CN109507342B - 一种测定血液样品中硝基咪唑类药物残留的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种测定血液样品中硝基咪唑类药物残留的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)超分子溶剂的制备：采用正辛醇、四氢呋喃和水，搅拌离心后取上层有机相；(2)样品前处理：将血液样品置于超分子溶剂中，振荡提取、离心后移取上层液体过滤膜，滤液置于微量进样瓶中，加入甲醇，混匀得到待测液；(3)采用超高效液相色谱‑串联质谱法测定所述待测液中硝基咪唑类药物残留。本发明的方法简便快速、准确可靠，可用于血液样品中硝基咪唑类药物残留的分析检测。

Description

一种测定血液样品中硝基咪唑类药物残留的方法
技术领域
本发明涉及一种检测方法，特别是涉及一种测定血液样品中硝基咪唑类药物残留的方法。
背景技术
硝基咪唑类药物是一类具有5-硝基取代咪唑杂环结构的化合物，因具有独特的抗菌抗原虫作用，被广泛用于杀灭及预防厌氧菌和病原虫。常见的硝基咪唑类药物主要有甲硝唑、二甲硝咪唑、异丙硝唑、洛硝哒唑等。硝基咪唑类药物具有潜在的致癌、致畸和致突变性，其代谢物因同样含有咪唑环而具有与原药类似的毒性，因此中国、欧盟、美国等国家和地区禁止在动物源性食品中使用此类药物。目前，硝基咪唑类药物的检测方法主要有气相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、酶联免疫法等。其中液相色谱-串联质谱法因兼具灵敏度高、特异性好的优势，是目前检测硝基咪唑类药物残留的常用方法。
样品前处理是整个分析过程的关键环节，直接影响分析方法的灵敏度和精密度。由于血液样品中含有大量的蛋白质、磷脂和内源性代谢物等基质，增加了液相色谱的分离负担，会污染仪器，引起基质效应，从而使检测结果出现偏差。因此需要开发适宜的样品前处理技术，以消除样品基质干扰，提高检测结果的准确性。目前，血样的常用前处理方法包括蛋白沉淀法、液液萃取法、固相萃取法等。其中，蛋白沉淀法操作简单，但对分子量较小的蛋白质和大部分磷脂的去除效果较差；液液萃取法对蛋白质的净化效果较好，但有机溶剂对磷脂的共萃取效率很高，且操作繁琐，耗时较长；固相萃取法对血样的净化效果较弱，可能造成目标物和蛋白质或磷脂的共萃取效应，且操作复杂，成本高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种测定血液样品中硝基咪唑类药物残留的方法。
超分子溶剂是由两亲性化合物通过两相或分子间有序自组装过程形成的一种具有纳米结构的胶束聚集体。超分子溶剂萃取是一种以超分子溶剂作为萃取剂的新型萃取技术，适用于复杂基质中不同极性范围分析物的萃取，一般多使用反向胶束聚集成的萃取剂。由于反向胶束中心由亲水头基围成的水腔能阻碍蛋白质、淀粉、腐殖质等高分子进入萃取相，水腔的大小可通过改变四氢呋喃比例来调整，因此超分子溶剂萃取还具有净化效果，在萃取的同时完成净化。超分子溶剂萃取技术因具有操作简单、成本低和溶剂用量少等优势。
本发明采用超分子溶剂分散液液微萃取技术，对鱼血样中的硝基咪唑类药物进行萃取，并对影响萃取效果的烷基醇种类与用量、四氢呋喃用量、涡旋时间和超分子溶剂用量等主要条件进行了优化，结合超高效液相色谱-串联质谱技术，建立了超分子溶剂分散液液微萃取/超高效液相色谱-串联质谱测定海鱼血液中硝基咪唑类药物残留的分析方法。
一种测定血液样品中硝基咪唑类药物残留的方法，包括如下步骤：
(1)超分子溶剂的制备：采用正辛醇、四氢呋喃和水，搅拌离心后取上层有机相；
(2)样品前处理：取血液样品置于超分子溶剂中，振荡提取、离心后移取0.05mL上层液体过滤膜，滤液置于微量进样瓶中，加入甲醇，混匀得到待测液；
(3)采用超高效液相色谱-串联质谱法测定所述待测液中硝基咪唑类药物残留。
