CN102890130B

CN102890130B - 一种烟草中阿维菌素残留量的检测方法

Info

Publication number: CN102890130B
Application number: CN201210397100.3A
Authority: CN
Inventors: 师君丽; 逄涛; 孔光辉; 李勇; 刘彦红
Original assignee: Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Current assignee: Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Priority date: 2012-10-18
Filing date: 2012-10-18
Publication date: 2014-06-04
Anticipated expiration: 2032-10-18
Also published as: CN102890130A

Abstract

本发明公开了一种烟草中阿维菌素残留量的检测方法，包括提取、净化、衍生化反应、检测步骤，具体包括：准确称取烟叶样品置于离心管中，加入乙腈，振荡，再加入无水硫酸钠，振荡，离心，残渣再用乙腈重复提取，合并上清液；取碱性氧化铝小柱，将上清液过柱，收集滤液至浓缩瓶中，用有机溶剂洗脱，将滤液旋转蒸发至干，加入有机溶剂，置于超声波上超声使充分溶解，取0.5～2ml置于棕色瓶中；在避光、室温环境条件下，在棕色瓶中加入衍生化试剂混旋，反应完后加入甲醇，静置反应，反应液过滤膜后注入高效液相色谱仪进行定量分析计算得到阿维菌素农药残留量。本发明灵敏度和准确度高，重现性好，适宜烟草中阿维菌素残留微量分析。

Description

一种烟草中阿维菌素残留量的检测方法

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种烟草中阿维菌素残留量的检测方法。

背景技术

阿维菌素(Avermectin，简称AVM)是从阿维链霉菌的发酵产物中分离出来的大环内酯类抗生素，对动、植物的寄生线虫和节肢动物均有高效的驱杀作用，由于具有杀虫活性强以及杀虫谱广，被广泛用于蔬菜、果树、水稻和烟草等作物的生产中。

阿维菌素虽属于微生物源农药，但它对大鼠的LD₅₀为10mg/kg，属高毒农药。因此，国际上对阿维菌素的最高残留限量（MRL）要求非常严格，对其残留的检测十分重视，目前，国内外都没有烟草中阿维菌素农药残留量的检测方法。近年来，随着阿维菌素及甲维盐在烟草生产中的使用量逐年增大，开展烟草及烟草制品中阿维菌素残留量的测定，加强其残留的监控，对提高烟叶质量安全性具有重大意义，因此建立烟草中阿维菌素残留检测方法显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种烟草中阿维菌素残留量的检测方法。

本发明的目的是这样实现的，包括提取、净化、衍生化反应、检测步骤，具体包括：

A、提取：准确称取烟叶样品4.0~6.0 g，置于离心管中，加入8~12ml提取溶剂，振荡处理2~4min，加入4.0~6.0 g干燥剂，振荡处理2~4min，离心分离8~12min，残渣再用8~12ml提取溶剂重复提取1~2次，合并上清液备用；

B、净化：取净化小柱，将A步骤所得上清液过柱，收集滤液至浓缩瓶中，接着用8~12mL洗脱剂洗脱，洗脱液收集于同一浓缩瓶中，将浓缩瓶中的滤液30~50℃旋转蒸发至干，然后加入0.5~1.5ml乙腈，超声处理1~3min，使充分溶解得到净化液，将其置于避光容器中备用；

C、衍生化反应：在避光、室温环境条件下，取B步骤所得净化液，取0.5~1ml至棕色瓶中加入0.l~0.2mL体积比为0.5~1：0.5~1的甲基咪唑-乙腈衍生化试剂，混旋0.5~1min，再加入0.1~0.2mL体积比为0.5~1：1~2的三氟乙酸酐-乙腈衍生化试剂，混旋0.5~1min，反应15~20min后加入0.2~0.4mL甲醇，静置反应8~12h后，反应液经超微过滤后得试样液备用；

D、检测：取C步骤所得试样液注入高效液相色谱仪进行定量分析计算得到阿维菌素农药残留量。

本发明采用碱性氧化铝小柱净化，荧光检测器进行检测；经提取、净化、衍生化反应，根据样品的保留时间进行定性分析，根据其峰面积进行定量分析。本发明灵敏度和准确度高，重现性好，适宜烟草中阿维菌素残留微量分析。

