CN113215043B - 短小芽孢杆菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种短小芽孢杆菌(Baci l l us pumi l us)FTBP1，保藏号为CCTCC M 2021410，本发明人自广东湛江养殖池塘底泥发现一种菌株，并经过分离、纯化后得到该菌株，继而诱变得到该保藏的菌株，经生物学特性检测、16sDNA测序分析等手段，最终鉴定为短小芽孢杆菌(Baci l l us pumi l us)，命名为FTBP1，并在后续试验中发现，其在抑制弧菌生长中效果显著，本发明人针对该短小芽孢杆菌的具体应用方式进行了多重研究，如直接饲料应用、微生态制剂应用，制备成菌粉应用等。

Description

短小芽孢杆菌及应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及短小芽孢杆菌，以及该短小芽孢杆菌在抑制弧菌生长中的应用。

背景技术

随着规模化、集约化水产养殖业的迅速发展，高密度、高投喂量的养殖模式普遍应用。此养殖模式下，水产养殖弧菌病害越来越频繁发生，如副溶血弧菌导致养殖对虾大量死亡，溶藻弧菌引起弧菌病致对虾减产等，为了控制弧菌疾病，一些抗生素药物在水产养殖中被广泛使用，不仅造成环境中药物残留、细菌耐药性增加，还造成更多耐药株的出现。

同时国家相关政策对于抗生素的使用和监管也日渐严格。水产禁用的抗生素名录也越来越多。并且抗生素由于半衰期的存在，难以长久保持杀菌效率，对于底泥中躲藏的弧菌，如副溶血性弧菌，也常常无能为力，在养殖实践中，经常遇见抗生素使用后很快见效，弧菌大量减少，但是3-7天后，抗生素失效，弧菌数量恢复到使用前的水平。因此，养殖户的做法是，定时定量，每隔一段周期固定投加不同种类的抗生素控制弧菌数量，整个养殖流程抗生素不停用的做法，该做法给水体环境和生态系统都会带来难以预估的潜在风险。

益生菌具有改善水质、降低养殖水体的氨氮浓度、提高养殖对象的抗病性和抗逆性、提高养殖对象的产量等众多优点，现已成为抗生素类药物替代品的研究热点，以芽孢杆菌属为例，其可产生抗菌肽，其对弧菌等具有抑制作用，鉴于目前芽孢杆菌属类的微生物对弧菌等的抑制作用不能满足需求，部分研究人员在寻求以自然或人工诱变筛选等措施以寻求新的、满足需求的微生物。

发明内容

本发明的目的在于提供一株短小芽孢杆菌，它可以抑制水产养殖中弧菌的生长，取代了抗生素，解决了弧菌病害频繁发生的问题。

一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)FTBP1，保藏号为CCTCC M 2021410。

短小芽孢杆菌CCTCC M2021410在抑制弧菌生长中的应用，如在对虾养殖中的应用，可直接作为饲料使用，其可抑制的弧菌种类包括溶藻弧菌、坎氏弧菌、哈维弧菌、副溶血弧菌等。

优选，短小芽孢杆菌CCTCC M2021410在抑制弧菌生长用的菌剂、菌粉中的应用。

在偶然机会下，本发明人自广东湛江养殖池塘底泥发现一种菌株，并经过分离、纯化后得到该菌株，继而经诱变等措施得到该保藏的菌株，经生物学特性检测、16sDNA测序分析等手段，最终鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，命名为FTBP1，并在后续试验中发现其在抑制弧菌生长中效果显著。

本发明人针对该短小芽孢杆菌的具体应用方式进行了多重研究，如直接饲料应用、微生态制剂应用，制备成菌粉应用等，抑菌效果明显，当然也可根据需要将该短小芽孢杆菌与其他组分混合形成复合型制剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1、该短小芽孢杆菌适合长期使用，使用方式包括饲料、菌剂、菌粉等方式，可有效将弧菌控制在较低水平，适合推广应用。

保藏信息

本发明的一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)FTBP1，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏号为CCTCC M2021410，保藏日期为2021年4月19日。

