CN102998405A

CN102998405A - 一种测定土壤、污泥及动物粪便中磺胺类及四环素类抗生素的方法

Info

Publication number: CN102998405A
Application number: CN2011102678595A
Authority: CN
Inventors: 安婧; 周启星; 林琳
Original assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Current assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Priority date: 2011-09-09
Filing date: 2011-09-09
Publication date: 2013-03-27

Abstract

本发明涉及环境污染技术，具体的说是一种测定土壤、污泥及动物粪便中磺胺类及四环素类抗生素的方法。具体为将预处理后的样品加入到含有CaCl₂的提取剂中溶解，溶解后依次经超声提取、震荡提取，而后离心收集上清液，待用；将上述收集的上清液通过HLB固相萃取柱分离，萃取富集收集洗脱液，过滤后待用；利用高效液相色谱测定上述收集的滤液中磺胺类及四环素类抗生素的量；其中，提取剂为按体积比1∶1组成的甲醇和EDTA-Mcllvaine缓冲液；固相萃取洗脱液为甲醇。本发明通过优化前处理及检测条件，建立了同步提取、同时测定土壤、污泥及动物粪便中磺胺类和四环素类共八种抗生素的分析方法，在35min内完成了对这两大类八种抗生素的快速分离检测。

Description

一种测定土壤、污泥及动物粪便中磺胺类及四环素类抗生素的方法

技术领域

本发明涉及环境污染技术，具体的说是一种测定土壤、污泥及动物粪便中磺胺类及四环素类抗生素的方法。

背景技术

抗生素因具有促进生长和防止动物疾病的双重功效而被广泛应用于农牧业生产。但是，由于对经济利益的过分追求和对抗生素的盲目依赖，近年来抗生素的使用量不断提高甚至以不合理的高剂量和高频率使用。据统计，美国年消耗农用抗生素24.6×10⁷t；中国是世界抗生素生产第一大国，仅2003年就生产青霉素2.8×10⁴t，土霉素1.0×10⁴t，分别占当年世界总产量的60％和65％。在众多抗生素中，磺胺类和四环素类抗生素是国内外畜禽养殖场使用最为广泛的两类抗生素。大量的生产和使用导致抗生素通过多种途径进入各种环境基质从而引发污染事故。

磺胺类和四环素类抗生素长期以来被用于动物疾病的治疗和预防，通常是作为动物饲料添加剂以亚治疗剂量添加到动物饲料中。这些作为饲料添加剂的抗生素被动物食用后，并不能被动物完全吸收利用，其中70％以上的药物会以母体形式通过粪便排出进入生态环境中，当这些含有抗生素的畜禽粪便作为有机肥料施入农田后，造成抗生素在土壤中残留。此外，由于缺乏针对性的处理工艺，污水处理厂并不能将抗生素有效地去除，很多抗生素残留在污泥中，这些含有抗生素的污泥回用农田时，也会将抗生素带入土壤环境，从而造成土壤环境污染。

近年来，抗生素的环境污染问题及其生态危害已经成为国际环境领域普遍关注的热点问题。抗生素残留检测方法的建立对于实现抗生素在环境基质中的迁移转化、生物有效性、生态毒理效应以及生态风险评估等方面的研究具有重要的现实意义。由于抗生素种类繁多，抗生素残留检测的方法也不尽相同。目前已有报道的关于磺胺类和四环素类抗生素的检测方法主要有微生物法、免疫分析法、毛细管电泳法、薄层色谱法、高效液相色谱法、液相-质谱联用技术等，不同的检测方法有其不同的适用领域和优缺点。例如，微生物法操作简单，但测定时间长、灵敏度低、特异性差；薄层色谱法具有简单、快速、不需复杂仪器等优点，但该法分辨率和灵敏度较低；液相-质谱联用法提供的信息量最多，既可以进行准确定量又可以进行准确的定性分析，灵敏度高，但该法通常情况下样品前处理比较复杂，仪器昂贵不易推广应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种一种测定土壤、污泥及动物粪便中磺胺类及四环素类抗生素的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种测定土壤、污泥及动物粪便中磺胺类及四环素类抗生素的方法，其特征在于：

1)将预处理后的样品加入到含有CaCl₂的提取剂中溶解，溶解后依次经超声提取、震荡提取，而后离心收集上清液，待用；

2)将上述收集的上清液通过HLB固相萃取柱分离，萃取富集收集洗脱液，过滤后待用；

3)利用高效液相色谱测定上述收集的滤液中磺胺类及四环素类抗生素的量；

其中，提取剂为按体积比1∶1组成的甲醇和EDTA-Mcllvaine缓冲液，CaCl₂与提取剂的质量比为1∶9；固相萃取洗脱液为甲醇。

所述高效液相色谱条件为：流动相由乙腈(A)和0.01mol/L草酸溶液(B)组成，柱温为30℃，流速为1.0ml/min；进样量为20μl。所述检测器波长范围设定为270nm-370nm；高效液相色谱仪采用Waters2695-2696，液相色谱柱选用Waters X TerraRP-18(250×4.6mm，5μm)。所述流动相为经过0.45μm有机膜超声震荡10min后的乙腈(A)，经0.45μm水膜超声震荡10min后的浓度为0.01mol/L的草酸溶液(B)。