附图说明

图1为阿维菌素标准品色谱图；

图2为添加0.01μg/g阿维菌素烤烟样品色谱图；

图3为烟草空白样品色谱图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明包括提取、净化、衍生化反应、检测步骤，具体包括：

提取是准确称取烟叶样品4.0~6.0 g，置于离心管中，加入8~12ml提取溶剂，振荡处理2~4min，加入4.0~6.0 g干燥剂，振荡处理2~4min，离心分离8~12min，残渣再用8~12ml提取溶剂重复提取1~2次，合并上清液备用；

净化是取净化小柱，将A步骤所得上清液过柱，收集滤液至浓缩瓶中，接着用8~12mL洗脱剂洗脱，洗脱液收集于同一浓缩瓶中，将浓缩瓶中的滤液30~50℃旋转蒸发至干，然后加入0.5~1.5ml乙腈，超声处理1~3min，使充分溶解得到净化液，将其置于避光容器中备用；

衍生化反应是在避光、室温环境条件下，取B步骤所得净化液，取0.5~1ml至棕色瓶中加入0.l~0.2mL体积比为0.5~1：0.5~1的甲基咪唑-乙腈衍生化试剂，混旋0.5~1min，再加入0.1~0.2mL体积比为0.5~1：1~2的三氟乙酸酐-乙腈衍生化试剂，混旋0.5~1min，反应15~20min后加入0.2~0.4mL甲醇，静置反应8~12h后，反应液经超微过滤后得试样液备用；

检测是取衍生化反应步骤所得试样液注入高效液相色谱仪进行定量分析计算得到阿维菌素农药残留量。

所述的提取步骤中离心管为40~60ml离心管；干燥剂为无水硫酸钠或无水硫酸镁，优选无水硫酸钠；提取溶剂为乙腈、甲醇、丙酮、二氯甲烷、正己烷、石油醚中的一种，优选乙腈。

所述的提取步骤中振荡处理为漩涡振荡、超声振荡中的一种。

所述的提取步骤中离心转速为3000~5000r/min，优选为4000 r/min。

所述的净化步骤中在上清液过柱前在碱性氧化铝小柱中加3~5g无水硫酸钠或无水硫酸镁，优选无水硫酸钠；加8~12mL乙腈进行预淋。

所述的净化步骤中净化小柱为C18柱，硅胶柱、弗罗里硅土、中性氧化铝或碱性氧化铝中的一种，优选碱性氧化铝小柱；洗脱剂为乙腈、甲醇、丙酮中的一种，优选乙腈。

所述的衍生化反应步骤中超微过滤为使用0.22~0.45μm的聚四氟乙烯滤膜、尼龙滤膜、再生纤维素滤膜中的一种进行过滤。

所述的检测步骤中高效液相色谱柱为5μm，4.6×150mm 的Eclipse XDB-C18，柱温为0~30℃，进样量为10~30μL；流动相为体积比为94~96:4~6的乙腈-水，优选为96:4，流速：1~2ml/min，优选为1 ml/min。

所述的检测步骤中高效液相色谱检测器为荧光检测器，发射波长为360~370nm，优选为365nm；激发波长为470~480nm，优选为475nm。

所述的检测步骤中定量方法为外标法。

本发明的特点：

1）采用碱性氧化铝小柱净化，荧光检测器进行检测。

2）以乙腈-水为流动相；样品经乙腈萃取，振荡提取3min，再4000r/min离心约５min，取上清液浓缩适量后过碱性氧化铝小柱净化，净化后再氮吹浓缩至1ml，取0.50 ml加衍生试剂（衍生试剂A:N一甲基咪唑与乙腈等体积混匀；衍生试剂B:三氟乙酸酐与乙腈按1:2(V:V)混匀。）衍生化，再加甲醇使衍生产物转化为稳定的醇式结构。

