CN104950094A - 一种土壤四环素类抗生素污染的诊断方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种土壤四环素类抗生素污染的诊断方法，包括：将植物种子放置到一组含有抗生素浓度呈梯度分布的土壤中培养，培养3天后检测植物种子的根系长度，计算根系长度的平均值；建立土壤中抗生素浓度与所述平均值之间的关系曲线；对含有抗生素的待测土壤进行预处理，将植物种子放置到待测土壤中培养，培养3天后，检测植物种子的根系长度，根据所述关系曲线计算得到待测土壤中抗生素的浓度。所述植物种子为早熟8号，所述土壤为青紫泥，所述抗生素为土霉素和金霉素，所述土壤抗生素浓度梯度范围为0～5mg·kg^-1。本发明能够反映待测样品中抗生素的浓度，其简单、快速、成本低廉的特点克服了传统抗生素检测方法的局限性。

Description

一种土壤四环素类抗生素污染的诊断方法

技术领域

本发明属于污染环境修复技术领域，尤其涉及一种土壤四环素类抗生素污染的诊断方法。

背景技术

抗生素被广泛用于人类、畜禽业及水产养殖中各种疾病的防治。但绝大部分抗生素不能完全被机体吸收，以原形或者代谢物形式经由病人和畜禽的粪、尿排入环境，经不同途径对畜类食品、禽类食品、水产品、水体和土壤的污染，进而通过食物链危害人类健康。

中国是世界上滥用抗生素最为严重的国家之一，抗生素一方面可以导致器官的损伤，另一方面可以引起细菌的耐药性增强，形成超级细菌，使人类无药可医，我国每年有8万人死于滥用抗生素。

在众多的抗生素中，四环素类抗生素是在世界范围内应用最为广泛的抗生素。四环素类抗生素是由放线菌产生的一类广谱抗生素，包括金霉素、土霉素、四环素及半合成衍生物甲烯土霉素、强力霉素、二甲胺基四环素等，其结构均含并四苯基本骨架。近年来，四环素类抗生素的使用呈上升势头，导致其药物残留问题日趋严重，排放到环境中的药物及其潜在的影响也引起了越来越多的科学家的关注。

然而目前对抗生素的生态毒性的研究较少，可利用的生态毒性效应数据也较少。土壤是抗生素的归宿地，然而我国土壤中抗生素的生态安全指标阈值尚不明确。因此控制和检测抗生素残留，研究抗生素污染的生态毒性效应是非常必要的。

欧盟规定的环境中药物安全的限量值为100μg·L^-1。目前，抗生素残留的检测方法主要包括高效液相色谱法、色谱/质谱联用测定法等，大多数的检测方法具有一定可靠性和较好的灵敏度，但是这些方法也存在一定的 局限性，如费时，操作繁琐，需要昂贵的仪器，另外还会受到仪器检测限的限制；还有一些快速的检测方法，如微生物抑制法、酶联免疫法等，这些方法对实验条件要求比较高，试剂容易受到污染；而且这些传统的检测方法只能定量计算抗生素的浓度，而无法评估抗生素的生物毒性。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种简便、快速、准确、高效以及廉价的四环素类抗生素污染的诊断方法。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种土壤四环素类抗生素污染的诊断方法，包括以下步骤：

(1)将植物种子放置到一组含有抗生素浓度呈梯度分布的土壤中培养，培养3天后检测植物种子的根系长度，计算根系长度的平均值；

(2)建立土壤中抗生素浓度与所述平均值之间的关系曲线；

(3)对含有抗生素的待测土壤进行预处理，将植物种子放置到待测土壤中培养，经过与步骤(1)相同的培养时间后，检测植物种子的根系长度，根据所述关系曲线计算得到待测土壤中抗生素的浓度。

本发明对土壤中抗生素浓度与所述植物种子发芽后的根系长度的平均值之间建立关系曲线，再根据得到的关系曲线计算得到待测土壤中抗生素的浓度，方法简单、快速且廉价。

作为优选，所述植物种子为白菜种子，品种为早熟8号。

作为优选，本发明中所述抗生素为土霉素和金霉素，土霉素和金霉素属于四环素类抗生素，应用范围广，具有代表性，使本发明得到的关系曲线具有更广的使用范围。

本发明选取土壤中抗生素范围为0mg·kg^-1～5mg·kg^-1。采用线性回归方程拟合建立关系曲线。

作为优选，植物种子在所述土壤中培养3天后，所述的关系曲线为：

y₄＝-0.162x+3.16，R²＝0.831，0≤y₄≤5；

y₅＝-0.251x+3.29，R²＝0.975，0≤y₅≤5；

式中，y₄为土壤中土霉素的浓度，单位为mg·kg^-1[mg(土霉素)·kg^-1 (土壤)]；y₅为土壤中金霉素的浓度，单位为mg·kg^-1[mg(金霉素)·kg^-1(土壤)]；x为根系长度，单位为cm·plant^-1。

