CN106442453A - 一种快速定量测定芽孢浓度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种快速定量测定芽孢浓度的方法，包括以下步骤：(1)待测样品的前处理：将待测芽孢样品离心后收集菌体，然后将菌体重悬到缓冲液中；(2)重悬液中DPA的释放：采用诱导芽孢萌发的方法促进重悬液中芽孢体内DPA的释放，所述诱导芽孢萌发的方法为物理方法或添加化学诱导剂，将诱导芽孢萌发后的重悬液进行离心，收集上清液；(3)DPA的荧光检测：将上清液稀释后与EuCl3和CYDTA充分混合均匀，采用荧光分光光度计测定上述混合溶液的荧光强度；(4)标准曲线的制作与活菌总数的换算。本发明提供的方法相对传统平板计数法更加简洁，精准度高，重现性好。

Description

一种快速定量测定芽孢浓度的方法
技术领域
本发明具体涉及一种快速定量检测样品中芽孢含量的方法，属于微生物检测和发酵工程技术领域。
背景技术
芽孢杆菌能够产生具有很强抗逆性的内生孢子，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多的化学药物都有很强的抗性。一方面，芽孢杆菌属是一种微生物添加剂常用的菌株来源，具有稳定性高、代谢活性强、生物安全性高等优点，作为人药或兽药以及饲料添加剂有广泛应用。益生芽孢杆菌在制剂中都是以内生孢子的形式存在，孢子进入肠道后，在肠道内萌发增殖，起到调节肠道菌群平衡，拮抗病原菌，提高机体免疫力等作用；作为饲料添加剂，能够促进畜禽生长性能，提高饲料效率，降低幼龄动物死亡率和减少或者替代抗生素的使用等。在芽孢类微生态制剂的生产和贮存过程中，评价产品中的活芽孢数量是保证和评价产品质量的一项重要指标。另一方面，芽孢的耐热性也存在有害的一面。对于热法灭菌食品而言，芽孢非常容易造成保存的失败，一般加热法不能杀死芽孢，在贮藏期容易萌发繁殖，引起食品腐败变质，因此芽孢通常也是反映食品灭菌程度的一种指示菌。
对于活芽孢数量的检测目前大多采用的还是传统的平板计数法，此法工作量较大，尤其存在培养周期长，人为误差较大的情况，难以实现准确和快速实时检测。针对芽孢杆菌的细胞特点，目前已有其他替代技术应用芽孢的特异性快速检测，主要包括PCR法、直接外荧光滤过技术、荧光检测以及毛细管区带电泳等方法，这些手段检测速度大大提高，并具有一定的灵敏性，但通用性较差，必须辅助一些昂贵的仪器及其配套试剂，或者操作过程相对复杂，对从业人员素质要求较高，推广应用难度较大。
发明内容
本发明提供了一种从发酵液或者固态样品中快速定量检测芽孢数量方法，该方法相对传统平板计数法更加简洁，精准度高，重现性好。
实现本发明上述目的所采用的技术方案为：
一种快速定量测定芽孢浓度的方法，包括以下步骤：(1)待测样品的前处理：将待测芽孢样品用缓冲液进行稀释，混合均匀后将芽孢充分悬浮到缓冲液中，静置后从上层悬浮液中定体积量取芽孢悬浮液，并将悬浮液离心后收集菌体，然后将菌体重悬到缓冲液中；
(2)重悬液中DPA的释放：采用诱导芽孢萌发的方法促进重悬液中芽孢体内DPA的释放，所述诱导芽孢萌发的方法为物理方法或添加化学诱导剂，将诱导芽孢萌发后的重悬液进行离心，收集上清液；
(3)DPA的荧光检测：将上清液稀释后与EuCl3和CYDTA充分混合均匀，空白对照为缓冲液与EuCl3和CYDTA的混合液，采用荧光分光光度计测定上述混合溶液的荧光强度，测定过程中激发波长范围260～280nm，发射波长范围610～630nm；
(4)标准曲线的制作与活菌总数的换算：将已知细胞浓度的芽孢悬浮液经过缓冲液稀释后，分别测定稀释已知细胞浓度对应的DPA荧光强度值，以芽孢的活菌浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，进行线性回归，得标准曲线方程；然后根据待测样品的荧光强度测量结果，采用回归方程换算成对应的活芽孢浓度。
步骤(2)中物理方法具体为灭菌、微波处理或超声破碎，所述化学诱导剂具体为肌苷、L-丙氨酸、溶菌酶或吡啶二羧酸钙。
