CN108152493B - 检测水产品中孔雀石绿的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测水产品中孔雀石绿的方法，该方法不采用常用的液液萃取操作，改为加入适量的无水氯化钙、无水硫酸钠等除水剂进行除水来制作上样液，使目标药物成分更易被乙腈提取，操作简便快速，所用的提取试剂、反应试剂均为普通的化学试剂，不需要使用液相色谱仪、质谱仪等大型检测仪器，分析成本低，适合大范围推广。

Description

检测水产品中孔雀石绿的方法
技术领域
本发明涉及化学检测技术领域，特别是涉及一种检测水产品中孔雀石绿的方法。
背景技术
孔雀石绿(malachitegreen，MG)，又名碱性绿、盐基块绿、孔雀石绿，化学名为四甲基代二氨基三苯甲烷，分子式为C23H25ClN2，为暗绿色结晶固体，是一种合成的工业染料。
自1936年以来，许多国家将孔雀石绿广泛用作水产养殖业中，作为杀虫剂和杀菌剂，用来杀灭体外寄生虫和鱼卵中的霉菌。以前在我国被用于欧洲鳗、甲鱼、河蟹、罗非鱼、鳜鱼、鲢鱼等水霉病、小瓜虫病、聚索虫病的防治。从1990年开始，国内外学者陆续研究发现，孔雀石绿及其代谢产物隐色孔雀石绿(leucomalachitegreen，LMG)在鱼体内和环境中残留时间长，其化学官能团-三苯甲烷(triphenylmethane)被确证具有高毒、高残留、“三致”等毒副作用。鉴于此，美国、加拿大、日本、欧盟等许多国家和地区都将其列为水产养殖禁用药物。我国从2002年5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及化合物清单》中。但是，由于孔雀石绿的抗菌效果非常好、价格低廉，加之对其毒副作用的宣传力度不够等原因，在水产养殖中仍有违规使用孔雀石绿的情况。
目前商业化的检测方法主要是采用GB/T19857-2005(水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定)的方法，该法将试样采用乙腈-乙酸铵缓冲溶液提取，乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲烷层，经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱-串联质谱法测定，并用内标法定量。然而，该法用到了液液萃取法，操作难度较大，回收率不高，对于操作人员要求较高。检测时所用固相萃取柱均需串联使用，必须活化并且上样前需进行一定处理，操作繁琐，不利于快速检测。
发明内容
基于此，有必要一种检测水产品中孔雀石绿的方法，以解决传统方法操作难度大、不利于快速检测的问题。
一种检测水产品中孔雀石绿的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取切碎的去除脂肪组织的待测样本，用均质机均质得到均质物；
(2)取所述均质物置于离心管中，每3g所述均质物，对应加入1.5～2.5ml试剂A，振荡混匀，加入3～5ml试剂B，3～5ml试剂C，剧烈振荡后，再加入5～6g试剂D，剧烈振荡后，室温下以3000～5000转/分钟进行离心，取上清液；
(3)移取步骤(2)中所述上清液于反应管中，每1.2ml所述上清液，对应加入7～9ml试剂E，混匀后作为上样液；
(4)将所述上样液通过固相萃取柱，完全过柱并吹干所述固相萃取柱后，向所述固相萃取柱中加入试剂F进行洗脱，收集洗脱液进行检测；
所述试剂A为5wt％～7wt％硼氢化钾溶液；
每10ml～100ml所述试剂B含有0.23g盐酸羟胺、0.24g对甲苯磺酸、5ml乙酸铵；
所述试剂C为乙腈；
所述试剂D包括氧化铝粉末以及无水氯化钙和/或无水硫酸钠，所述氧化铝粉末与所述无水氯化钙和/或无水硫酸钠的质量比值为0.6～1.5；
所述试剂E为2wt％～6wt％乙酸-乙酸铵缓冲液；