附图说明

图1是本短小芽孢杆菌DNA提取电泳图；

图2是本短小芽孢杆菌PCR产物电泳图图；

图3是本短小芽孢杆菌的blast比对结果图；

图4是本短小芽孢杆菌的抑菌圈图；

图5是本短小芽孢杆菌的抑菌圈图；

图6是本短小芽孢杆菌抗菌肽提取液抑菌圈图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

第一、芽孢杆菌的分离培养

1)、分离步骤

将广东湛江养殖池塘捞取的底泥，使用稀释平板计数法，通过LB平板进行活菌计数，24h后，肉眼观察LB平板的菌落形态，进而挑选密度最大的白色单菌落进行镜检验证，确认为芽孢杆菌后，于超净台内划线保藏，待用。

2)、培养纯化

将筛选出的芽孢杆菌接种到培养基上，培养基组分：葡萄糖40g，酵母浸粉30g，氯化钙0.15g，磷酸二氢钾3g，磷酸氢二钾3g，氯化钠5g，碳酸钙5g，水1L，使用氢氧化钠调节pH值至7.0，再加入碳酸氢钠3g形成培养基，在转速为200rpm，温度为33℃的条件下培养48h，获得相关菌株。

3、诱变

将纯化的芽孢杆菌菌液进行活菌计数和稀释，稀释到10⁵CFU/mL的数量级，然后吸取100ul的稀释液涂布在LB平板上。之后将平板置于15瓦紫外线下，260nm波长范围，照射4min，再放入培养箱中进行35℃的培养，第二天镜检观察平板，选择形态最大、菌斑最大、形态最特殊的多个菌落进行培养，并进行抑菌圈实验同步验证其突变特性，本抑菌圈的实验与下方所记载的抑菌圈方法一致，之后对抑菌圈表现最好的菌株再次依上述紫外诱变、筛选、培养步骤进行，经10次诱变培养后得到抑菌圈表现最好的菌株，即该保藏的菌株。

第二、对上述诱变后的菌株进行鉴定

1)生理生化鉴定，通过购买的HBI芽孢杆菌生化鉴定条，按照规定步骤进行鉴定，如下表所示

表1生理生化反应结果

该短小芽孢杆菌的形态特征为：菌体为细杆状，两头呈方形，大小一般为0.8-1.2μm×1.5-2.0μm，革兰氏阳性。

2)、抗菌肽菌株DNA提取及PCR扩增16sDNA片段测序鉴定

2.1、试验步骤

2.11、实验目的：通过PCR手段对于目前分离出的菌株，使用16sDNA特异性标签序列进行体外扩增，并将PCR产物送样至生物公司进行测序，将测序结果进行blast比对，从而鉴别菌株的种属。

2.12、DNA提取

在灭菌后的1.5mL离心管内加入400uL无菌纯水，同时在超净工作台内从培养皿上挑落1满环的待测菌株，添加进向离心管中，将离心管放置于振荡器振荡混匀，插入浮漂中，放置于超声波仪中，40KHZ，600w功率，超声5分钟，取出再次震荡混匀，再次超声5分钟，合计超声3次，每次5分钟，之后将超声波破碎后的菌液放入冰箱作为DNA模板待用。

2.13、对于细胞破碎菌株的DNA提取

实验过程中，发现少部分菌株无论是超声波破碎还是高温加热使细胞变性，都难以有效的将细胞内的DNA释放出来，因此对于此类菌株，使用DNA提取试剂盒，将细菌的DNA提取出来，当作模板，再进行PCR扩增。在此过程中的使用的试剂盒为，上海生工，细菌基因组DNA快速抽提试剂盒(产品编号：B518225)标准操作步骤为：

2.131.取1ml过夜培养的细菌菌液，加入1.5ml离心管中，室温8,000rpm离心1min，弃上清，收集菌体。加入500μl Buffer Digestion，震荡混匀。65℃水浴2h至细胞完全裂解。

2.132.水浴过程中，每10分钟颠倒混匀一次，可促进样品裂解。混合液变澄清透明为裂解完全。如溶液未变澄清，说明样品，裂解不彻底，应适当延长水浴时间。

2.133.加入200μl Buffer PB，充分颠倒混匀，冰上放置5min。室温10,000rpm离心5min，将上清液(500-550μl)转移到新的1.5ml离心管中。

2.134.加入等体积的异丙醇，颠倒5-8次使之充分混匀，室温放置2-3min。室温10,000rpm离心5min，弃上清。加入1ml 75％乙醇，颠倒漂洗1-3min，10,000rpm离心2min，弃上清(两次)。

2.135.开盖室温倒置5-10min至残留的乙醇完全挥发。得到的DNA用50-100μl TEBuffer溶解。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。