从上述关系曲线可以看出土壤中抗生素浓度与植物种子根系长度的平均值之间有显著的线性回归关系，其线性回归的相关系数最高可达98％，说明在土壤抗生素浓度为0～5mg·kg^-1范围内，植物种子的根系长度指标可以指示土壤中土霉素和金霉素的浓度。

在步骤(1)和步骤(3)中，在培养之前，植物种子需用0.3％(质量分数)的高锰酸钾溶液消毒30分钟。

所述植物种子的培养条件为：25℃的恒温培养箱内，置于暗处培养。

作为优选，步骤(1)中，所述土壤的类型为青紫泥。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明采用植物种子发芽后的根系长度检测抗生素，确定了抗生素浓度与植物种子根系长度之间的剂量-效应关系，不仅能够间接反映待测样品中抗生素的浓度，还能够初步实现对待测样品中抗生素生物毒性的评估，其简单、快速、成本低廉的特点克服了传统抗生素检测方法的局限性。

附图说明

图1为实施例1水溶液中四环素对白菜种子根平均长度的影响；

图2为实施例1水溶液中土霉素对白菜种子根平均长度的影响；

图3为实施例1水溶液中金霉素对白菜种子根平均长度的影响；

图4为实施例2土壤中四环素对白菜种子根平均长度的影响；

图5为实施例2土壤中土霉素对白菜种子根平均长度的影响；

图6为实施例2土壤中金霉素对白菜种子根平均长度的影响。

具体实施方式

一、四环素类抗生素对种子发芽根伸长的毒性检测方法建立

1、植物种子发芽根系长度的测定

将早熟8号白菜种子用0.3％用高锰酸钾溶液消毒30min，用蒸馏水洗净后挑选均一、饱满的种子置于铺有滤纸的培养皿(直径9cm)中，每个 培养皿放置30粒种子。重复3次。

放置种子时，保持种子胚根末端和生长方向呈直线。

分别配制浓度为0mg·L^-1、0.025mg·L^-1、0.05mg·L^-1、0.1mg·L^-1、0.25mg·L^-1、0.5mg·L^-1、1mg·L^-1、2.5mg·L^-1、5mg·L^-1、10mg·L^-1、15mg·L^-1、20mg·L^-1、25mg·L^-1、30mg·L^-1、35mg·L^-1、40mg·L^-1的四环素和土霉素溶液，将配制的溶液均匀的加入到培养皿中，每皿3mL，以蒸馏水作为对照(CK)，置于25℃恒温培养箱中，暗处培养。

每日采用称重法加水以保持滤纸湿润。试验处理2d后，进行根系长度的测定，计算相同浓度的培养皿中根系长度的平均值。

试验结果如图1、图2和图3所示：经抗生素处理2d后，低浓度的四环素和土霉素刺激了白菜种子根的伸长，而高浓度的四环素和土霉素则是抑制了根的伸长，可见，抗生素影响了根长的生长，根长对四环素类抗生素的作用较为敏感。

当抗生素浓度为40mg·L^-1时根伸长受到抑制的程度为金霉素>土霉素>四环素，说明白菜根长对于金霉素和土霉素的污染更为敏感。

2、抗生素浓度与植物种子根系长度的相关性和回归分析

基于上述的根长试验，对处理抗生素浓度与根长进行相关性和回归分析，结果如表1所示：在四环素、土霉素和金霉素的浓度在0.25mg·L^-1～40mg·L^-1范围内，添加的抗生素浓度和根长有较高的线性回归关系，其线性回归的相关系数最高可达93％，说明在0.25mg·L^-1～40mg·L^-1的浓度范围内，根系长度可以作为诊断指示抗生素的污染的指标之一。