所述试剂F包括0.1～0.2mol/L乙酸铵溶液和乙腈的等体积混合物。
在其中一个实施例中，所述试剂D还包括氯化钠，所述氯化钠与所述氧化铝粉末以及无水氯化钙和/或无水硫酸钠的质量比值为0.04～0.12。
添加极少量的氯化钠，可以防止过度乳化的情况出现，而过多的氯化钠溶解于溶剂中，容易造成其他溶质析出，从而对检测结果造成影响。
在其中一个实施例中，所述试剂E为4wt％乙酸-乙酸铵缓冲液。
因pH值可以改变检测目标物和萃取柱吸附剂的离子化程度，对于强阳/阴离子交换柱来讲，因为吸附剂本身是完全离子化的状态，检测目标物必须完全离子化才可以保证其被吸附剂完全吸附保留，在乙酸铵溶液中添加一定量的乙酸作为缓冲剂，可以起到更好的富集作用，缓冲剂优选4wt％乙酸-乙酸铵溶液。
在其中一个实施例中，在步骤(3)中，加入所述试剂E之前，还包括以下步骤：
向所述反应管中加入90～110μl二甘醇，振荡混匀。
在其中一个实施例中，步骤(4)中所述试剂F加入量为400～500μl。
添加少量的二甘醇，可以起到消沫作用，使隐色孔雀石绿更易被提取。
在其中一个实施例中，所述试剂F为0.1～0.2mol/L乙酸铵溶液和乙腈等体积混合，再加入氨水调节至pH值为9～11后所得。
在其中一个实施例中，所述固相萃取柱为以丙磺酸键合硅胶为填料的强阳离子交换型萃取柱。
在其中一个实施例中，检测水产品中孔雀石绿的方法所述还包括以下步骤：
向放置有胶体金颗粒的金标微孔中滴加所述洗脱液以及0.1～0.2mol/L乙酸铵溶液，混匀后，滴加至胶体金免疫层析纸进行检测；
滴加的所述乙酸铵溶液的体积不少于所述洗脱液的体积。
所述乙酸铵溶液的体积少于所述洗脱液的体积时，由于测试溶液pH值过低，容易造成结果偏差，可能出现假阳性结果。
在其中一个实施例中，滴加的所述乙酸铵溶液的体积为所述洗脱液的体积的1.5～2倍。
在其中一个实施例中，所述胶体金免疫层析纸上具有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线含有孔雀石绿抗原，所述质控线含有能与所述孔雀石绿抗原特异结合的抗体；
若检测线显色比质控线深或一样深，则为阴性，表示样本中孔雀石绿的浓度低于检出限；
若检测线显色明显比质控线浅，或检测线呈绿色，则为阳性，表示样本中孔雀石绿的浓度高于检出限；
若质控线未显色，则判断为操作不当或所述胶体金免疫层析纸已失效。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的方法不采用常用的液液萃取操作，改为加入适量的无水氯化钙、无水硫酸钠等除水剂进行除水来制作上样液，使目标药物成分更易被乙腈提取，本方法操作简便快速，适合大范围推广。
(2)所用的提取试剂、反应试剂均为普通的化学试剂，不需要使用液相色谱仪、质谱仪等大型检测仪器，分析成本低，对水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿的检出限为1ppb。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的提取和检测水产品中孔雀石绿的方法作进一步详细的说明。
以下实施例中所使用的试剂和原料均来源于市售；所使用的固相萃取柱为以丙磺酸键合硅胶为填料的强阳离子交换型萃取柱；所使用的胶体金免疫层析纸上具有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜包被有相互分离的检测线和质控线，检测线含有(隐色)孔雀石绿抗原，质控线含有能与(隐色)孔雀石绿抗原特异结合的抗体。检测判断方法为：若检测线显色比质控线深或一样深，则为阴性，表示样本中孔雀石绿的浓度低于检出限；若检测线显色明显比质控线浅，或检测线呈绿色，则为阳性，表示样本中孔雀石绿的浓度高于检出限；若质控线未显色，则判断为操作不当或所述胶体金免疫层析纸已失效。
在本发明中，wt％表示质量分数；对孔雀石绿的提取和检测，包括了对孔雀石绿及其代谢产物隐色孔雀石绿的提取和检测。