2.14、PCR体系的建立及相关参数控制

PCR体系见表2，其中PCR过程参数设置如下：

1、94℃10分钟(增加DNA释放量)。

2、{94℃30s，55℃30s，72℃90s}×30个循环。

3、72℃延伸10分钟。

4、10℃保存。

表2、PCR体系

PCR产物使用1％琼脂糖进行凝胶电泳，凝胶过程中显色剂按照1uL/100mL进行添加，(上海生工，4s green显色剂)，将PCR产物2uL与1uL loading buffer混合点入琼脂糖凝胶电泳槽，电压设置为170V，时间20分钟。

2.15、测序数据的比对

将生工测序后发回的16s片段序列，核酸序列txt文件中的碱基序列拷贝出。同时登录登录NCBI基因数据库，进入Blast比对模式，选择核酸比对数据库，将测序的seq文件序列输入比对窗口，调整比对参数，选择序列相似度90％以上的菌株，作为鉴定的参照菌株。

2.16、结果

DNA提取电泳图及PCR产物电泳图如图1、图2所示，可以看出DNA提取的条带比较清晰、能够满足下一步PCR的实验要求。DNA提取之后还存在一些问题，因为PCR试剂盒要求的DNA模板浓度是10ng/uL，但是我们提取的DNA估计值在700ng/uL左右，原本DNA浓度的数值依靠核算分析仪进行检测，但是公司没有该设备，因此采取梯度稀释的办法通过实验进行摸索，分别稀释10倍、100倍、150倍和200倍。最后检测出稀释10倍的DNA模板浓度适合目前的PCR体系。

blast比对结果如图3所示，可以看出，该菌株的16s序列与多种Bacilus pumilus菌株达到96％的相似度，因此基本确定该菌种属于Bacilus pumilus，为短小芽孢杆菌，命名为FTBP1。

第三、菌株的抑菌测试

3.1、抑菌圈测试

3.11、菌株培养

将菌株使用配方64进行发酵液的培养和抑菌圈验证。(配方64成分表：葡萄糖40g，酵母浸粉30g，氯化钙0.15g，磷酸二氢钾3g，磷酸氢二钠3g，氯化钠5g，碳酸钙3g，水1L，使用氢氧化钠调节pH值至7.0，再加入碳酸氢钠3g)，按照配方64制备培养基，在超净工作台内，接两满环短小芽孢杆菌进入培养基，4层纱布封口，放入摇床内，200rpm，35℃，培养48h。

3.12使用抑菌圈验证菌株

抑菌圈实验使用广东分离的溶藻弧菌(2株)、哈维氏弧菌1株、坎氏弧菌1株4种弧菌作为指示菌。将4种弧菌的培养皿菌泥刮下来，加生理盐水稀释至7mL左右，充分震荡摇匀，稀释之后弧菌的浓度在103CFU/mL-104CFU/mL之间。分别吸取200uL的各种不同弧菌菌液，均匀涂布在在培养皿上。

将培养的短小芽孢杆菌单菌落接种，同步加入氯霉素做抗生素对照。本次抑菌圈使用氯霉素作为效价的评定指标，其中氯霉素含量99％的试剂如下，将氯霉素稀释到100ppm的水平，然后将其加入牛津杯进行抑菌圈的实验，氯霉素的标准品效价为1mg/997U，稀释后加入牛津杯中的氯霉素理论效价为50U。然后35℃进行培养和发酵，分别在24h和48h，进行抑菌圈的检测，如图4、图5所示。

3.13、试验结果

接种该短小芽孢杆菌的培养皿中抑菌圈变化如图4、图5所示，抑菌圈最大的是培养第48小时的短小芽孢杆菌。

经抑菌检测后得出，抑菌圈与最开始的原始状态出现了变化，整体来看是按照抑菌圈越来越大的趋势在继续。尤其是短小芽孢杆菌，向外部扩散的越来越大，从抑菌圈直径上，已经超过抗生素对照。这说明短小芽孢杆菌具有明显的抑菌能力。

