时清理鱼缸并保持氧气充足。

2.实验鱼健康情况与生长指标的测定

对实验鱼连续投喂含益生菌RT-BS07株的饵料42天，分别于实验初始0天和投喂后的14、28和42天时，准确称量实验鱼的体长，体质量，肝重，脾重和肠道长度等数据，用于后期比较分析。

①实验鱼健康情况观测

通过投喂实验评价RT-BS07株对虹鳟的安全性。投喂实验开始后，连续观察并记录实验鱼体表、行为、摄食等情况。并于实验初始0天和投喂后的14、28和42天时每组随机选取3尾实验鱼剖检检查。观察结果表明，投喂开始至实验结束，所有实验鱼无死亡。且实验组与对照组实验鱼体表，游动及摄食等行为观察结果均一致，无异常表现。剖检发现，实验鱼鳃、肝、脾、肠、肌肉组织形态及生长发育正常。结果表明，RT-BS07株对虹鳟安全。

②实验鱼体长及体质量增长情况

由图7可见，投喂含益生菌饵料的实验组和投喂基础饲料的对照组相比，随着投喂时间的延长，实验组的鱼体长和体质量增长均高于对照组。投喂初期(0-14天)，实验组鱼体长变化与对照组未形成显著差异，至投喂28天实验组鱼体长显著大于对照组，至投喂42天实验组鱼体长极显著大于对照组。而随着投喂时间的延长，实验组鱼与对照组相比，体质量增加的更为明显，投喂14天时，实验组鱼体质量已显著高于对照组，投喂42天时，两个组呈极显著差异。经计算，至投喂结束，实验组增重率达到118.21％，对照组为54.87％。

③实验鱼肝脏及脾脏重量增长情况

由图8可见，投喂含益生菌饵料的实验组和投喂基础饲料的对照组相比，随着投喂时间的延长实验组的鱼肝脏重量与对照组未形成显著差异，但脾脏重量增长显著高于对照组。投喂初期(0-14天)，实验组鱼脾脏重量与对照组未形成显著差异，至投喂28以后实验组鱼脾脏重量均极显著大于对照组。

将益生菌饵料投喂后实验鱼肝脏及脾脏重量增长详细数据，肝体指数(HSI＝肝脏重量/鱼体重量*100％)以及脾体指数(SSI＝脾脏重量/鱼体重量*100％)数值均列于下表4：

表4 益生菌饵料投喂后实验鱼肝体指数和脾体指数

注：表中*表示显著，**表示极显著，下表同

由表4益生菌饵料投喂后实验鱼肝脏、脾脏重量增长的具体信息表可见：实验初始实验组与对照组鱼肝脏及脾脏重量差异极小，但随着投喂时间延长差异逐渐明显。且实验组与对照组实验组与的肝体指数随着投喂时间延长增加稳步增长，未见差异；而脾体指数随着投喂时间的延长快速增长的同时，实验组比对照组增长速度要快的多。

④实验鱼肠道长度增长情况

由图9可见，投喂含益生菌饵料的实验组和投喂基础饲料的对照组相比，随着投喂时间的延长实验组的实验鱼肠道长度显著长于对照组。投喂初期(0-14天)，实验组鱼肠道长度随增长迅速但与对照组未形成显著差异；至投喂28天，实验组实验鱼肠道长度达到6.27cm，显著高于对照组的5.07cm；至投喂42天，实验组实验鱼肠道长度7.42cm，极显著高于对照组的5.92cm。至投喂结束，实验组肠道长度增长率达到71.36％，对照组仅为40.28％。将益生菌饵料投喂后实验鱼肝脏及脾脏重量增长详细数据，肠体指数(TSI＝肠道长度/体长*100％)数值均列于下表5：