实施例1
本实施例的提取和检测水产品中孔雀石绿的方法包括以下步骤：
1.取切碎的去除脂肪组织的待测样本a，用均质机均质得到均质物；
2.称取3g所述均质物于离心管中，加入2ml 6wt％硼氢化钾溶液，振荡混匀25s，加入4ml试剂B，4ml试剂C，剧烈振荡3min，再加入5g试剂D，剧烈振荡2min后，室温下4000转/分钟离心5min；
3.移取1.2ml上清液于反应管中，加入8ml试剂E，混匀2min后作为上样液；
4.将所述上样液通过固相萃取柱，完全过柱并吹干所述固相萃取柱后，向所述固相萃取柱中加入500μl试剂F进行洗脱，收集洗脱液待测定；
5.向放置有胶体金颗粒的金标微孔中滴加3滴上述洗脱液以及3滴试剂G，混匀2min后，滴加至胶体金免疫层析纸进行检测。
其中，试剂A为6wt％硼氢化钾溶液；试剂B为0.23g盐酸羟胺、0.24g对甲苯磺酸、5ml乙酸铵混合后加水至55ml混匀所得；试剂C为乙腈；试剂D为3g氧化铝粉末和2g无水氯化钙的混合物；试剂E为4wt％乙酸-乙酸铵缓冲液；试剂F为0.1mol/L乙酸铵溶液和乙腈的等体积混合物；试剂G为0.2mol/L乙酸铵溶液。
【结果判定】
检测结果为阳性，判断该鱼样中含有超过检出限的孔雀石绿、隐色孔雀石绿。
经国标GB/T19857-2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》方法确认该样本中含有孔雀石绿、隐色孔雀石绿5ppb。
实施例2
本实施例的提取和检测水产品中孔雀石绿的方法包括以下步骤：
1.取切碎的去除脂肪组织的待测样本b，用均质机均质得到均质物；
2.称取3g所述均质物于离心管中，加入1.5ml 6wt％硼氢化钾溶液，振荡混匀35s，加入3ml试剂B，3ml试剂C，剧烈振荡3.5min，再加入5g试剂D，剧烈振荡1.5min后，室温下5000转/分钟离心4min；
3.移取1.2ml上清液于反应管中，向所述反应管中加入90μl二甘醇，混匀1min，加入9ml试剂E，混匀3min后作为上样液；
4.将所述上样液通过固相萃取柱，完全过柱并吹干所述固相萃取柱后，向所述固相萃取柱中加入450μl试剂F进行洗脱，收集洗脱液待测定；
5.向放置有胶体金颗粒的金标微孔中滴加3滴上述洗脱液以及4滴试剂G，混匀2min后，滴加至胶体金免疫层析纸进行检测。
其中，试剂A为6wt％硼氢化钾溶液；试剂B为0.23g盐酸羟胺、0.24g对甲苯磺酸、5ml乙酸铵混合后加水至100ml混匀所得；试剂C为乙腈；试剂D为2g氧化铝粉末和3g无水硫酸钠的混合物；试剂E为6wt％乙酸-乙酸铵缓冲液；试剂F为0.2mol/L乙酸铵溶液和乙腈等体积混合，再加入氨水调节至pH值为9后所得；试剂G为0.2mol/L乙酸铵溶液。
【结果判定】
检测结果为阳性，判断该鱼样中含有超过检出限的孔雀石绿、隐色孔雀石绿。
经国标GB/T19857-2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》方法确认该样本中含有孔雀石绿、隐色孔雀石绿8ppb。
实施例3
本实施例的提取和检测水产品中孔雀石绿的方法包括以下步骤：
1.取切碎的去除脂肪组织的待测样本c，用均质机均质得到均质物；
2.称取3g所述均质物于离心管中，加入2.5ml 7wt％硼氢化钾溶液，振荡混匀30s，加入5ml试剂B，5ml试剂C，剧烈振荡2.5min，再加入6g试剂D，剧烈振荡2.5min后，室温下3000转/分钟离心6min；
3.移取1.2ml上清液于反应管中，向所述反应管中加入110μl二甘醇，混匀2min，加入9ml试剂E，混匀3min后作为上样液；
4.将所述上样液通过固相萃取柱，完全过柱并吹干所述固相萃取柱后，向所述固相萃取柱中加入400μl试剂F进行洗脱，收集洗脱液待测定；
5.向放置有胶体金颗粒的金标微孔中滴加3滴上述洗脱液以及5滴试剂G，混匀3min后，滴加至胶体金免疫层析纸进行检测。
