CN109633045A - 一种液相色谱串联质谱同时测定水产品中6种色素残留量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种液相色谱串联质谱同时测定水产品中6种色素残留量的方法，包括如下步骤：S1.称取水产样品，加入提取液进行提取，再固相萃取净化，然后浓缩、定容、过滤后即得待测试样，配制溶剂标准和基质标准曲线；S2.将S1中所得待测试样经过液相色谱串联质谱同时测定6种色素的残留量，以保留和离子碎片丰度比时间定性，定量离子峰面积外标法定量；本发明利用液相色谱串联三重四级杆质谱以保留和离子碎片丰度比时间定性，定量离子峰面积外标法定量同时测定6种水产品禁用色素残留量。经过优化后，水产品中目标物回收率达到80.0%～116%，24h内精密度和稳定性测试RSD≤15%，亚甲基蓝、孔雀石绿、亮绿、隐色孔雀石绿、结晶紫及隐色结晶紫线性范围在0.1μg/kg～20μg/kg之间线性良好，具有较大的应用前景。

Description

一种液相色谱串联质谱同时测定水产品中6种色素残留量的 方法

技术领域

本发明涉及化学检测技术领域，更具体地，涉及一种液相色谱串联质谱同时测定水产品中6种色素残留量的方法。

背景技术

孔雀石绿(malachite green，MG)和结晶紫(crystalviolet，CV)属于三苯甲烷类染料，对鱼类的水霉病、寄生虫病等有很好的疗效，长期以来，许多国家曾将其作为水产养殖业的杀菌剂。它们在鱼体内可代谢为隐色孔雀石绿(Leucomalachite green，LMG)和隐色结晶紫(leucocrystal violet，LCV)；由于这两种化合物及其代谢物均具有潜在的致癌、致畸、致突变等副作用，近20年来许多国家陆续将其列为水产养殖行业的禁用药物。

亚甲基蓝(methylene blue，MB)又名次甲基蓝、碱性湖蓝、美蓝，是一种人工合成的噻嗪类染料，曾成功用于治疗细菌性疟疾，也是首例用于治疗疾病的人工合成化学品。亚甲基蓝对淡水鱼的水霉病、红嘴病、小瓜虫病等有很好的疗效，由于其毒性比孔雀石绿低，近年来做为孔雀石绿、硝基呋喃等禁药的替代品在水产品养殖中得到了广泛应用。另外，亚甲基蓝也被用作抗真菌剂，用来降低鱼类运输途中的死亡率。由于亚甲基蓝及其代谢物被认为对动物体有毒性并有致突变作用，在美国、日本禁止用于水产养殖。

亮绿(brilliant green，BG)与孔雀石绿同属三苯甲烷类化学物质，其毒性与孔雀石绿一致，具有潜在的致癌、致畸、致突变等副作用。

然而由于上述染料具有高效、价格低廉等优点，因而在水产养殖中违法使用的情况仍然很多，因此建立检测水产品中上述染料微量残留的方法十分必要。

现有的主要检测对象都集中在孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物的检测方法以及亚甲基蓝及其代谢产物的检测方法(张玉黔,权伍英,栾燕.液相色谱-串联质谱法测定水产品中孔雀石绿及其代谢产物隐性孔雀石绿的方法研究[J].中国卫生检验杂志,2006,16(7):826-827.；周贻兵,吴坤,刘利亚,等.超高效液相色谱-串联质谱法测定鱼中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物残留量[J].质谱学报,2013,34(5):294-299.；曾思瑜,蒲红,夏苏捷,等.养殖水中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、亚甲基蓝残留量的测定[J].食品安全质量检测学报,2018(5).；张志刚,施冰,陈鹭平,等.液相色谱法同时测定水产品中孔雀石绿和结晶紫残留[J].分析化学,2006,34(5):663-667.)；惠芸华,张璇,黄冬梅,等.高效液相色谱-串联质谱法同时测定草鱼中6种阳离子染料残留量[J].分析科学学报,2015,31(4):533-536，关于亮绿的检测方法较少，而同时测定孔雀石绿、隐色孔雀石绿、甲基蓝、亮绿、结晶紫和隐色结晶紫这6种色素的方法目前还未见报道，无法满足实际的检测需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术检测方法的不足，提供一种同时同时测定水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、甲基蓝、亮绿、结晶紫和隐色结晶紫这6种禁用色素残留的、准确灵敏可靠的液相色谱串联三重四级杆质谱联用仪的检测方法，可根据保留时间和离子丰度比值进行定性，定量离子进行定量，提高方法的准确度。