所述诱导芽孢萌发的方法具体为高温高压灭菌法，将重悬液置于密闭容器中，然后置于高压灭菌锅内在不低于100℃的温度下处理5～10分钟。
步骤(3)中稀释后的上清液与EuCl3和CYDTA三者的体积比为1：4.5：4.5。
步骤(3)中检测条件参数为：扫描速度3000nm/min，EX狭缝10.0nm，EM狭缝5.0nm，光电倍增管电压700V，响应0.08s。
步骤(1)～(4)中所述的缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
在本申请中，由于2，6-吡啶二羧酸(DPA)是芽孢特有的成分，自然界中不存在游离的DPA；DPA耐热性强，它占芽孢干重的5％～10％，而且特定的芽孢其DPA含量是固定不变的。DPA能够与稀土离子如铽离子(Tb3+)、铕离子(Eu3+)、钐离子(Sm3+)、镝离子(Dy3+)生成具有很强荧光强度的稀土配合物，利用配合物的荧光强度就能实现DPA的灵敏检测。因此本申请中提出了通过检测DPA的方法来检测芽孢浓度，而想要通过检测DPA的方法来检测芽孢，就需要将芽孢体内的DPA释放到溶液中。芽孢体内的DPA能被外界环境如高压、微波或者化学因素如肌苷、L-丙氨酸、溶菌酶、吡啶二羧酸钙等物质诱导萌发而释放到溶液中，因此本申请中创造条件诱导芽孢快速萌发，以实现DPA的快速完全释放，溶液中的DPA水平实际上就能实现活芽孢总数的特异性测定。因此与现有技术相比，本发明所提供的技术方案具有以下优点：1、本发明方法针对含有芽孢的发酵液或者固体芽孢制品实现了活体芽孢的快速测定，并亦可采用多孔板实现对活芽孢浓度的高通量定量检测，方法特异性强。2、本申请所提供的检测方法对芽孢浓度的检测限为102CFU/mL或者102CFU/g，检测灵敏度高，能够满足芽孢类活菌制剂的发酵生产监控和终端产品的定量检测，亦可用于食品卫生的定性定量检测。
附图说明
图1为不同络合物对荧光强度的影响及激发波长荧光图谱；
图2为荧光体系激发波长荧光图谱；
图3为不同温度时间处理对芽孢DPA的释放的影响；
图4为芽孢不同OD值与释放的DPA荧光强度关系曲线；
图5为芽孢CFU/mL浓度值与释放的DPA荧光强度关系曲线；
图6为荧光体系测定DPA的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
本实施例中首先确定了不同络合物对荧光强度的影响，并确定了最佳激发波长的范围，具体方法如下：首先准确称取0.16712g DPA纯品，用Tris-HCl缓冲液(50mM，pH8.0；下同)定容至100mL，配制成10mM的DPA母液。
选用五种不同的络合物来螯合稀土离子Eu3+用于DPA的荧光增强检测，即是乙二胺四乙酸(EDTA)，乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)，次胺基三乙酸(NTA)，N-羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)，环己二胺四乙酸(CYDTA)。取400μLDPA(100μM)分别与1.8mLEuCl3(2mM)和1.8mL不同络合物(2mM)溶液(共4mL反应体系)充分混合均匀，在270nm的激发波长下，扫描500～700nm范围，其中DPA与EuCl3和CYDTA的混合液在617nm左右荧光强度达到最大值，检测结果如图1所示。故确定对于DPA和Eu3+的荧光检测体系采用的络合物为环己二胺四乙酸(CYDTA)。
然后对DPA与EuCl3和CYDTA的混合体系进行扫描条件选择，确定激发与发射波长。在250～290nm范围的激发波长下，扫描500～700nm范围，随激发波长改变，发射图谱中的峰位置几乎没有位移，其波长范围在619～620nm，其中激发波长为270nm时，荧光强度达最大峰值。用619nm，620nm重新扫描获得激发图谱，最终确定激发波长和发射波长分别为276nm和619nm，测量结果如图2所示。故确定其激发波长范围260～280nm，发射波长范围610～630nm。
