CN103983703A - 一种水产养殖水体中亚甲基蓝的高效液相色谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水产养殖水体中亚甲基蓝的高效液相色谱检测方法，将水体经预处理后利用二氯甲烷萃取经旋转蒸发仪抽真空浓缩净化，液相色谱-紫外检测器检测，外标法进行定量分析。本发明方法操作方便，重现性较好，定性准确且回收率较高，能够快速分析水产养殖水体环境中的亚甲基蓝含量。

Description

一种水产养殖水体中亚甲基蓝的高效液相色谱检测方法

技术领域

本发明涉及环境质量安全检测技术领域，特别涉及一种水产养殖水体中亚甲基蓝的高效液相色谱检测方法。

背景技术

亚甲基蓝属于一种化学指示剂、工业染料、生物染色剂和药物，其毒性比孔雀石绿低，近年来作为孔雀石绿、硝基呋喃等禁药的替代品在水产品养殖中得到了广泛应用，它可防治真菌引起的链壶菌病、水霉病和寄生虫病等在水产养殖中经常用来治疗水霉病以及给养殖水体环境消毒等。亚甲基蓝的大量使用或滥用对养殖水生物会产生一定的毒副作用，实际生产中很难掌握用药浓度, 导致在水生生物体中积累一定量的残留物，对食品安全和人类健康构成新的隐患。亚甲基蓝对人的眼睛以及皮肤都有着严重的伤害，误食亚甲基蓝或体内摄入亚甲基蓝过量对人体有害。此外，有研究表明亚甲基蓝有致畸作用，大量使用或滥用对养殖生物会产生毒副作用，所以日本和美国都不允许将其用于水产养殖中。

控制养殖水体环境中的亚甲基蓝可以直接减少水生生物体对亚甲基蓝的生物富集作用，能有效控制养殖水产品体内亚甲基蓝的摄入量。目前水产品及养殖水体环境中的亚甲基蓝的含量已经引起了相关部门的高度重视，并已开始研究制定水产品中亚甲基蓝含量的检测标准。监测水产养殖水体环境中亚甲基蓝含量水平对了解养殖环境安全状况、控制养殖水生物过多摄入亚甲基蓝和水产品质量安全监管工作具有积极意义。而对于水产养殖水体环境中亚甲基蓝含量的检测，目前还没有相关的检测方法。根据亚甲基蓝的化学性质选择适合的前处理方法，优化仪器分析条件，采用液相色谱法进行测定。建立一种回收率高、重现性好和精确度高的产养殖水体环境中亚甲基蓝含量的检测方法。通过简化实验步骤，提高了前处理效率，适用于各级各类质检机构对水产养殖水体环境中亚甲基蓝的实际检测，对环境质量安全监测工作具有重要意义。

已发布的有关水产品中亚甲基蓝的检测方法有中国药典1990 年版( 二部) 规定的间接碘量法和分光光度法，但该方法不适用于检测养殖水体中的亚甲基蓝。而更好的控制水产养殖水体环境中的亚甲基蓝含量以降低养殖水生物对亚甲基蓝的生物富集是目前亟需解决的问题，因此，亟需建立一种有效的检测水产养殖水体环境中的亚甲基蓝含量的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水产养殖水体中亚甲基蓝的高效液相色谱检测方法，具有较高的灵敏度和精确度，操作简单易行，重现性较好，定性准确且回收率较高，检测成本低廉，能够快速分析水产养殖水体环境中的亚甲基蓝含量，对及时掌握养殖水体环境质量状况具有重要意义。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 

一种水产养殖水体中亚甲基蓝的高效液相色谱检测方法，包括如下步骤：

（1）水样预处理：采集水样，然后用微孔滤膜进行抽滤处理，抽滤后所得滤液转移至样品瓶中；

（2）萃取及净化：向滤液中加入色谱纯二氯甲烷萃取，振荡1-2min后静置分层，把下层二氯甲烷转移到旋蒸瓶中，40-45 ℃下旋转蒸发仪抽真空浓缩至蒸干，取下旋蒸瓶之后往旋蒸瓶中准确加入1.0 mL甲醇溶解残留物，并用胶头吸管伸入旋蒸瓶中利用加入的甲醇清洗旋蒸瓶内壁，静置旋蒸瓶待内壁上的液体完全流下，用注射器将旋蒸瓶中液体取出，经微孔滤膜过滤后得待检测液；

（3）液相色谱-紫外检测器检测：待检测液经微孔滤膜过滤到样品瓶中，在已设定的液相色谱-紫外检测条件下进行定性定量分析。

作为优选，步骤（2）中滤液：二氯甲烷的体积比为=2.5-5:1。

作为优选，步骤（3）中液相色谱-紫外检测条件为：色谱条件：SunFireTM C18柱，5μm，250 mm ×4.6 mm；柱温：30-40 ℃；流动相：0.1%甲酸水溶液-乙腈（62:38，V/V）；流速：1.0 mL/min；进样量：50 μL；紫外检测波长：650-655nm。绘制标准工作曲线，以外标法定量计算亚甲基蓝的含量。