本发明的第一个目的是提供一种同时提取水产品种6种色素的方法。

本发明的第二个目的是提供一种液相色谱串联质谱同时测定水产品中6种色素残留量的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种同时提取水产品种6种色素的方法，包括如下步骤：

S1.称取待测水产样品，加入乙腈进行提取，离心；

S2.取S1的提取液，经中性氧化铝柱净化，流出液用乙腈洗涤；

S3.取S2的提取液，经MCX，SCX，PRS柱净化，流出液依次用水、乙腈洗涤，弃去滤液，用5％氨化甲醇洗脱液洗脱，收集洗脱液；

所述6种色素为孔雀石绿、隐色孔雀石绿、甲基蓝、亮绿、结晶紫和隐色结晶紫。

优选地，S1待测水产样品与乙腈的质量体积比为1：2～4g/mL。

优选地，S1所述提取次数为2～3次，每次提取时间为25～25min。

一种液相色谱串联质谱同时测定水产品中6种色素残留量的方法，包括如下步骤：

S1.按上述任一所述方法对待测样品进行前处理，然后浓缩、定容、过滤后即得待测试样，空白样品基质配标；

S2.将S1中所得待测试样经过液相色谱串联质谱同时测定6种色素的残留量，以保留和离子碎片丰度比时间定性，定量离子峰面积外标法定量；

所述液相色谱条件：色谱柱：XBridge-BEH C18；进样量：2μL；流速：0.4mL/min；梯度洗脱，洗脱液A为含0.1％甲酸的5mmol/L乙酸铵溶液，洗脱液B为乙腈溶液，洗脱程序为：起始比例A相为90％，B相为10％，维持1.2min；1.2～3.5min，A相降至10％，B相升至90％，维持至4.5min；4.5～4.51min，A相降至0％，B相升至100％，维持至5.5min；5.5～6.5min，A相升至90％，B相降至10％，维持至7min；

质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描(ESI+)；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子源温度：150℃；脱溶剂温度450℃；脱溶剂气流量：1000L/hr；锥孔气流量：20L/hr；毛细管电压0.5kV。

作为一种优选地实施方式，待测样品的前处理方式包括如下步骤：

(1)称取水产品样品约5～7g(精确到0.01g)于聚乙烯离心管中，加乙腈10～15mL震荡提取20～30min，离心，将上清液转移到容量瓶中，重复上述操作提取1～3次，合并上清液并定容至刻度；

(2)取5～7mL提取液，加入活化好的中性氧化铝于小柱中，接收流出液，并用5～7mL乙腈洗涤；

(3)取5～7mL提取液，加入活化好的MCX，SCX，PRS小柱，并依次用5～7mL水、5～7mL乙腈洗涤，弃去滤液，用5％氨化甲醇洗脱液洗脱，收集洗脱液。

(4)将洗脱液于40～50℃水浴中氮吹至接近干；

(5)用2mL乙腈和乙酸铵溶液(1:1)复溶，过0.22um滤膜，装瓶，上机。

优选地，S1所述空白样品基质配标为称取不含孔雀石绿、隐色孔雀石绿、甲基蓝、亮绿、结晶紫和隐色结晶紫的阴性水产品，按照上述待测样品的提取方法提取得到提取液，将所述提取液作为溶剂与色素标准品溶液混合而成配成基质混合标准工作溶液，外标法定量；用高效液相色谱串联质谱法测定6种色素与空白样品基质混合标准工作溶液中各色素组分的提取离子峰面积，以浓度为横坐标，以提取离子峰面积为纵坐标，绘制出6种色素的标准工作曲线。

本发明检测方法为：高效液相色谱串联质谱法测定水产样品提取净化液中的6种色素残留量，记录提取离子峰面积，基质外标法定量，得到所述水产品样品提取净化液中6种色素的测定值；再将所述测定值带入到定量计算公式中，最终得到水产样品中待测6种色素残留量；