其中，试剂A为6wt％硼氢化钾溶液；试剂B为0.23g盐酸羟胺、0.24g对甲苯磺酸、5ml乙酸铵混合后加水至100ml混匀所得；试剂C为乙腈；试剂D为2.6g氧化铝粉末、2.73g无水氯化钙和0.67g氯化钠的混合物；试剂E为6wt％乙酸-乙酸铵缓冲液；试剂F为0.2mol/L乙酸铵溶液和乙腈的等体积混合物；试剂G为0.2mol/L乙酸铵溶液。
【结果判定】
检测结果为阳性，判断该鱼样中含有超过检出限的孔雀石绿、隐色孔雀石绿。
经国标GB/T19857-2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》方法确认该样本中含有孔雀石绿、隐色孔雀石绿8ppb。
实施例4
本实施例的提取和检测水产品中孔雀石绿的方法包括以下步骤：
1.取切碎的去除脂肪组织的待测样本d，用均质机均质得到均质物；
2.称取3g所述均质物于离心管中，加入1.5ml 6wt％硼氢化钾溶液，振荡混匀35s，加入3ml试剂B，3ml试剂C，剧烈振荡3.5min，再加入5.3g试剂D，剧烈振荡1.5min后，室温下5000转/分钟离心4min；
3.移取1.2ml上清液于反应管中，加入7ml试剂E，混匀3min后作为上样液；
4.将所述上样液通过固相萃取柱，完全过柱并吹干所述固相萃取柱后，向所述固相萃取柱中加500μl试剂F进行洗脱，收集洗脱液待测定；
5.向放置有胶体金颗粒的金标微孔中滴加3滴上述洗脱液以及6滴试剂G，混匀2min后，滴加至胶体金免疫层析纸进行检测。
其中，试剂A为5wt％硼氢化钾溶液；试剂B为0.23g盐酸羟胺、0.24g对甲苯磺酸、5ml乙酸铵混合后加水至10ml混匀所得；试剂C为乙腈；试剂D为2.5g氧化铝粉末、2.5g无水硫酸钠和0.2g氯化钠的混合物；试剂E为2wt％乙酸-乙酸铵缓冲液；试剂F为0.2mol/L乙酸铵溶液和乙腈等体积混合，再加入氨水调节至pH值为9～11后所得；试剂G为0.2mol/L乙酸铵溶液。
【结果判定】
检测结果为阳性，判断该鱼样中含有超过检出限的孔雀石绿、隐色孔雀石绿。
经国标GB/T19857-2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》方法确认该样本中含有孔雀石绿、隐色孔雀石绿10ppb。
实施例5
本实施例的提取和检测水产品中孔雀石绿的方法包括以下步骤：
1.取切碎的去除脂肪组织的待测样本e，用均质机均质得到均质物；
2.称取3g所述均质物于离心管中，加入2ml 6wt％硼氢化钾溶液，振荡混匀25s，加入4ml试剂B，4ml试剂C，剧烈振荡3min，再加入5g试剂D，剧烈振荡2min后，室温下4000转/分钟离心5min；
3.移取1.2ml上清液于反应管中，加入8ml试剂E，混匀2min后作为上样液；
4.将所述上样液通过固相萃取柱，完全过柱并吹干所述固相萃取柱后，向所述固相萃取柱中加入400ul试剂F进行洗脱，收集洗脱液待测定；
5.向放置有胶体金颗粒的金标微孔中滴加3滴上述洗脱液以及3滴试剂G，混匀2min后，滴加至胶体金免疫层析纸进行检测。
其中，试剂A为6wt％硼氢化钾溶液；试剂B为0.23g盐酸羟胺、0.24g对甲苯磺酸、5ml乙酸铵混合后加水至55ml混匀所得；试剂C为乙腈；试剂D为3g氧化铝粉末和2g无水氯化钙的混合物；试剂E为6wt％乙酸-乙酸铵缓冲液；试剂F为0.1mol/L乙酸铵溶液和乙腈的等体积混合物；试剂G为0.2mol/L乙酸铵溶液。
【结果判定】
检测结果为阴性，判断该鱼样中不含有超过检出限的孔雀石绿、隐色孔雀石绿。
经国标GB/T19857-2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》方法确认该样本中不含有孔雀石绿、隐色孔雀石绿。
实施例6
本实施例的提取和检测水产品中孔雀石绿的方法包括以下步骤：