表5 益生菌饵料投喂后实验鱼肠体指数

由表5益生菌饵料投喂后实验鱼肠道长度增长的具体信息表可见：实验初始实验组与对照组实验鱼肠道长度差异极小，但随着投喂时间延长差异逐渐明显。

3.实验鱼组织中消化酶、免疫相关酶水平的检测

采集投喂实验结束后实验组和对照组的实验鱼肝、脾、血清、肠和肌肉组织测定消化酶和免疫相关酶水平的变化。酶活性测定试剂盒(考马斯亮蓝蛋白定量测试试剂盒、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、丙二醛和溶菌酶)购自南京建成生物工程研究所。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，测定结果如图10所示。

由图10-a可见，肝、脾及血清中碱性磷酸酶AKP活性较低，肠组织中酶活性最高，肌中次之。投喂含益生菌的饵料后，实验组虹鳟肠道中AKP酶活性极显著高于对照组。由图10-b可见，血清及肌肉中酸性磷酸酶ACP活性较低，肠组织中酶活性最高，脾中次之，肝中更次。投喂含益生菌的饵料后，实验组虹鳟肠道和脾脏中ACP酶活性均高于对照组，肝脏中更是显著高于对照组。由图10-c可见，超氧化物歧化酶的活性在各组织中表现为：肠道>肌>血清>肝脏>脾脏，投喂含益生菌饵料的实验组虹鳟肠道中SOD活性极显著高于对照组，血清和脾脏中酶活性也显著高于对照组。由图10-d可见，丙二醛(MDA)的含量在各组织中表现为：肠道>肝脏>血清>脾脏>肌，投喂含益生菌饵料的实验组虹鳟肝、脾和血清中MDA含量显著低于对照组，而肠和肌肉组织中则无显著差异。由图10-e可见，血清和肠中溶菌酶含量较高，且实验组与对照组形成显著性差异。

4.实验鱼组织中生长及免疫相关基因表达水平的检测

投喂含RT-BS07菌的饵料后，分别采集投喂0、14、28和42天的对照组和实验组虹鳟的肝、脾、肠和肌肉组织，选用Promega总RNA提取试剂盒对核酸进行提取，选用TOYOBO反转录试剂盒(ReverTra

qPCR RT Master Mix with gDNA Remover Code No.FSQ-301)，按照试剂盒说明书完成反转录：

a)取6μL总RNA于65℃热变性5min，立即置于冰上冷却；

b)加入2μL的4×DN Master Mix，37℃温育5min；

c)加入2μL的5×RT Master MixII，反转录37℃15min，50℃5min，酶失活反应98℃5min。

以β-actin持家基因为内参，采用实时荧光定量PCR方法(RT-qPCR)对实验组及对照组虹鳟的生长激素受体GH-2和细胞因子IL-1β基因的表达情况进行检测；引物序列如表6所示：

表6 荧光定量PCR检测引物

引物名称	引物序列
		GH-2F	5'-GCT TCA AGA AGG ACA TGC ATA AGG TT-3'
GH-2R	5'-CCC ACG TTT ACA GAG TGC AGT TG-3'
		IL-1β-F	5’-GGA GAG GTT AAA GGG TGG CGA-3’
IL-1β-R	5’-TGC CGA CTC CAA CTC CAA CA-3’
		β-actin-F	5’-GCC GGC CGC GAC CTC ACA GAC TAC-3’
β-actin-R	5’-CGG CCG TGG TGG TGA AGC TGT AAC-3’

RT-qPCR选用Novo

SYBR qPCR SuperMix Plus试剂盒(购自Novoprotein公司)进行，反应体系为：12.5μL的2×Novo

SYBR qPCR SuperMix Plus(缓冲液)，上下游引物各1μL(10pmol/μL)，反转录产物2μL，Rox染料0.5μL，加水补足至25μL。

选用ABI公司7500型荧光定量PCR仪，按照试剂盒说明书进行实时扩增检测。每个PCR反应设3个重复，以β-actin持家基因表达量为对照，采用2^-ΔΔCT法进行计算GH-2和IL-1β基因表达的倍数变化。具体结果如图11所示。