3）根据样品的保留时间进行定性分析，根据其峰面积进行定量分析。

该发明的优点在于：灵敏度和准确度高，重现性好，适宜烟草中阿维菌素残留微量分析。

实施例1

准确称取1号烟叶样品4.0 g，置于40ml塑料离心管中，加入0.04μg阿维菌素农药标准品，加入8ml乙腈，振荡2min，加入4.0 g无水硫酸钠，漩涡振荡2min，离心8min，残渣再用8ml乙腈重复提取1次，合并上清液；取碱性氧化铝小柱，加3g无水硫酸钠，加8mL乙腈进行预淋，将上清液过柱，收集滤液至浓缩瓶中，接着用8mL乙腈洗脱,收集于同一浓缩瓶中，将浓缩瓶中的滤液30℃旋转蒸发至干，然后加入0.5ml乙腈，置于超声波上超声1min，使充分溶解，取0.5ml置于棕色瓶中备用；在避光、室温环境条件下，取上述棕色瓶加入0.lmL体积比为0.5：1的甲基咪唑-乙腈衍生化试剂，混旋0.5min，再加入0.1mL体积比为0.5：2的三氟乙酸酐-乙腈衍生化试剂，此时有大量白色雾气，需立即将盖子盖紧，混旋0.5min，反应15min后加入0.2mL甲醇，静置反应12h后，反应液过0.45μm聚四氟乙烯滤膜后得试样；取所得试样注入高效液相色谱仪进行定量分析计算得到阿维菌素农药残留量为0.0087μg/g。

实施例2

准确称取2号烟叶样品6.0 g，置于60ml玻璃离心管中，加入0.06μg阿维菌素农药标准品，加入12ml甲醇，振荡4min，加入6.0 g无水硫酸镁，超声振荡4min，离心12min，残渣再用12ml甲醇重复提取2次，合并上清液；取C18小柱，加5g无水硫酸钠，加12mL甲醇进行预淋，将上清液过柱，收集滤液至浓缩瓶中，接着用12mL甲醇洗脱,收集于同一浓缩瓶中，将浓缩瓶中的滤50℃旋转蒸发至干，然后加入1.5ml乙腈，置于超声波上超声3min，使充分溶解，取1ml置于棕色瓶中备用；在避光、室温环境条件下，取上述棕色瓶加入0.2mL体积比为1：0.5的甲基咪唑-乙腈衍生化试剂，混旋1min，再加入0.2mL体积比为1：1的三氟乙酸酐-乙腈衍生化试剂，此时有大量白色雾气，需立即将盖子盖紧，混旋1min，反应20min后加入0.4mL甲醇，静置反应11h后，反应液过0.22μm尼龙滤膜后得试样；取所得试样注入高效液相色谱仪进行定量分析计算得到阿维菌素农药残留量为0.0093μg/g。

实施例3

准确称取3号烟叶样品5.0 g，加入0.05μg阿维菌素农药标准品,置于50ml玻璃、塑料离心管中，加入10ml二氯甲烷，漩涡振荡3min，加入5.0g无水硫酸镁，振荡3min，离心10min，残渣再用10ml二氯甲烷重复提取1次，合并上清液；取硅胶小柱，加4g无水硫酸钠，加10mL丙酮进行预淋，将上清液过柱，收集滤液至浓缩瓶中，接着用10mL丙酮洗脱,收集于同一浓缩瓶中，将浓缩瓶中的滤液40℃旋转蒸发至干，然后加入1ml乙腈，置于超声波上超声2min，使充分溶解，取0.8ml置于棕色瓶中备用；在避光、室温环境条件下，取上述棕色瓶加入0.15mL体积比为1：1的甲基咪唑-乙腈衍生化试剂，混旋1min，再加入0.15mL体积比为1：2的三氟乙酸酐-乙腈衍生化试剂，此时有大量白色雾气，需立即将盖子盖紧，混旋1min，反应15min后加入0.3mL甲醇，静置反应10h后，反应液过0.45μm再生纤维素滤膜后得试样；取所得试样注入高效液相色谱仪进行定量分析计算得到阿维菌素农药残留量为0.0103μg/g。