作为优选，所述微孔滤膜的孔径在0.22-0.45μm。

本发明的有益效果是：

1、本发明首次建立了水产养殖水体环境中亚甲基蓝的检测方法，采用液液萃取旋蒸浓缩净化，净化效果好，测定过程中基本上不会受到杂质的干扰。

2、采用液相色谱-紫外检测法进行检测，具有较高的灵敏度和精确度。

3、本发明在可对水体中的亚甲基蓝同时进行定性及定量测定，操作简单易行，重现性较好，定性准确且回收率较高，检测成本低廉，能够快速分析水产养殖水体环境中的亚甲基蓝含量。

4、对及时掌握养殖水体环境质量状况具有重要意义。

附图说明

图1是1.00mg/L的亚甲基蓝标准品溶液色谱图；

图2是亚甲基蓝标准曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

本发明的高效液相色谱仪为：美国Waters高效液相色谱仪型号：Waters 2695。

本发明的紫外检测器型号：Waters2489。

实施例1 

⑴水样预处理：采集水样500 mL到实验室后立即用0.45μm滤膜进行抽滤处理，抽滤所得滤液转移至样品瓶中。

⑵萃取及净化：选择250 mL分液漏斗检漏后放置在漏斗架上，准确量取滤液100 mL转移到250 mL分液漏斗中，加入40 mL色谱纯二氯甲烷萃取，振荡1 min后静置20 min，待分液漏斗中液体稳定且出现明显分层后，把下层二氯甲烷转移到100 mL旋蒸瓶中，在40 ℃下旋转蒸发仪抽真空浓缩至蒸干。取下旋蒸瓶之后往旋蒸瓶中准确加入1.0 mL甲醇溶解残留物，并用胶头吸管伸入瓶中利用加入的甲醇清洗旋蒸瓶内壁。静置旋蒸瓶待内壁上的液体完全流下，用注射器将瓶中液体取出，过0.22μm有机相微孔滤膜过滤后得待检测液。

⑶液相色谱-紫外检测器检测：待检测液经0.22μm有机相微孔滤膜过滤到样品小瓶中，在已设定的液相色谱-紫外检测条件下进行定性定量分析。色谱条件：SunFireTM C18柱，5 μm，250 mm ×4.6 mm；柱温：30 ℃；流动相：0.1%甲酸水溶液-乙腈（62:38，V/V）；流速：1.0 mL/min；进样量：50 μL；紫外检测波长：650 nm。绘制标准工作曲线，以外标法（现有常规方法）定量计算亚甲基蓝的含量。

⑷标准曲线绘制

用色谱甲醇配制浓度分别为0.05mg/L、0.10mg/L、0.20mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L的亚甲基蓝标准溶液（1.00mg/L的亚甲基蓝标准品溶液色谱图见图1），然后按照上述步骤⑶的要求进行操作，根据外标法要求绘制标准曲线（见图2）。

⑸方法回收率的测定

分别按0.06mg/L、0.10mg/L、0.25mg/L、0.50mg/L和0.80mg/L的浓度在养殖水样中添加亚甲基蓝标准溶液，每个添加水平分别做6个平行样；按照步骤⑴-⑷进行检测，并与上述得到的标准曲线比较，通过换算最终得到待测水体中亚甲基蓝的浓度。方法回收率在72-94 %，RSD＜12 %。

 

实施例2

⑴水样预处理：采集水样1000 mL到实验室后立即用0.45μm滤膜进行抽滤处理，抽滤所得滤液转移至样品瓶中。

⑵萃取及净化：选择500 mL分液漏斗检漏后放置在漏斗架上，准确量取滤液250 mL转移到500 mL分液漏斗中，加入50 mL色谱纯二氯甲烷萃取，振荡2min后静置30 min，待分液漏斗中液体稳定且出现明显分层后，把下层二氯甲烷转移到100 mL旋蒸瓶中，在45 ℃下旋转蒸发仪抽真空浓缩至蒸干。取下旋蒸瓶之后往旋蒸瓶中准确加入1.0 mL甲醇溶解残留物，并用胶头吸管伸入瓶中利用加入的甲醇清洗旋蒸瓶内壁。静置旋蒸瓶待内壁上的液体完全流下，用注射器将瓶中液体取出，过0.45μm有机相微孔滤膜过滤后得待检测液。

⑶液相色谱-紫外检测器检测：待检测液经0.45μm有机相微孔滤膜过滤到样品小瓶中，在已设定的液相色谱-紫外检测条件下进行定性定量分析。色谱条件：SunFireTM C18柱，5 μm，250 mm ×4.6 mm；柱温：40 ℃；流动相：0.1%甲酸水溶液-乙腈（62:38，V/V）；流速：1.0 mL/min；进样量：50 μL；紫外检测波长：655 nm。绘制标准工作曲线，以外标法定量计算亚甲基蓝的含量。