扫描条件的参数设定为：扫描速度3000nm/min；EX狭缝10.0nm；EM狭缝5.0nm；光电倍增管电压700V；响应0.08s。
实施例1
本实施例中针对芽孢样品进行检测，具体的步骤如下：(1)按照常规方法称取芽孢样品，并将芽孢样品(标准浓度芽孢液、发酵液或者固态的芽孢微生态制品)用Tris-HCl(50mM，pH 8.0，下同)缓冲液进行10倍稀释，混合均匀将芽孢充分悬浮到缓冲液中，静置3-5分钟待混合溶液中可能存在的不溶性杂质颗粒沉降，从上层均匀的悬浮液中量取一定芽孢悬液6000rpm离心10min，收集菌体并用无菌水洗涤两次后重悬到等体积Tris-HCl中。
(2)采用诱导芽孢萌发的方法促进重悬液中芽孢体内DPA的释放，所述诱导芽孢萌发的方法为物理方法或添加化学诱导剂。所述物理方法具体为灭菌、微波处理或超声破碎等，所述化学诱导剂具体为肌苷、L-丙氨酸、溶菌酶或吡啶二羧酸钙等芽孢类的各种萌发剂。在本实施例中，优选采用高温高压灭菌法，具体方法为：取一定稀释浓度的芽孢悬液置于密闭容器中(防止液体溢出或者蒸发引起体积变化，干扰结果测底)，分别采用不同温度不同时间进行处理，即100℃15min、100℃30min、121℃5min、121℃10min、121℃20min、121℃40min。待冷却后，6000rpm离心10min，分别取上清进行荧光检测。经过结果对比后，本实施中最终采用灭菌锅中121℃处理5分钟的参数，在此参数下样品中的DPA即可完全释放，处理强度进一步增加体系荧光强度保持不变，如图3所示。
确定了最佳的诱导芽孢萌发参数后，用Tris-HCl对高浓度的芽孢悬液进行稀释，使OD600nm值分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8，通过灭菌锅中121℃处理5-10min使DPA完全释放，将诱导芽孢萌发后的重悬液进行离心，收集上清液。
(3)将上清液稀释后与EuCl3和CYDTA充分混合均匀，空白对照为缓冲液与EuCl3和CYDTA的混合液，采用荧光分光光度计测定上述混合溶液的荧光强度。根据检测结果做出OD600nm与DPA荧光强度的关系曲线，如图4所示，从图4中可以看出其线性良好，相关系数R2为0.998。
以OD600nm为1.0左右的芽孢Tris-HCl悬液为基础，采用普通的平板计数法确定初始活菌浓度(CFU/mL)，再分别进行2倍、10倍、20倍、100倍、200倍、1000倍、10000倍稀释，分别对稀释的芽孢悬液灭菌锅中121℃处理5～10min取上清进行DPA荧光检测，作活菌浓度与DPA荧光强度的关系曲线，如图5所示，从图5中可以看出其线性良好，相关系数R2为0.999。检测限为102CFU/mL。
(4)用Tris-HCl缓冲液梯度稀释10mM的DPA母液，使其浓度分布在0.1nM-1000nM，分别测定荧光强度，以DPA浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制DPA的标准曲线，如图6所示。将本实施例中的检测结果比对标准曲线定量换算成活菌浓度，即可算得待测样品中的活菌浓度。同时，采用普通的平板稀释法进行平板活细胞计数，确定其初始平板活菌浓度(CFU/mL)，与标准曲线计算的活菌浓度进行比较无显著差别，从而可以通过检测发酵液样品中DPA含量间接反映芽孢浓度。两种不同方法测试了两种不同的芽孢杆菌的芽孢活菌浓度，检测结果如下表：
检测方法 地衣芽孢杆菌发酵72h芽孢浓度 枯草芽孢杆菌发酵72h芽孢浓度
平板计数的常规方法 3.0×109CFU/g 6.0×109CFU/g
本发明方法 4.6×109CFU/g 6.6×109CFU/g
从上表中可以看出本发明的荧光检测方法比常规方法略高，但已能与常规方法结果基本保持一致。
实施例2