实施例4

准确称取4号烟叶样品4.0 g，加入0.04μg阿维菌素农药标准品,置于60ml玻璃、塑料离心管中，加入9ml丙酮，漩涡振荡3min，加入6.0 g无水硫酸钠，振荡2min，离心8min，残渣再用8ml丙酮重复提取1次，合并上清液；取弗罗里硅土小柱，加5g无水硫酸钠，加9mL乙腈进行预淋，将上清液过柱，收集滤液至浓缩瓶中，接着用8mL乙腈洗脱,收集于同一浓缩瓶中，将浓缩瓶中的滤液42℃旋转蒸发至干，然后加入1.2ml乙腈，置于超声波上超声2min，使充分溶解，取0.5ml置于棕色瓶中备用；在避光、室温环境条件下，取上述棕色瓶加入0.lmL体积比为1：1的甲基咪唑-乙腈衍生化试剂，混旋1min，再加入0.2mL体积比为0.5：1的三氟乙酸酐-乙腈衍生化试剂，此时有大量白色雾气，需立即将盖子盖紧，混旋1min，反应16min后加入0.3mL甲醇，静置反应9h后，反应液过0.22μm尼龙滤膜后得试样；取所得试样注入高效液相色谱仪进行定量分析计算得到阿维菌素农药残留量为0.00957μg/g。

实施例5

准确称取5号烟叶样品6.0 g，加入0.06μg阿维菌素农药标准品，置于60ml玻璃、塑料离心管中，加入12ml石油醚，超声振荡4min，加入6.0 g无水硫酸钠，振荡2min，离心9min，残渣再用10ml石油醚重复提取2次，合并上清液；取中性氧化铝小柱，加4g无水硫酸钠，加10mL甲醇进行预淋，将上清液过柱，收集滤液至浓缩瓶中，接着用9mL甲醇洗脱,收集于同一浓缩瓶中，将浓缩瓶中的滤液38℃旋转蒸发至干，然后加入1ml乙腈，置于超声波上超声3min，使充分溶解，取1ml置于棕色瓶中备用；在避光、室温环境条件下，取上述棕色瓶加入0.2mL体积比为1：1的甲基咪唑-乙腈衍生化试剂，混旋1min，再加入0.2mL体积比为1：2的三氟乙酸酐-乙腈衍生化试剂，此时有大量白色雾气，需立即将盖子盖紧，混旋1min，反应20min后加入0.4mL甲醇，静置反应8h后，反应液过0.45μm再生纤维素滤膜后得试样；取所得试样注入高效液相色谱仪进行定量分析计算得到阿维菌素农药残留量为0.0105μg/g。

试验例1

1、提取：准确称取烟叶样品5.0 g，置于50ml塑料离心管中，加入10ml乙腈，漩涡振荡3min，加入5.0g无水硫酸钠，漩涡振荡3min，4000r/min离心10min。残渣再用10ml乙腈重复提取1次，合并两次上清液，待净化。

2、净化：取碱性氧化铝小柱，加4g无水硫酸钠。加10mL乙腈预淋，将上清液过柱，收集滤液至浓缩瓶中，接着用10mL乙腈洗脱,收集于同一浓缩瓶中。将浓缩瓶中的滤液42℃旋转蒸发至干，然后加入1ml乙腈，置于超声波上超声1min，使充分溶解，取0.5ml至2ml棕色瓶中待衍生化。

3、衍生化反应:避光、室温环境条件下，在装有0.5ml待衍生化样品的棕色瓶中先加入0.lmL衍生化试剂A，混旋0.5min，再加入0.15mL衍生化试剂B，此时有大量白色雾气，需立即将盖子盖紧，混旋0.5min，反应15min后加入0.25mL甲醇，静置反应8h后，反应液过0.45μm滤膜后进高效液相色谱仪分析。

4、检测：处理好的试样用高效液相色谱仪定性定量测定阿维菌素农药残留，色谱条件：色谱柱-Eclipse XDB-C18（5μm，4.6x150mm）；柱温：室温；进样量：20μL；流动相：乙腈：水（96:4）；流速：1.5ml/min；检测器：荧光检测器，发射波长：365nm 激发波长：475nm ；定量方法——外标法（峰面积）。