由图11可见，投喂含益生菌的饵料后，虹鳟肝、脾、肠及肌肉组织中免疫相关基因IL-1β和生长相关基因GH-2的表达情况均有所变化。具体表现为：肝、脾和肠组织中IL-1β基因表达上调，显著或极显著高于对照组；肝、肌和肠组织中的GH-2基因表达上调，显著或极显著高于对照组；脾和肠组织中的IL-1β基因、肝和肌组织中的GH-2基因上调尤为显著。结果表明，随着投喂益生菌时间的延长，肝、脾、肠和肌组织中的免疫相关基因和生长相关基因均上调，这样的结果从分子水平上反应了益生菌可有效促进机体生长及免疫力的增强。

5.实验鱼抗病力的比较研究

投喂结束后，进行实验鱼抗病力的比较分析。取冻存的嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila，Ah)ATCC7966株划线接种于TSA琼脂平板上，28℃恒温培养24～36h复苏。挑取单菌落接种于TSB肉汤培养基中，28℃下120转/分钟震摇24h，离心收集菌体并重悬于无菌PBS缓冲液中，采用系列稀释法测定菌液浓度并制备浓度为1×10⁷cfu/mL的菌悬液。采用腹腔注射方法按0.1mL/50g体质量的菌液浓度分别对照组和实验组虹鳟进行攻毒实验，同时设立注射等比例无菌PBS的空白对照组，每组30尾实验鱼。腹腔注射后连续观察，并记录死亡累积情况至攻毒后96小时，具体结果见表7。

表7 攻毒实验结果

由表7可见，攻毒结果显示，空白对照组无死亡，而实验组死亡率30％显著低于对照组的60％。该结果表明：投喂含有RT-BS07益生菌的饵料后，益生菌通过提高机体消化吸收和免疫相关能力，能有效提高实验鱼的抗感染力。

综上所述，益生菌应具备①能耐受胃酸和胆盐；②能较好的粘附于宿主肠道上；③能抑制致病菌生长；④安全、无致病性等要求，RT-BS07菌株均已满足。该菌株具备益生菌所需的所有特点，且兼具促进机体生长和抗感染能力，能有效提高实验鱼消化、免疫相关酶活性，并促使相关组织中生长及免疫相关基因上调表达，各项实验结果均表明RT-BS07菌株对虹鳟具有良好的益生特性。

序列表

<110> 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所

<120> 一种虹鳟源枯草芽孢杆菌菌株及其筛选方法和应用

<130> PCR检测

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

agagtttgat cctggctca 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 3

gcttcaagaa ggacatgcat aaggtt 26

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 4

cccacgttta cagagtgcag ttg 23

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 5

ggagaggtta aagggtggcg a 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 6

tgccgactcc aactccaaca 20

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 7

gccggccgcg acctcacaga ctac 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 8

cggccgtggt ggtgaagctg taac 24

Claims (4)

1.一种虹鳟源枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）RT-BS07，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉大学保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2019916，保藏日期：2019年11月11日。

2.一种含权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株制备的含益生菌饵料。

3.根据权利要求2所述的含益生菌饵料的制备方法，其特征在于，取出-80℃冷冻保存的枯草芽孢杆菌RT-BS07菌种的冻存菌液，取5 μL上述冻存菌液接种于5 mL的LB液体培养基中，于28℃下120 rpm的转速摇菌培养12 h，得到培养液，然后取2 mL培养液加入2 L的LB液体培养基中，继续摇菌培养18 h，制备菌悬液；

将菌悬液于4℃条件下4000 rpm转速离心10 min，收集菌体，用无菌磷酸盐缓冲液PBS重悬，用PBS反复洗涤3次，去除培养基干扰，最终调节PBS菌悬液浓度为1×10¹¹~2×10¹¹CFU/mL，将菌悬液稀释100倍，将饲料与菌悬液稀释液按照质量体积比为10：1的比例均匀混合，并反复翻动保持通风阴干，最终得到菌浓度为1×10⁸~2×10⁸ CFU/g的含益生菌饵料。

4.一种如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株在促进虹鳟机体生长性能方面的应用。

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