定量计算公式：w＝(p×v×f)/m，式中：w为样品中待测6种色素残留量，单位为mg/kg；p为测定值，单位为ng/mL；m为称取的样品量，单位为g；v为定容体积，单位为mL；f为稀释倍数。

优选地，所述色谱柱为2.1mm×100mm，2.5μm。

优选地，所述液相色谱串联质谱为液相色谱串联三重四级杆质谱。

优选地，所述水产品为养殖型淡水鱼；例如，待测样本可以为为集中常见养殖型淡水鱼(青鱼、草鱼、鲤鱼、鲫鱼、鲶鱼、鲢鱼、罗非鱼等)鱼肉按等质量比混和成的肉糜。

经过发明人的长期摸索总结，样品提取及检测方法的构建及检测条件的选择是能否实现快速准确地同时测定水产品中这6种色素的关键因素。通过控制上述条件，可以快速、灵敏、重现性好并且回收率高地检测水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、甲基蓝、亮绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种同时测定水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、甲基蓝、亮绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量的方法，利用液相色谱串联三重四级杆质谱以保留和离子碎片丰度比时间定性，定量离子峰面积外标法定量同时测定6种水产品禁用色素残留量。经过优化后，水产品中目标物回收率达到80.0％～116％，24h内精密度和稳定性测试RSD≤15％，亚甲基蓝、孔雀石绿、亮绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫线性范围在0.1μg/kg～20μg/kg之间线性良好，具有较大的应用前景。

附图说明

图1为本发明采用5mmol/L乙酸铵(0.1％甲酸)-乙腈流动相对6种色素分离效果比较。

图2为本发明检测方法的6种色素的标准品溶剂标准曲线和基质标准曲线。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。以下为本发明具体实施方式用到的仪器和试剂

液相色谱三重四级杆串联质谱仪(Waters Xevo TQD)

标准物质：6种色素标品(孔雀石绿、隐色孔雀石绿、甲基蓝、亮绿、结晶紫和隐色结晶紫)

色谱纯试剂：乙腈、甲醇、乙醇(CNW 4L)

质谱级试剂：甲酸、乙酸铵(Fisher)

净化柱：ALN，MCX，SCX，PRS固相萃取小柱。

实施例1前处理条件优化

1、通过对比甲醇、乙腈、乙醇三种提取剂对水产品中色素的提取效果，旨在找出一种水产品中6种色素较好的提取溶剂，对比不同溶剂的提取效率，其结果如表1所示，发现乙腈对6种色素的提取效果较好；因此选择乙腈对这6种色素进行提取。

表1三种溶剂对6种色素及其代谢物提取效果比较

2、通过对比MCX(混合阳离子交换柱)、SCX(强阳离子交换柱)、PRS(丙磺酸小柱)、ALN(中性氧化铝)四种净化柱的对6种色素的净化效果，旨在找出一种比较好的净化方式。对比不同溶剂的净化柱净化效果，其净化结果如表2所示，发现中性氧化铝对6种色素的净化效果较好；因此选择中性氧化铝净化柱对6种色素进行净化处理。

表2四种净化柱对6种色素净化效果比较

实施例2流动相优化

为了寻找一种能够完全分离孔雀石绿、隐色孔雀石绿、甲基蓝、亮绿、结晶紫和隐色结晶紫这6种色素的流动相。以5mmol/L乙酸铵-乙腈为流动相，采用梯度洗脱，发现6种峰有重叠现象，分离不完全且峰形较丑。在乙酸铵中加入0.1％甲酸，其分离结果如图1所述，可见峰型对称，响应较高；因此选择5mmol/L乙酸铵(0.1％甲酸)-乙腈为流动相。

实施例3液相色谱串联三重四级杆质谱测定水产品中6种色素残留量的方法

1、标准溶液的制备

(1)6种色素标准储备液：称取各标准物质适量，用乙腈溶解并稀释成浓度约为100ng/mL的标准储备液。

(2)混合标准使用液：用流动相配制混合标准使用液，使各物质浓度浓度为：10ng/mL、5ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、0.05ng/mL