1.取切碎的去除脂肪组织的待测样本f，用均质机均质得到均质物；
2.称取3g所述均质物于离心管中，加入2ml 6wt％硼氢化钾溶液，振荡混匀25s，加入4ml试剂B，4ml试剂C，剧烈振荡3min，再加入5.4g试剂D，剧烈振荡2min后，室温下4000转/分钟离心5min；
3.移取1.2ml上清液于反应管中，加入8ml试剂E，混匀2min后作为上样液；
4.将所述上样液通过固相萃取柱，完全过柱并吹干所述固相萃取柱后，向所述固相萃取柱中加入400μl试剂F进行洗脱，收集洗脱液待测定；
5.将洗脱液采用液相色谱-串联质谱法测定，并用内标法定量。
其中，试剂A为6wt％硼氢化钾溶液；试剂B为0.23g盐酸羟胺、0.24g对甲苯磺酸、5ml乙酸铵混合后加水至55ml混匀所得；试剂C为乙腈；试剂D为3g氧化铝粉末、2g无水氯化钙和0.4g氯化钠的混合物；试剂E为4wt％乙酸-乙酸铵缓冲液；试剂F为0.1mol/L乙酸铵溶液和乙腈的等体积混合物。
【结果判定】
测得该鱼样中含有孔雀石绿、隐色孔雀石绿6ppb。
经国标GB/T19857-2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》方法确认该样本中含有孔雀石绿、隐色孔雀石绿6ppb。
对比例1
本实施例的提取和检测水产品中孔雀石绿的方法包括以下步骤：
1.取同实施例1的待测样本a，用均质机均质得到均质物；
2.称取3g所述均质物于离心管中，加入2ml 6wt％硼氢化钾溶液，振荡混匀25s，加入4ml试剂B，4ml试剂C，剧烈振荡3min，再加入3g试剂D，剧烈振荡2min后，室温下4000转/分钟离心5min；
3.移取1.2ml上清液于反应管中，加入8ml试剂E，混匀2min后作为上样液；
4.将所述上样液通过固相萃取柱，完全过柱并吹干所述固相萃取柱后，向所述固相萃取柱中加入500μl试剂F进行洗脱，收集洗脱液待测定；
5.向放置有胶体金颗粒的金标微孔中滴加3滴上述洗脱液以及3滴试剂G，混匀2min后，滴加至胶体金免疫层析纸进行检测。
其中，试剂A为6wt％硼氢化钾溶液；试剂B为0.23g盐酸羟胺、0.24g对甲苯磺酸、5ml乙酸铵混合后加水至55ml混匀所得；试剂C为乙腈；试剂D为氧化铝粉末；试剂E为4wt％乙酸-乙酸铵缓冲液；试剂F为0.1mol/L乙酸铵溶液和乙腈的等体积混合物；试剂G为0.2mol/L乙酸铵溶液。
【结果判定】
检测结果为阴性，判断该鱼样中不含有超过检出限的孔雀石绿、隐色孔雀石绿。
经国标GB/T19857-2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》方法确认该样本中含有孔雀石绿、隐色孔雀石绿5ppb。
对比例2
本实施例的提取和检测水产品中孔雀石绿的方法包括以下步骤：
1.取同实施例6的待测样本f，用均质机均质得到均质物；
2.称取3g所述均质物于离心管中，加入2ml 6wt％硼氢化钾溶液，振荡混匀25s，加入4ml试剂B，4ml试剂C，剧烈振荡3min，再加入7g试剂D，剧烈振荡2min后，室温下4000转/分钟离心5min；
3.移取1.2ml上清液于反应管中，加入8ml试剂E，混匀2min后作为上样液；
4.将所述上样液通过固相萃取柱，完全过柱并吹干所述固相萃取柱后，向所述固相萃取柱中加入400μl试剂F进行洗脱，收集洗脱液待测定；
5.将洗脱液采用液相色谱-串联质谱法测定，并用内标法定量。
其中，试剂A为6wt％硼氢化钾溶液；试剂B为0.23g盐酸羟胺、0.24g对甲苯磺酸、5ml乙酸铵混合后加水至55ml混匀所得；试剂C为乙腈；试剂D为3g氧化铝粉末、2g无水氯化钙和2g氯化钠的混合物；试剂E为4wt％乙酸-乙酸铵缓冲液；试剂F为0.1mol/L乙酸铵溶液和乙腈的等体积混合物。
【结果判定】
测得该鱼样中含有孔雀石绿、隐色孔雀石绿3ppb。