3.2、短小芽孢杆菌的鉴别和抗菌肽验证

目的：鉴别短小芽孢杆菌的功能，并验证在不同基质条件下的产抗菌肽能力和活菌数变化。

3.21、实验设计：实验设定三种不同的基质来评价，第一种，上层水模型，选取玻璃缸养殖的卤虫水200mL装入500mL三角瓶。第二种，底泥模型，捞取之前基地虾池的底泥，添加20％的海水，然后按照200mL/瓶的量，将泥浆灌入三角瓶。第三种，饲料模型，按照5％的比例，在清澈海水中添加南美白对虾的饲料，混匀后灌装进三角瓶。之后将全部的三角瓶模型121℃灭菌20分钟，静置常温后，于超净工作台接种该短小芽孢杆菌，并分别在在24、48h进行活菌计数，同时在第48h后，进行抗菌肽的提取。

说明：上层水模型是作为环境改良剂的关键，底泥模型确保短小芽孢能够定植，长效，此外弧菌在底泥中密度最高。饲料模型主要是为可能的饲添用法打基础，毕竟弧菌大量爆发时，对虾体内是弧菌密度远高于水体环境，饲添是弧菌爆发期，保护养殖动物最有效率的方法。

3.22、短小芽孢杆菌抗菌肽的提取和检测

3.221、先将不同模型的短小芽孢杆菌培养液热灭活，121℃加热20min，灭活蛋白酶、沉淀杂蛋白并使抗菌肽完全从菌体释放到发酵液中。然后4000rpm离心，弃沉淀，将上清液用0.45的滤膜进行过滤，得到的滤液用来进行抗菌肽的提纯。

3.222、将上一步提取的滤液加入旋转蒸发仪，进行70-80℃、40转数的旋转蒸发，加入200mL上清液，浓缩至20mL左右(10倍)，加入等体积(20mL)的丙酮进行有机溶剂抽提3次，抽提时将有机溶剂和抗菌肽液体在摇床上，200rpm，3min，摇匀，便于彻底混合，之后静置5min，使有机相和水相完全分层，吸取有机相，混合三次的有机溶剂抽提液，送入通风橱中，水浴70度进行挥发，浓缩底部的抗菌肽沉淀后，再加入3mL生理盐水溶解，将溶解液进行抑菌圈的实验和高效液相检测。

抑菌圈实验使用广东分离的溶藻弧菌(2株)、哈维氏弧菌1株、坎氏弧菌1株(C、D、G、I)、副溶血弧菌5种弧菌作为指示菌。给长有这5种弧菌的板上的菌泥刮下来，加生理盐水稀释至7mL左右，充分震荡摇匀，稀释之后指示菌的浓度在104CFU/mL-105CFU/mL之间。分别吸取200uL的各种不同弧菌菌液，均匀涂布在在培养皿上，再放置牛津杯，分别向其中加入上述溶解液样品。上述溶解液需要先进行4000rpm，5min离心后，吸取上清液，在使用0.45μm的滤头过滤后再当作抑菌剂使用。

3.223、不同模型下三角瓶活菌计数及短小芽孢杆菌抗菌肽提取液的抑菌圈测试

抑菌圈的72h时间点实验图如图6所示，抑菌圈清晰明显，在饲料和底泥中，短小芽孢杆菌确实能产生抗菌肽。

实验中不同时间点6瓶发酵物的LB平板的活菌计数统计表如下：

表3、三角瓶培养物活菌计数结果

注释：单位CFU/mL。

可以看出，短小芽孢杆菌在卤虫养殖水和南美白对虾养殖底泥中(不额外添加任何营养)，能够生长到10⁷数量级，在5％饲料添加的水体中，可以生长到10⁸数量级，该生物量一方面说明，短小芽孢杆菌能够在池塘底部定植。并且如果作为饲添使用，其活菌数会再向上提高，达到10⁸水平，这说明，短小芽孢杆菌株菌也可以通过饲料作为营养源生长。为以后的饲添应用提供可行性。

3.224、高效液相检测抗菌肽浓度

使用0.22um滤膜进行过滤，同时使用甲醇作为流动相进行液相检测。在提取抗菌肽的过程中，将上述3.1中48h抑菌圈最大的短小芽孢杆菌以培养基64培养相同时间，并采用相同工艺进行抗菌肽提纯，之后将这个提纯液作为标准品来进行对比。