2、样品溶液的制备

(1)称取水产品样品(青鱼、草鱼、鲤鱼、鲫鱼、鲶鱼、鲢鱼、罗非鱼的鱼肉按等质量比混和成的肉糜)约5g(精确到0.01g)于聚乙烯离心管中，加乙腈10mL震荡提取20min，离心，将上清液转移到25mL容量瓶中，重复上述操作提取1次，合并上清液并定容至刻度。

(2)取5mL提取液，加入活化好的中性氧化铝于小柱中，接收流出液，并用5mL乙腈洗涤。

(3)取5mL提取液，加入活化好的MCX，SCX，PRS小柱，并依次用5mL水、5mL乙腈洗涤，弃去滤液，用5％氨化甲醇洗脱液洗脱，收集洗脱液。

(4)将洗脱液于40℃水浴中氮吹至接近干。

(5)用2mL乙腈和乙酸铵溶液(1:1)复溶，过0.22um滤膜，装瓶，上机。

3、色谱条件

所述经过优化的液相色谱条件：色谱柱：XBridge-BEH C18(2.1mm×100mm，2.5μm)；进样量：2μL；流速：0.4mL/min；梯度洗脱，洗脱液A为5mmol/L乙酸铵(含0.1％甲酸水)溶液，洗脱液B为乙腈溶液，洗脱程序见表3。

表3梯度洗脱程序

4、质谱条件

电喷雾离子源，正离子扫描(ESI+)；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子源温度：150℃；脱溶剂温度450℃；脱溶剂气流量：1000L/hr；锥孔气流量：20L/hr；毛细管电压0.5kV。雾化气、去溶剂气、辅助热气为高纯氮气、碰撞气为高纯氩气。其他电压值、监测离子对、定量离子对等见表4。

表4 6种色素的质谱测定参数

备注：“*”表示定量离子。

5、基质配标准工作曲线

以空白样品基质配标，外标法定量。任何测定方法都存在基质效应，基质效应不能被消除，但可以通过基质配标准工作曲线，对基质效应进行校正，相比传统的溶剂配制标准工作曲线，其定量准确性更高。

按照实施例1～2样品前处理步骤提取不含目标化合物的“空白”样品，并把提取液与标准品溶液混合而成，配成基质混合标准工作溶液，外标法定量，空白样品基质配标的浓度范围与混合标准使用液相同。

用高效液相色谱串联质谱法测定6种色素与空白样品基质混合标准工作溶液中各色素组分的提取离子峰面积，以浓度为横坐标，以提取离子峰面积为纵坐标，绘制出6种色素的标准工作曲线；

通过配制溶剂标准和基质标准曲线，通过其斜率进行计算：ME(％)＝(基质标曲斜率/溶剂标曲斜率-1)×100；弱基质效应(ME为0％-20％)；中等基质效应(ME为20％-50％)；强基质效应(ME＞50％)；若为负值则是负效应。其结果如图2所示，可知，利用液相质谱测定水产品中6种色素以基质效应增强为主。

6、上机数据采集：取标准溶液和样品溶液各2μL注入气相质谱仪，通过保留时间和离子丰度比定性、定量离子峰面积定量。上述条件得出的6种色素的出峰情况和定量定性离子的选择，其结果如表5所示。

具体为高效液相色谱串联质谱法测定水产样品提取净化液中的6种色素残留量，记录提取离子峰面积，基质外标法定量，得到所述水产品样品提取净化液中6种色素的测定值；再将所述测定值带入到定量计算公式中，最终得到水产样品中待测6种色素残留量；

定量计算公式：w＝(p×v×f)/m，式中：w为样品中待测6种色素残留量，单位为mg/kg；p为测定值，单位为ng/mL；m为称取的样品量，单位为g；v为定容体积，单位为mL；f为稀释倍数。

表5本发明6种色素的出峰情况和定量定性离子的选择

实施例4检测方法性能验证

分析实施例3所述检测方法标准曲线的线性，方法的最低检测限，最低定量限，回收率(准确度)和重复性、重现性(精密度)等。

1、标准曲线线性

6种色素混合储备液：移取各标准物质适量，用乙腈溶解并稀释成浓度为100ng/mL的储备液。

混合标准使用液：用空白样品基质配制混合标准使用液，使各物质浓度为：10ng/mL、5ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、0.05ng/mL，具体如表6