⑷标准曲线绘制

用色谱甲醇配制浓度分别为0.05mg/L、0.10mg/L、0.20mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L的亚甲基蓝标准溶液，然后按照上述步骤⑶的要求进行操作，根据外标法要求绘制标准曲线。

⑸方法回收率的测定

分别按0.06mg/L、0.10mg/L、0.25mg/L、0.50mg/L和0.80mg/L的浓度在养殖水样中添加亚甲基蓝标准溶液，每个添加水平分别做6个平行样；按照步骤⑴-⑷进行液相色谱-紫外检测器检测，并与上述得到的标准曲线比较，通过换算最终得到待测水体中亚甲基蓝的浓度。方法回收率在70～102 %，RSD＜15 %。

 

实施例3

⑴水样预处理：采集水样1000 mL到实验室后立即用0.45μm滤膜进行抽滤处理，抽滤所得滤液转移至样品瓶中。

⑵萃取及净化：选择500 mL分液漏斗检漏后放置在漏斗架上，准确量取滤液250 mL转移到500 mL分液漏斗中，加入60 mL色谱纯二氯甲烷萃取，振荡1 min后静置20 min，待分液漏斗中液体稳定且出现明显分层后，把下层二氯甲烷转移到100 mL旋蒸瓶中，在40 ℃下旋转蒸发仪抽真空浓缩至蒸干。取下旋蒸瓶之后往旋蒸瓶中准确加入1.0 mL甲醇溶解残留物，并用胶头吸管伸入瓶中利用加入的甲醇清洗旋蒸瓶内壁。静置旋蒸瓶待内壁上的液体完全流下，用注射器将瓶中液体取出，过0.22μm有机相微孔滤膜过滤后得待检测液。

⑶液相色谱-紫外检测器检测：待检测液经0.22μm有机相微孔滤膜过滤到样品小瓶中，在已设定的液相色谱-紫外检测条件下进行定性定量分析。色谱条件：SunFireTM C18柱，5 μm，250 mm ×4.6 mm；柱温：30 ℃；流动相：0.1%甲酸水溶液-乙腈（62:38，V/V）；流速：1.0 mL/min；进样量：50 μL；紫外检测波长：650 nm。绘制标准工作曲线，以外标法定量计算亚甲基蓝的含量。

⑷标准曲线绘制

用色谱甲醇配制浓度分别为0.05mg/L、0.10mg/L、0.20mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L的亚甲基蓝标准溶液，然后按照上述步骤⑶的要求进行操作，根据外标法要求绘制标准曲线。

⑸方法回收率的测定

分别按0.06mg/L、0.10mg/L、0.25mg/L、0.50mg/L和0.80mg/L的浓度在养殖水样中添加亚甲基蓝标准溶液，每个添加水平分别做6个平行样；按照步骤⑴-⑷进行液相色谱-紫外检测器检测，并与上述得到的标准曲线比较，通过换算最终得到待测水体中亚甲基蓝的浓度。方法回收率在78-96 %，RSD＜15 %。

 

实际样品检测：

在舟山市某海水养殖厂采集水样，按照本发明的方法进行检测，最终得到水体中亚甲基蓝的浓度平均值为0.21mg/L。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (4)

1.一种水产养殖水体中亚甲基蓝的高效液相色谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）水样预处理：采集水样，然后用微孔滤膜进行抽滤处理，抽滤后所得滤液转移至样品瓶中；

（2）萃取及净化：向滤液中加入色谱纯二氯甲烷萃取，振荡1-2min后静置分层，把下层二氯甲烷转移到旋蒸瓶中，40-45 ℃下旋转蒸发仪抽真空浓缩至蒸干，取下旋蒸瓶之后往旋蒸瓶中准确加入1.0 mL甲醇溶解残留物，并用胶头吸管伸入旋蒸瓶中利用加入的甲醇清洗旋蒸瓶内壁，静置旋蒸瓶待内壁上的液体完全流下，用注射器将旋蒸瓶中液体取出，经微孔滤膜过滤后得待检测液；

（3）液相色谱-紫外检测器检测：待检测液经微孔滤膜过滤到样品瓶中，在已设定的液相色谱-紫外检测条件下进行定性定量分析。

2.根据权利要求1所述的高效液相色谱检测方法，其特征在于：步骤（2）中滤液：二氯甲烷的体积比为=2.5-5:1。

3.根据权利要求1或2所述的高效液相色谱检测方法，其特征在于：步骤（3）中液相色谱-紫外检测条件为：色谱条件：SunFireTM C18柱，5μm，250 mm ×4.6 mm；柱温：30-40 ℃；流动相：0.1%甲酸水溶液-乙腈（62:38，V/V）；流速：1.0 mL/min；进样量：50 μL；紫外检测波长：650-655nm。绘制标准工作曲线，以外标法定量计算亚甲基蓝的含量。

4.根据权利要求1或2所述的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述微孔滤膜的孔径在0.22-0.45μm。