因为本次的液相不仅仅是定性分析，也涉及峰图截面积的对照比较，因此将高效液相的详细操作方法和节点控制、参数设置详细列出如下：

首先开机，选择方法(BOSHIDE-LC)，该方法设置时选择标准进样，进样量为5.0μL；控制流速为0.400mL/min，停止时间为30min；柱温为70℃停止时间与泵一致，为30min；MWD信号勾选A，样品220，带宽60，参比360，带宽100，停止时间与泵一致，为30min，所需的灯选择紫外灯，峰宽(响应时间)＞0.1min(2s)；自动平衡选择预运行。调平衡(先给阀门打开，流至管内无气泡；之后拧紧阀门，再让流动相流动30min)；流动相A为水：甲酸＝100:0.1；流动相B为异丙醇：乙腈：甲酸＝50:50:0.8，所用试剂为色谱级需要经0.45μm水相膜或者有机相膜过滤。设置泵(流速0.4mL/min，柱温70℃)，设置好之后，将所需要检测的样品按放在最左侧的一列，编号从前到后依次为0、1、2、3、4、5、6。打开泵，开始进样(每个样需要30min左右)所有样品检测结束后，进行数据分析。

3.225、短小芽孢杆菌抗菌肽提取液的抗菌肽高效液相检测结果

液相结果如下表所示。

表4、各样品高效液相色谱峰截面积比值

基本上各样品的主峰均在5-6分钟，其中3、4号饲料组的抗菌肽产量最高，平均值达到自制标准品含量的85％左右，其次底泥排在第二位，达到标准品的42％左右，上层水的抗菌肽产量较低约在10％左右。一般来说弧菌主要集中在池塘底泥，和养殖动物体表，肝胰脏。同时，这株短小芽孢杆菌也正适合在饲料和底泥中产抗菌肽较高。假设生产短小芽孢杆菌的菌粉为500亿，从实验数据可知，产抗菌肽达85％时生物量为2.67×10⁸(起效浓度)。换算成饲料添加量为0.5％。也就是说，短小芽孢杆菌500亿的菌粉，日常保健的添加量为0.5％，弧菌爆发时可增加到为1％或者2％。

结论，短小芽孢杆菌能够在表层养殖水、底泥和饲料中生长，这说明短小芽孢杆菌是依靠在环境中的有机质生长和产生抗菌肽抑制弧菌的，其生物量和抗菌肽浓度成正比，饲料中添加短小芽孢杆菌，抗菌肽浓度最高，底泥中抗菌肽含量第二，上层水含量最低。该实验为短小芽孢杆菌的底泥长期定植和抑制弧菌提供了用量依据，也为饲添应用提供添加量比例的数据支持。

第四、短小芽孢杆菌抑制弧菌的三角瓶验证

实验目的：构建底泥的三角瓶模型，和饲料粉的三角瓶模型，验证微生态菌剂对于弧菌的抑制作用。

4.1、短小芽孢杆菌微生态菌剂的前期制备

先在LB培养皿上将短小芽孢杆菌划线培养24h，待平板上长满菌落后，在菌落表面添加3mL生理盐水，然后使用玻璃涂布棒将菌落刮下，形成高密度菌液，再将刮取的菌液使用5mL移液器吸取到10mL离心管中待用。

4.2、短小芽孢杆菌抑制弧菌的实验设计

选取孵化卤虫的玻璃缸有机废水，按照200mL的装液量，灌入500mL的三角瓶，封口膜封口后，进行121摄氏度灭菌，(卤虫水三角瓶模型)，静置常温后待用。将实验室保留的5株弧菌(溶藻弧菌(C、D)、坎氏弧菌、哈维弧菌、副溶血弧菌)进行等比例混合，混合弧菌后按照10³浓度进行稀释再加入三角瓶模型，之后按照实验设计，如表5所示，添加上述微生态菌剂。

实验设定两种不同的基质来评价，第一种，饲料模型，按照10％的比例，在卤虫养殖水中添加南美白对虾的硬颗粒饲料粉，混匀后灌装进三角瓶。装液量为49％；第二种，底泥模型，捞取之前基地虾池的底泥，添加20％的海水，然后按照200mL/瓶的量，将泥浆灌入三角瓶。之后将全部的三角瓶模型121℃灭菌20分钟，静置常温后，于超净工作台接种10⁴数量级的混合弧菌，在第0h按照实验设计，如表5所示，添加弧菌、短小芽孢杆菌微生态制剂，添加结束后，将全部模型放入培养箱中，35℃，200rpm培养，并且分别在0、24、48h、72h、96h、120h使用TCBS平板检测弧菌数。同时在0、24、48h、72h、96h、120h使用LB平板检测弧菌和芽孢的数量对比变化。