本实施例中针对某两种药用含芽孢的固态微生态制剂胶囊样品进行检测，具体的步骤如下：(1)将某两种药用含芽孢的固态微生态制剂胶囊样品溶解后用Tris-HCl(50mM，pH 8.0，下同)缓冲液进行充分稀释，混合均匀将芽孢充分悬浮到缓冲液中，静置3-5分钟待混合溶液中可能存在的不溶性杂质颗粒沉降，从上层均匀的悬浮液中量取一定芽孢悬液6000rpm离心10min，收集菌体并用无菌水洗涤两次后重悬到等体积Tris-HCl中。
(2)、用密闭容器装一定量重悬液并置于灭菌锅121℃处理5-10min，待冷却后，离心取上清。
(3)将上清液稀释后与EuCl3和CYDTA充分混合均匀，空白对照为缓冲液与EuCl3和CYDTA的混合液，采用荧光分光光度计测定上述混合溶液的荧光强度。
(4)比对相应的标准曲线定量换算成活菌浓度。同时，采用普通的平板稀释法进行平板活细胞计数，确定其初始平板活菌浓度(CFU/g)，将荧光计算结果与平板计数结果和产品包装上标识结果进行对照，检测结果如下表：
检测方法 某药用含蜡样芽孢杆菌微生态粉剂 某药用含枯草芽孢杆菌微生态粉剂
平板计数的常规方法 2.3×108CFU/g 6.7×107CFU/g
本发明方法 8.1×108CFU/g 2.9×108CFU/g
药品标识浓度 8.0×108CFU/g 2.0×108CFU/g
本发明荧光检测结果比较接近药品标识浓度，平板计数结果略低。从上表看本发明方法对于固态芽孢制品亦有较高的准确度。

Claims (6)

1.一种快速定量测定芽孢浓度的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)待测样品的前处理：将待测芽孢样品用缓冲液进行稀释，混合均匀后将芽孢充分悬浮到缓冲液中，静置后从上层悬浮液中定体积量取芽孢悬浮液，并将悬浮液离心后收集菌体，然后将菌体重悬到缓冲液中；
(2)重悬液中DPA的释放：采用诱导芽孢萌发的方法促进重悬液中芽孢体内DPA的释放，所述诱导芽孢萌发的方法为物理方法或添加化学诱导剂，将诱导芽孢萌发后的重悬液进行离心，收集上清液；
(3)DPA的荧光检测：将上清液稀释后与EuCl3和CYDTA充分混合均匀，空白对照为缓冲液与EuCl3和CYDTA的混合液，采用荧光分光光度计测定上述混合溶液的荧光强度，测定过程中激发波长范围260～280nm，发射波长范围610～630nm；
(4)标准曲线的制作与活菌总数的换算：将已知细胞浓度的芽孢悬浮液经过缓冲液稀释后，分别测定稀释已知细胞浓度对应的DPA荧光强度值，以芽孢的活菌浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，进行线性回归，得标准曲线方程；然后根据待测样品的荧光强度测量结果，采用回归方程换算成对应的活芽孢浓度。
2.根据权利要求1中所述的快速定量测定芽孢浓度的方法，其特征在于：步骤(2)中物理方法具体为高温高压灭菌、微波处理或超声破碎，所述化学诱导剂具体为肌苷、L-丙氨酸、溶菌酶或吡啶二羧酸钙。
3.根据权利要求2中所述的快速定量测定芽孢浓度的方法，其特征在于：所述诱导芽孢萌发的方法具体为高温高压灭菌法，将重悬液置于密闭容器中，然后置于高压灭菌锅内在不低于100℃的温度下处理5～10分钟。
4.根据权利要求1中所述的快速定量测定芽孢浓度的方法，其特征在于：步骤(3)中稀释后的上清液与EuCl3和CYDTA三者的体积比为1：4.5：4.5。
5.根据权利要求1中所述的快速定量测定芽孢浓度的方法，其特征在于：步骤(3)中检测条件参数为：扫描速度3000nm/min，EX狭缝10.0nm，EM狭缝5.0nm，光电倍增管电压700V，响应0.08s。
6.根据权利要求1中所述的快速定量测定芽孢浓度的方法，其特征在于：步骤(1)～(4)中所述的缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
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