一、结果讨论

1、检测波长的选择

对阿维菌素标准品衍生产物的激发和发射波长进行扫描，结果显示，在激发和发射波长分别为365 nm和475 nm时，阿维菌素衍生产物在荧光检测器上的响应值最大。

2、流动相组成、流速的选择

试验比较了甲醇－水和乙腈－水两种流动相，此两种流动相对阿维菌素衍产物的分离效果和峰型都很理想，试验发现无论选择甲醇或者乙腈作为流动相，有机相的体积分数都不能低于90％，否则保留时间显著延长，峰变宽，但乙腈－水流动相中的衍生产物在荧光检测器上的响应值要比在甲醇－流动相的高，故选择乙腈－水作为流动相。其它条件不变的情况下，对流动相流速（0.5～1.5 ml/min）进行试验，确定流速为1.5ml/min分离效果和峰型最理想。

3、提取溶剂的选择

农药残留分析中对使用的溶剂要求是非常高的，即要求提取回收率高、杂质干扰小、经济等，烟草是基质复杂的样品，提取溶剂的选择直接影响到提取效果的好坏，选择并比较了丙酮、二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯和乙腈几种溶剂的提取效果。结果表明：用乙酸乙酯提取不到目标化合物，用丙酮、甲醇和二氯甲烷提取，色素和脂溶性物质有等杂质较多，这些杂质会影响目标物的分离和定量分析，乙腈作为提取溶剂能获得较高的添加回收率，且干扰相对较低，但仍有较多的基质成分被提取，因此必须对提取液净化，最终确定乙腈作为阿维菌素类药物残留分析的提取溶剂。

4、净化条件的选择

本试验研究比较了C18小柱、中性氧化铝小柱、碱性氧化铝小柱和弗罗里硅土柱的净化效果。分别添加0.01μg/g的农药，每种柱子做5个平行，计算每种柱子的平均收回率。实验得出：中性氧化铝和弗罗里硅土除杂效果不理想，而且对目标化合物的回收率分别为76.48%和64.33%，碱性氧化铝小柱净化效果最好，回收率为97.69%，C18小柱对杂质去除效果较好，回收率为89.53%，，因此本方法选择碱性氧化铝固相萃取柱。

二、衍生条件的选择

1、光线对衍生化反应影响

本试验在研究不同太阳光强度下衍生化反应时也发现，光线强度越高，其处理对应的峰响应值越低，说明光线对衍生反应有抑制作用，光强越大，抑制作用越明显，故衍生化反应需避光进行。

2、衍生化反应时间的选择

将同一浓度的标准溶液在衍生化反应不同时间后进样测定，结果表明，衍生反应15min左右，峰面积达到最大并趋于稳定，故衍生化反应时间确定为15min。

三、衍生反应中水和醇类的影响

AVMs的衍生反应产物是一个含4，2一三氟乙酰基的荧光衍生物(酯式)，当它碰到水或醇类羟基物质时极不稳定，酯键易发生断裂，水解为醇式结构,色谱图上将多出现一个醇式结构产物的色谱峰,同时酯式衍生产物的峰值降低,其中醇式结构产物的保留时间更短，出峰时间早。本实验在加入衍生反应完成后,再加入一定量甲醇并放置一定时间,使酯式结构产物全部转换为稳定的醇式结构。在数据处理时只需对醇式结构产物的峰值进行积分就能准确测定阿维菌素量。

四、衍生产物稳定性试验

将加入甲醇后的衍生溶液放置0min,15min,30mim,45min,1h、2h、4h、8h、12h、1d、2d、3d，4d,5d后测定，结果表明，常温下，随着放置时间的延长，醇式结构的峰面积不断增加，酯式结构峰面积不断减少，放置8h的时候酯式结构产物全部转换为醇式结构，放置12h，衍生产物峰面积无显著性变化,当放置到1d时，峰面积开始下降，而在4℃时保存4d内没有出现降解现象,第5d时，峰面积有所下降。因此，柱前衍生化好的样品放置时间不应超过24h，不能立即进行测定时，应放在4℃冰箱中避光保存。