表5、实验设计(弧菌浓度10⁴条件下)

4.21短小芽孢杆菌在三角瓶模型中的抑菌效果

TCBS平板在不同时间点的弧菌计数结果见表6。

表6、三角瓶模型弧菌活菌计数结果统计表单位(10²CFU/mL)

1-8号的三角瓶属于饲料模型，截至120h时间点，只有3号瓶弧菌变化明显，推测原因，弧菌在饲料粉提供充足营养，35℃，200rpm的条进下，能够进行快速繁殖，活菌数快速升高。直到120h，3号三角瓶活菌数下降。同时将3号三角瓶的水样吸取出来，不提纯，直接做抑菌圈实验，结果发现，3号三角瓶的水样吸取出来，经离心后即可产生微弱的抑菌圈，如图6所示，抗菌肽菌种确实是一直在用饲料蛋白质不断的合成抗菌肽，抗菌肽浓度也一直在累积，累积120h后，能测出来较小的抑菌圈，但是弧菌数量下降不明显，因为抗菌肽一边在杀弧菌，同时10％饲料粉的高营养条件，也在养弧菌，不是抗菌肽菌种没有明显效果，是杀灭弧菌的速度的没有新繁殖的速度快，因此其他几个三角瓶没有明显效果，这也提醒项目组。在水体富营养化严重的情况下，需要适量调整使用浓度，和使用频率。

同时15、16号的底泥模型也出现明显的弧菌数下降，在120h的情况下，在底泥中，抑菌率达到75％左右的水平，从而，达到在源头上抑制弧菌数量的目的。

不同时间点使用LB平板的活菌计数结果，如表7所示：

表7、三角瓶模型弧菌数结果统计表单位(10³CFU/mL)

综上：对于1-8号瓶的饲料模型，LB平板，弧菌始终处于优势菌。

对于9-16号瓶的底泥模型，则清楚的展示了短小芽孢杆菌的代替弧菌成为优势菌的过程。0-24h阶段，全部三角瓶都是弧菌优势菌。第48h，15、16号瓶可以发现大量芽孢。第72h，11、12号瓶开始出现芽孢，13、14、15、16号瓶的芽孢开始变为优势菌，同时弧菌始终伴随生长。至120h，芽孢完全成为优势菌，平板弧菌很少出现。这说明短小芽孢杆菌能够在底泥中生长、产生抗菌肽、并且抑制弧菌。结合上述实验，可以得出在最开始的48-72h里面，短小芽孢杆菌是缓慢产生抗菌肽的，在自然水体或者底泥中，抗菌肽是缓慢合成和累积的，直到累积的抗菌肽剂量达到抑制弧菌的MIC，此时TCBS的平板上，弧菌才会减少，这个累积抗菌肽的过程可能需要48-72h的时间，同时也验证出，只要有底泥、残饵存在，抗菌肽就能不断累积，最后产生抑菌的效果。

综上：短小芽孢杆菌能够在底泥模型中抑制弧菌，进而达到取代弧菌成为优势菌的目的，初始的添加剂量10⁶CFU/mL能在120h将弧菌的抑菌率达到75％的水平。因此无论是底泥还是饲料中，抗菌肽菌株都能抑制弧菌的生长，底泥中效果更好，饲料中效果一般。因为这一批次的实验三角瓶，都是放在35℃，180rpm的条件下培养的，因此饲料模型含有大量营养，摇瓶环境也适合弧菌繁殖，所以饲料模型抑菌效果没能打到预期。同时也证明，抗菌肽菌株利用饲料，逐渐累积产生抗菌肽的思路是正确的。

第五、含短小芽孢杆菌的菌粉抑制弧菌的三角瓶验证

实验目的：构建卤虫水的三角瓶模型，验证含短小芽孢杆菌的混合菌粉对弧菌的抑制作用。

5.1、菌粉的制备

发酵罐培养基(g/L)：麸皮20g，豆粕10g，葡萄糖5g，酵母膏5g，氯化钠5g，K₂HPO₄3g，KH₂PO₄ 3g，MnSO₄ 0.3g，调pH为7.0。

培养条件：200L发酵罐装液120L,接种量约4％，发酵温度36℃，转速100rpm，发酵至营养菌体转为芽孢，结束发酵。

芽孢诱导方法：发酵至48h对发酵液进行镜检，若无芽孢产生则补加0.3g/L的MnSO₄溶液进行诱导。

烘干法制粉：离心菌液获得菌泥，将菌泥与玉米芯粉混合均匀(根据离心菌泥的湿度确定菌泥与玉米芯粉的比例，使混合后菌粉湿度在45％左右)，以38℃的热风进行风干处理，至湿度达到10％左右结束风干，经粉碎处理后取样进行活菌计数及含水量测定，如下表所示：