经国标GB/T19857-2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》方法确认该样本中含有孔雀石绿、隐色孔雀石绿6ppb。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种检测水产品中孔雀石绿的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取切碎的去除脂肪组织的待测样本，用均质机均质得到均质物；
(2)取所述均质物置于离心管中，每3g所述均质物，对应加入1.5～2.5ml试剂A，振荡混匀，加入3～5ml试剂B，3～5ml试剂C，剧烈振荡后，再加入5～6g试剂D，剧烈振荡后，室温下以3000～5000转/分钟进行离心，取上清液；
(3)移取步骤(2)中所述上清液于反应管中，每1.2ml所述上清液，对应加入7～9ml试剂E，混匀后作为上样液；
(4)将所述上样液通过固相萃取柱，完全过柱并吹干所述固相萃取柱后，向所述固相萃取柱中加入试剂F进行洗脱，收集洗脱液进行检测；
所述检测水产品中孔雀石绿的方法还包括以下步骤：
向放置有胶体金颗粒的金标微孔中滴加所述洗脱液以及0.1～0.2mol/L乙酸铵溶液，混匀后，滴加至胶体金免疫层析纸进行检测；
滴加的所述乙酸铵溶液的体积不少于所述洗脱液的体积；
所述试剂A为5wt％～7wt％硼氢化钾溶液；
每10ml～100ml所述试剂B含有0.23g盐酸羟胺、0.24g对甲苯磺酸、5ml乙酸铵；
所述试剂C为乙腈；
所述试剂D包括氧化铝粉末以及无水氯化钙和/或无水硫酸钠，所述氧化铝粉末与所述无水氯化钙和/或无水硫酸钠的质量比值为0.6～1.5，所述试剂D还包括氯化钠，所述氯化钠与所述氧化铝粉末以及无水氯化钙和/或无水硫酸钠的质量比值为0.04～0.12；
所述试剂E为2wt％～6wt％乙酸-乙酸铵缓冲液；
所述试剂F包括0.1～0.2mol/L乙酸铵溶液和乙腈的等体积混合物。
2.如权利要求1所述的检测水产品中孔雀石绿的方法，其特征在于，所述试剂D为2.6g氧化铝粉末、2.73g无水氯化钙和0.67g氯化钠的混合物。
3.如权利要求1所述的检测水产品中孔雀石绿的方法，其特征在于，所述试剂E为4wt％乙酸-乙酸铵缓冲液。
4.如权利要求1所述的检测水产品中孔雀石绿的方法，其特征在于，在步骤(3)中，加入所述试剂E之前，还包括以下步骤：
向所述反应管中加入90～110μl二甘醇，振荡混匀。
5.如权利要求1所述的检测水产品中孔雀石绿的方法，其特征在于，步骤(4)中所述试剂F加入量为400～500μl。
6.如权利要求1所述的检测水产品中孔雀石绿的方法，其特征在于，所述试剂F为0.1～0.2mol/L乙酸铵溶液和乙腈等体积混合，再加入氨水调节至pH值为9～11后所得。
7.如权利要求1所述的检测水产品中孔雀石绿的方法，其特征在于，所述固相萃取柱为以丙磺酸键合硅胶为填料的强阳离子交换型萃取柱。
8.如权利要求1～7任一项所述的检测水产品中孔雀石绿的方法，其特征在于，所述试剂B为0.23g盐酸羟胺、0.24g对甲苯磺酸、5ml乙酸铵混合后加水至100ml混匀所得。
9.如权利要求8所述的检测水产品中孔雀石绿的方法，其特征在于，滴加的所述乙酸铵溶液的体积为所述洗脱液的体积的1.5～2倍。
10.如权利要求8所述的检测水产品中孔雀石绿的方法，其特征在于，所述胶体金免疫层析纸上具有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线含有孔雀石绿抗原，所述质控线含有能与所述孔雀石绿抗原特异结合的抗体；
若检测线显色比质控线深或一样深，则为阴性，表示样本中孔雀石绿的浓度低于检出限；
若检测线显色明显比质控线浅，或检测线呈绿色，则为阳性，表示样本中孔雀石绿的浓度高于检出限；
若质控线未显色，则判断为操作不当或所述胶体金免疫层析纸已失效。
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