表1外源添加抗生素浓度和白菜种苗根长的回归分析

注：T代表四环素处理，O代表土霉素处理，C代表金霉素处理

二、土壤中四环素类抗生素对种子发芽根伸长的毒性检测方法建立

1、土壤中白菜种子发芽后主根长度的测定

供试土壤类型为青紫泥(属于水稻土土类)。青紫泥分别采自浙江省嘉兴农科院试验田的表层土壤(0～30cm)。有效P为23.7mg·kg^-1，有效K为265mg·kg^-1，碱解氮146.0mg·kg^-1，pH为6.21。土样在试验前经风干、混匀、过5mm土筛。供试白菜品种早熟8号(浙江省农科院蔬菜研究所)。试验前种子用0.3％高猛酸钾消毒30min，然后用去离子冲洗3次待用。

土壤试验方法采用保湿培养进行试验，在洁净烘干的直径9cm培养皿中平铺一层滤纸，加入约0.5cm厚、过5mm土筛的土壤(每皿约60g)，加入16mL含一定含量抗生素的去离子水(预备试验表明，加入16mL去离子水使土壤含水量比较适宜种子萌发)，使土壤抗生素浓度分别为0，1，2，3，4，5mg·kg^-1。平衡2h后，用镊子将预处理后的种子均匀放入培养皿，保持种子胚根末端与生长方向呈垂直，每皿放置25颗种子。重复3次。盖好培养皿，将其放置在25℃培养箱，避光培养，期间必要时添加去离子水，保持土壤湿润。培养3d后，观察根长。

试验结果如图4、图5、图6所示：在土壤抗生素浓度为0～5mg·kg^-1范围内，不同浓度四环素没有导致白菜种子根生长受到了抑制，而土霉素和金霉素则显著地抑制了白菜种子根的伸长，都随着抗生素浓度的增加而抑制程度增加，且抑制程度为金霉素>土霉素。说明青紫泥土壤中的白菜根长对抗生素的敏感性与土壤溶液中的一致。

2、土壤中抗生素浓度与白菜根长的相关性和回归分析

基于上述的土壤白菜种子发芽试验，对处理抗生素浓度与根长指标进行回归分析，结果如表2所示：在土壤抗生素浓度为0～5mg·kg^-1范围内，土壤中四环素的浓度和种子根长没有显著的线性关系，而土壤中的土霉素和金霉素浓度和白菜种子根长指标有较高的线性回归关系，其相关系数最高可达到98％，说明在较低的浓度0～5mg·kg^-1范围内，白菜种子根长指标可以作为诊断土霉素和金霉素的污染的指标之一，而对于四环素可能只能进行更高浓度的诊断。

表2土壤外源添加抗生素浓度和白菜根长的回归分析

注：T代表四环素处理，O代表土霉素处理，C代表金霉素处理。

Claims (8)

1.一种土壤四环素类抗生素污染的诊断方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将植物种子放置到一组含有抗生素浓度呈梯度分布的土壤中培养，培养3天后检测植物种子的根系长度，计算根系长度的平均值；

(2)建立土壤中抗生素浓度与所述平均值之间的关系曲线；

(3)对含有抗生素的待测土壤进行预处理，将植物种子放置到待测土壤中培养，经过与步骤(1)相同的培养时间后，检测植物种子的根系长度，根据所述关系曲线计算得到待测土壤中抗生素的浓度。

2.根据权利要求1所述的四环素类抗生素污染的诊断方法，其特征在于，所述植物种子为白菜种子，品种为早熟8号。

3.根据权利要求1所述的四环素类抗生素污染的诊断方法，其特征在于，所述抗生素为土霉素和金霉素。

4.根据权利要求1所述的四环素类抗生素污染的诊断方法，其特征在于，采用线性回归方程拟合建立关系曲线。

5.根据权利要求4所述的四环素类抗生素污染的诊断方法，其特征在于，植物种子在所述土壤中培养3天后，所述的关系曲线为：

y₄＝-0.162x+3.16，R²＝0.831，0≤y₄≤5；

y₅＝-0.251x+3.29，R²＝0.975，0≤y₅≤5；

式中，y₄为土壤中土霉素的浓度，单位为mg·kg^-1；y₅为土壤中金霉素的浓度，单位为mg·kg^-1；x为根系长度，单位为cm·plant^-1。

6.根据权利要求1所述的四环素类抗生素污染的诊断方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(3)中，在培养之前，植物种子需用0.3％的高锰酸钾溶液消毒30分钟。

7.根据权利要求1所述的四环素类抗生素污染的诊断方法，其特征在于，所述植物种子的培养条件为：25℃的恒温培养箱内，置于暗处培养。

8.根据权利要求1所述的四环素类抗生素污染的诊断方法，其特征在于，步骤(1)中，所述土壤的类型为青紫泥。