所述样品预处理为将污水处理厂采集的脱水污泥、畜禽养殖场采集的畜禽粪或土壤样品用锡箔纸包裹，冷冻干燥后于-20℃中保存，备用。

所述步骤1)将2g预处理后的样品加入到10ml含有CaCl₂的提取剂中溶解，溶解后依次经超声提取、震荡提取，各15min，而后以4000r/min离心10min收集上清液，沉淀再次溶解在含有CaCl₂的提取剂中提取2-3次，收集上清液，合并上述上清液待用。

所述步骤2)将上述收集的上清液通过采用提取剂活化处理后的HLB固相萃取柱分离，先用高纯水淋洗HLB小柱，干抽20min，再用3ml甲醇洗脱HLB小柱，洗脱液流速为1ml/min，萃取富集收集洗脱液在40℃水浴下用氮气吹至近干，用体积比3∶2的甲醇和水溶液定容，定溶后溶液过0.22μm滤膜后收集样品，待测。所述EDTA-Mcllvaine缓冲液的配置过程为，称取12.9g柠檬酸，27.5gNa₂HPO₄，37.2g乙二胺四乙酸二钠，溶于水中并定容至1L(pH＝4.0)。

本发明所具有的优点：

本发明对不同类型的固体样品的前处理方法进行了优化。提取剂的成分价格低廉，前提取的步骤简单快速；选用固相萃取技术对样品进行萃取、浓缩和净化，萃取过程中有机溶剂用量少，便捷安全，且萃取柱具有防交叉污染、防雾化真空槽设计，质量稳定，样品回收率高，精密度好；

本发明优化了高效液相色谱仪对样品中磺胺类和四环素类抗生素的测定条件。采用程序升温的方法缩短了对八种抗生素的分离检测时间，并且根据八种抗生素的特征吸收波长，选取270-370nm波长范围内连续扫描以更为准确的测定抗生素的浓度。

总之，本发明通过优化前处理及检测条件，建立了同步提取、同时测定土壤、污泥及动物粪便中磺胺类和四环素类共八种抗生素的分析方法，在35min内完成了对这两大类八种抗生素的快速分离检测，具有可操作性强、高效、快速、灵敏度和检出率高等优点。

附图说明

图1为本发明实施例提供的磺胺类和四环素类抗生素的高效液相色谱分离图(10mg/l)(其中SDZ：磺胺嘧啶；SMR：磺胺甲嘧啶；SM2：磺胺二甲嘧啶；SMZ：磺胺甲恶唑；OTC：土霉素；TC：四环素；CTC：金霉素；DC：强力霉素)。

图2为本发明实施例提供的样品采样地点分布图。

具体实施方式

实施例

(1)样品前处理

将按环境监测要求布点采集的土壤样品置于室内风干后粉碎过60目筛，备用；将污水处理厂采集的脱水污泥以及畜禽养殖场采集的畜禽粪便样品用锡箔纸包裹，冷冻干燥后保存于-20℃冰柜中，备用。

准确称取2g土壤(污泥、粪便)样品置于25ml玻璃离心瓶中，加入含有10％(质量比)CaCl₂的提取剂(V_甲醇∶V_{EDTA-Mcllcaine缓冲液}＝1∶1)10ml(其中CaCl₂与提取剂的质量比为1∶9)，依次超声和振荡提取各15min，4000r/min离心收集上清液；固体残渣按上述方法提取2次，合并上清液后旋转蒸发至10ml左右；将浓缩液通过事先用6ml甲醇和6ml EDTA-Mcllvaine缓冲液活化的HLB固相萃取小柱，萃取富集；先用6ml高纯水淋洗HLB小柱，干抽20min，再用3ml甲醇洗脱HLB小柱，洗脱液流速为1ml/min，收集全部洗脱液；洗脱液在40℃水浴下用氮气吹至近干，用甲醇/水(体积比3∶2)溶液定容至1ml，溶液过0.22μm滤膜后收集于样品瓶中待测。

所述EDTA-Mcllvaine缓冲液的配置过程为，称取12.9g柠檬酸，27.5gNa₂HPO₄，37.2g乙二胺四乙酸二钠，溶于水中并定容至1L(pH＝4.0)。