本发明各物质在0.05～10ng/mL范围具有良好的线性关系，相关系数均大于0.995，其线性关系如表6所示：

表6本发明检测方法的线性范围

2、检出限和定量限

取标准溶液进行测试，以信噪比为3时候的浓度为检出限，信噪比为10时的浓度为定量限，结果如表7所示：

表7本发明检测方法的检出限和定量限

3、精密度

6种色素混合储备液：移取各标准物质适量，用乙腈溶解并稀释成浓度为100ng/mL的储备液。以0.010mg/kg的含量标准按实施例3进行加标回收率的实验，每种色素的加标回收实验重复6次，其结果如表8所示。

表8本发明检测方法的精密度

4、准确度

各称取三份混合均匀的样品5g(精确到0.01g)置于小烧杯中，按照下表加入标准溶液，按照实施例3步骤2制备好供试液，进行测试，计算回收率。其结果如表9～11所示：

(1)水平一加标回收率(1μg/kg)

表9水平一加标回收率

(2)水平二加标回收率(2μg/kg)

表10水平二加标回收率

(3)水平三加标回收率(4μg/kg)

表11水平三加标回收率

从上述结果可以看出，本发明利用液相色谱串联三重四级杆质谱以保留和离子碎片丰度比时间定性，定量离子峰面积外标法定量同时测定6种水产品禁用色素残留量。

经过优化后，水产品中目标物回收率达到80.4％～115.6％，24h内精密度和稳定性测试RSD≤15％，亚甲基蓝、孔雀石绿、亮绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫线性范围在0.1μg/kg～20μg/kg之间线性良好。

Claims (8)

1.一种同时提取水产品种6种色素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.称取待测水产样品，加入乙腈进行提取，离心；

S2.取S1的提取液，经中性氧化铝柱净化，流出液用乙腈洗涤；

S3.取S2的提取液，经MCX，SCX，PRS柱净化，流出液依次用水、乙腈洗涤，弃去滤液，用5%氨化甲醇洗脱液洗脱，收集洗脱液；

所述6种色素为孔雀石绿、隐色孔雀石绿、甲基蓝、亮绿、结晶紫和隐色结晶紫。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1待测水产样品与乙腈的质量体积比为1：2～4 g/mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1所述提取次数为2～3次，每次提取时间为25～25min。

4.一种液相色谱串联质谱同时测定水产品中6种色素残留量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.按权利要求1～3任一项所述方法对待测样品进行预处理，然后浓缩、定容、过滤后即得待测试样，空白样品基质配标；

S2.将S1中所得待测试样经过液相色谱串联质谱同时测定6种色素的残留量，以保留和离子碎片丰度比时间定性，定量离子峰面积外标法定量；

所述液相色谱条件：色谱柱：XBridge-BEH C18；进样量：2μL；流速：0.4mL/min；梯度洗脱，洗脱液A为含0.1%甲酸的5mmol/L乙酸铵溶液，洗脱液B为乙腈溶液，洗脱程序为：起始比例A相为90%，B相为10%，维持1.2min；1.2～3.5min，A相降至10%，B相升至90%，维持至4.5min；4.5～4.51min，A相降至0%，B相升至100%，维持至5.5min；6.5～6.5min，A相升至90%，B相降至10%，维持至7min；

质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描（ESI+）；扫描方式：多反应监测（MRM）；离子源温度：150℃；脱溶剂温度450℃；脱溶剂气流量：1000L/hr；锥孔气流量：20 L/hr；毛细管电压0.5 kV；

所述6种色素为孔雀石绿、隐色孔雀石绿、甲基蓝、亮绿、结晶紫和隐色结晶紫。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S1所述空白样品基质配标为称取不含孔雀石绿、隐色孔雀石绿、甲基蓝、亮绿、结晶紫和隐色结晶紫的阴性水产品，按照待测样品的提取方法提取得到提取液，将提取液与标准品溶液混合而成，用高效液相色谱串联质谱法测定6种色素与空白样品基质混合标准工作溶液中各色素组分的提取离子峰面积，以浓度为横坐标，以提取离子峰面积为纵坐标，绘制出6种色素的标准工作曲线。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为2.1mm×100mm，2.5μm。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱为液相色谱串联三重四级杆质谱。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水产品为养殖型淡水鱼。