表8、菌粉活菌数

5.2、抑菌效果实验

选取孵化卤虫的玻璃缸有机废水，按照200mL的装液量，灌入500mL的三角瓶，封口膜封口后，进行121℃灭菌，卤虫水三角瓶模型，静置常温后待用。将实验室保留的5株弧菌(溶藻弧菌(C、D)、坎氏弧菌、哈维弧菌、副溶血弧菌)进行等比例混合，混合弧菌后按照10⁴浓度进行稀释再加入三角瓶模型。之后按照实验设计如表9所示，添加菌粉。

表9、三角瓶活卤虫模型实验设计(弧菌浓度10⁴条件下)

其中，3、4号瓶为添加短小芽孢杆菌的菌粉。

0、24、48h、72h、96h使用TCBS平板检测弧菌数，如表10所示。

表10、三角瓶模型弧菌活菌计数结果统计表单位(10³CFU/mL)

综上：在第24h，弧菌爆发，无法阻挡，说明弧菌一旦达到10⁴数量级，抗菌肽芽孢难以控制其爆发，但是在随后的24-96小时时间段中，与空白对照相比，3/4号三角瓶均能抑菌达90％以上，可将弧菌控制在低水平。

0、24、48h、72h、96h使用LB平板检测弧菌数，如表11所示。

表11、三角瓶模型弧菌数结果统计表单位(10³CFU/mL)

综上：实验开始的0h，芽孢和弧菌还都能从平板上辨认出，但是到24h，弧菌爆发，弧菌成为优势菌完全压制住芽孢，之后在48h，72h的3/4号瓶，还能看到弧菌和芽孢在互相博弈的过程，但是芽孢始终没能拿到优势地位。本次实验，芽孢依然没有能够快速拿到优势菌的地位，LB平板，记录了弧菌和芽孢的互相竞争过程，直到96h，3/4号三角瓶，短小芽孢杆菌取得优势菌的地位，同时弧菌数量同步快速减少。

结论：短小芽孢4.8×10⁶CFU/mL能够在三角瓶模型中抑制弧菌10⁴CFU/mL的弧菌，96h的连续试验中，最后可以达到90％以上的抑菌率，同时短小芽孢杆菌自身维持在10⁵数量级。

上述抑菌率的计算方式：抑菌率＝(24h时间点弧菌数-最后1个时间点的弧菌数)÷24h时间点弧菌数×100％。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 宁波浮田生物技术有限公司

<120> 一种短小芽孢杆菌及应用

<141> 2021-05-12

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1201

<212> DNA

<213> Bacillus pumilus FTBP1

<400> 1

cgggagtccg gggtctaata atgcagtcga gcggacagaa gggagcttgc tcccggatgt 60

tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg 120

gaaaccggag ctaataccgg atagttcctt gaaccgcatg gttcaaggat gaaagacggt 180

ttcggctgtc acttacagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtggg gtaatggctc 240

accaaggcga cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca 300

cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga 360

cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa 420

gaacaagtgc gagagtaact gctcgcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 480

actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc 540

gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga 600

gggtcattgg aaactgggaa acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc 660

ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa 720

ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780

ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg 840

cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg 900

ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag 960

gttcttggac atcctctgac aaccctagag atagggcttt cccttcggga caaagtgaca 1020

agtggttgca tggctggtcg tcagctcgtt gtcggtgaga tgttgggttt aagtccccgc 1080

caacgaagcg caactcttgg attcttaagc tggccaagca atcagttcgg caactcctaa 1140

aggtgacttg cggtgaccaa gccgcagcaa gtggggagtt gaacgttcaa gtctcactcc 1200

c 1201

Claims (2)

1.一种短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）FTBP1，保藏号为 CCTCC M 2021410。

2.短小芽孢杆菌 CCTCC M2021410 在制备抑制弧菌生长的菌剂、菌粉中的应用。

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