(2)色谱条件

采用Waters2695-2696高效液相色谱仪，连接UV检测器，检测器波长范围设定为270nm-370nm；选用Waters X TerraRP-18(250×4.6mm，5μm)液相色谱柱；流动相为分别过0.45μm有机膜的乙腈(A)和过水膜的0.01mo l/L草酸溶液(B)，超声震荡10min后待用和；柱温为30℃，流速为1.0ml/min；梯度洗脱程序见表1；进样量为20μl。八种抗生素的色谱分离图见图1。

表1.程序升温过程

以浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mg/l的八种抗生素混合标准溶液做工作曲线，外标法定量。八种抗生素的工作曲线以及在样品中的加标回收率和检测限见表2。

表2八种抗生素的工作曲线、加标回收率和检测限

实施例

土壤样品采集自沈阳市郊的农田土壤，按东南西北依次为沈抚灌区、苏家屯农业区、张士灌区和沈北农业区；污泥样品采集自沈阳三座大型污水处理厂，分别是北部污水处理厂(S1)、沈水湾污水处理厂(S2)、仙女河污水处理厂(S 3)；畜禽粪便采集自沈阳八家大型畜禽养殖场，分别为农垦辉山养殖场(L1)、沈阳市种猪繁育中心(L2)、沈阳市种鸡繁育中心(L3)、辽河种猪场(L4)、海辉孵化场(L5)、信生肉种鸡场(L6)、伟峰种鸡场(L7)、金鸿种鸡场(L8)；采样地点分布见图2；按上述实施例记载经行检测各采样点八种抗生素的残留浓度见表3、4和5。

表3.土壤中磺胺类和四环素类抗生素的残留情况

表4.污泥中磺胺类和四环素类抗生素的残留情况

表5.畜禽粪便中磺胺类和四环素类抗生素的残留情况

注，表2、3、4和5中SDZ：磺胺嘧啶；SMR：磺胺甲嘧啶；SM2：磺胺二甲嘧啶；SMZ：磺胺甲恶唑；OTC：土霉素；TC：四环素；CTC：金霉素；DC：强力霉素。

Claims

1.一种测定土壤、污泥及动物粪便中磺胺类及四环素类抗生素的方法，其特征在于：

3)利用高效液相色谱测定上述收集的滤液中磺胺类及四环素类抗生素的量；其中，提取剂为按体积比1∶1组成的甲醇和EDTA-Mcllvaine缓冲液，CaCl₂与提取剂的质量比为1∶9；固相萃取洗脱液为甲醇。

2.按权利要求1所述的测定土壤、污泥及动物粪便中磺胺类及四环素类抗生素的方法，其特征在于：所述高效液相色谱条件为：流动相由乙腈(A)和0.01mol/L草酸溶液(B)组成，柱温为30℃，流速为1.0ml/min；进样量为20μl。

3.按权利要求2所述的测定土壤、污泥及动物粪便中磺胺类及四环素类抗生素的方法，其特征在于：所述检测器波长范围设定为270nm-370nm；高效液相色谱仪采用Waters2695-2696，液相色谱柱选用Waters XTerraRP-18(250×4.6mm，5μm)。

4.按权利要求2所述的测定土壤、污泥及动物粪便中磺胺类及四环素类抗生素的方法，其特征在于：所述流动相为经过0.45μm有机膜超声震荡10min后的乙腈(A)，经0.45μm水膜超声震荡10min后的浓度为0.01mol/L的草酸溶液(B)。

5.按权利要求1所述的测定土壤、污泥及动物粪便中磺胺类及四环素类抗生素的方法，其特征在于：所述样品预处理为将污水处理厂采集的脱水污泥、畜禽养殖场采集的畜禽粪或土壤样品用锡箔纸包裹，冷冻干燥后于-20℃中保存，备用。

6.按权利要求1所述的测定土壤、污泥及动物粪便中磺胺类及四环素类抗生素的方法，其特征在于：所述步骤1)将2g预处理后的样品加入到10ml含有CaCl₂的提取剂中溶解，溶解后依次经超声提取、震荡提取，各15min，而后以4000r/min离心10min收集上清液，沉淀再次溶解在含有CaCl₂的提取剂中提取2-3次，收集上清液，合并上述上清液待用。

7.按权利要求1所述的测定土壤、污泥及动物粪便中磺胺类及四环素类抗生素的方法，其特征在于：所述步骤2)将上述收集的上清液通过采用提取剂活化处理后的HLB固相萃取柱分离，先用高纯水淋洗HLB小柱，干抽20min，再用3ml甲醇洗脱HLB小柱，洗脱液流速为1ml/min，萃取富集收集洗脱液在40℃水浴下用氮气吹至近干，用体积比3∶2的甲醇和水溶液定容，定溶后溶液过0.22μm滤膜后收集样品，待测。