五、回归方程和检出限

用乙腈将标准储备液稀释称取阿维菌素标准储备液，分别用乙腈稀释配制成0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2μg／mL的标准工作溶液，取0.5ml标样到棕色瓶中，加入0.lmL衍生化试剂A，混旋0.5min，再加入0.15mL衍生化试剂B，立即将盖子盖紧，混旋0.5min，反应15min后加入0.25mL甲醇，静置反应8h后，反应液过0.45μm滤膜后进高效液相色谱仪分析后建立阿维菌素浓度与峰面积的回归方程，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果得出：在0.002～0.2μg/mL范围内，各标准品浓度与峰面积值均有良好的线性关系，阿维菌素的回归方程为:Y=438.13X + 0.07(R² =0.9999),该方法的检出限能达到1 μg/kg，完全满足阿维菌素残留分析要求。

六、方法回收率和精密度

为考察方法可靠性，进行了精密度和回收率实验。分别在0.001 mg/kg、0.01 mg/kg、0.1 mg/kg 3个添加水平下对烤烟样品进行加标回收试验，每个浓度进行5次平行实验，得到方法精密度，以RSD表示，结果如表1。在3个加标水平上，阿维菌素农药的平均回收率在89.37％～102.84%之间，精密度小于4.05%，方法的重复性较好，说明该方法的准确度和精密度能够满烟草中阿维菌素残留量的测定要求。

表1方法的回收率和精密度

Tab.1 spiked recoveries and precision

Figure 2012103971003100002DEST_PATH_IMAGE001

Claims

1.一种烟草中阿维菌素残留量的检测方法，其特征在于包括提取、净化、衍生化反应、检测步骤，具体包括：

A、提取：准确称取烟叶样品4.0~6.0 g，置于离心管中，加入8~12ml提取溶剂甲醇、丙酮、二氯甲烷、正己烷、石油醚中的一种，振荡处理2~4min，加入4.0~6.0 g干燥剂，振荡处理2~4min，离心分离8~12min，残渣再用8~12ml提取溶剂甲醇、丙酮、二氯甲烷、正己烷、石油醚中的一种重复提取1~2次，合并上清液备用；

B、净化：取净化小柱，加3~5g无水硫酸钠或无水硫酸镁，加8~12ml洗脱剂甲醇进行预淋，将A步骤所得上清液过柱，收集滤液至浓缩瓶中，接着用8~12mL洗脱剂甲醇洗脱，洗脱液收集于同一浓缩瓶中，将浓缩瓶中的滤液30~50℃旋转蒸发至干，然后加入0.5~1.5ml乙腈，超声处理1~3min，使充分溶解得到净化液，将其置于避光容器中备用；

D、检测：取C步骤所得试样液注入色谱柱为5μm，4.6×150mm 的Eclipse XDB-C18，柱温为0~30℃，进样量为10~30μL；流动相为体积比为94~96:4~6的乙腈-水，流速：1~2ml/min的高效液相色谱仪进行定量分析计算得到阿维菌素农药残留量。

2.根据权利要求1所述的烟草中阿维菌素残留量的检测方法，其特征在于所述的A步骤中离心管为40~60ml离心管；干燥剂为无水硫酸钠或无水硫酸镁。

3.根据权利要求1所述的烟草中阿维菌素残留量的检测方法，其特征在于所述的A步骤中振荡处理为漩涡振荡、超声振荡中的一种。

4.根据权利要求1所述的烟草中阿维菌素残留量的检测方法，其特征在于所述的A步骤中离心转速为3000~5000r/min。

5.根据权利要求1所述的烟草中阿维菌素残留量的检测方法，其特征在于所述的净化小柱为C18柱，硅胶柱、弗罗里硅土、中性氧化铝或碱性氧化铝中的一种。

6.根据权利要求1所述的烟草中阿维菌素残留量的检测方法，其特征在于所述的C步骤中超微过滤为使用0.22~0.45μm的聚四氟乙烯滤膜、尼龙滤膜、再生纤维素滤膜中的一种进行过滤。

7.根据权利要求1所述的烟草中阿维菌素残留量的检测方法，其特征在于所述的D步骤中高效液相色谱检测器为荧光检测器，发射波长为470~480nm，激发波长为360~370nm。

8.根据权利要求1所述的烟草中阿维菌素残留量的检测方法，其特征在于所述的D步骤中定量方法为外标法。