本发明所述的测定血液样品中硝基咪唑类药物残留的方法，其中，所述硝基咪唑类药物为2-甲硝咪唑、二甲硝咪唑、氯甲硝咪唑、苯硝咪唑、异丙硝唑、甲硝唑、特尼哒唑、赛克硝唑、羟基异丙硝唑、羟基甲硝唑、奥硝唑、替硝唑和洛硝哒唑，共13种硝基咪唑类化合物。
本发明所述的测定血液样品中硝基咪唑类药物残留的方法，其中，所述超高效液相色谱-串联质谱法中的色谱条件如下：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18，2.1mm×50mm×1.7μm；流速：0.30mL/min；流动相：A为水，B为乙腈；柱温：30℃；进样量：2μL；梯度洗脱程序：0.0～3.0min，10％～60％B；3.0～3.5min，60％～90％B；3.5～4.0min，90％B；4.0～4.2min，90％～10％B；4.2～5.5min，10％B。
本发明所述的测定血液样品中硝基咪唑类药物残留的方法，其中，所述超高效液相色谱-串联质谱法中的质谱条件如下：
电喷雾离子源；正离子模式；毛细管电压：3.5kV；射频透镜电压：0.5V；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：800L/h；锥孔气流量：50L/h；碰撞气：氩气；碰撞气压力：0.32Pa；数据采集模式：多反应监测。
本发明所述的测定血液样品中硝基咪唑类药物残留的方法，其中，所述13种硝基咪唑类化合物的质谱分析参数见表2：
表2 13种硝基咪唑类化合物的质谱分析参数
Figure BDA0001952192240000021
Figure BDA0001952192240000031
*定量子离子。
本发明所述的测定血液样品中硝基咪唑类药物残留的方法，其中，步骤(1)中所述超分子溶剂的制备具体包括如下步骤：量取1.5mL正辛醇和8mL四氢呋喃迅速注入50mL玻璃离心管中，加入30.5mL超纯水，磁力搅拌5min后，以3000r/min离心10min，用注射器移取上层有机相于玻璃瓶中，4℃下密封保存。
本发明所述的测定血液样品中硝基咪唑类药物残留的方法，其中，所述血液样品为鱼血液样品。
本发明所述的测定血液样品中硝基咪唑类药物残留的方法，其中，步骤(2)中所述样品前处理具体包括如下步骤：
用2mL注射器从鱼侧线下方约1cm处斜向上进针，直至针头触及鱼脊柱，轻轻转动针尖后略回拉针头，抽拉针管，保持针管处于吸气状态，采血完成后，立即移取0.1mL血液样品，置于预先加入0.2mL超分子溶剂的2mL聚丙烯离心管中，涡旋振荡提取5min，再以3000r/min离心10min，移取0.05mL上层液体过0.45μm微孔滤膜，滤液置于0.3mL微量进样瓶中，加入0.05mL甲醇混匀，待测定。
本发明所述的测定血液样品中硝基咪唑类药物残留的方法还包括标准溶液的配制。
本发明测定血液样品中硝基咪唑类药物残留的方法与现有技术不同之处在于：
本发明测定血液样品中硝基咪唑类药物残留的方法建立了一种基于超分子溶剂分散液液微萃取技术的鱼血中13种硝基咪唑类药物的超高效液相色谱-串联质谱测定方法。样品用正辛醇、四氢呋喃和水形成的超分子溶剂萃取，以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1mm×50mm×1.7μm)色谱柱分离。在电喷雾正离子模式下，采用多反应监测模式进行定性及定量分析。结果表明，13种硝基咪唑类药物在各自线性范围内线性关系良好，相关系数大于0.998，检出限为0.05～0.2μg/L，定量下限为0.1～0.5μg/L。在低、中、高3个加标水平下13种硝基咪唑类药物的平均回收率为88.4％～105％，相对标准偏差(n＝6)为4.3％～11％。本发明的方法简便快速、准确可靠，可用于鱼血中硝基咪唑类药物残留的分析检测。
下面结合附图对本发明的测定血液样品中硝基咪唑类药物残留的方法作进一步说明。
附图说明
图1为本发明中各种前处理方法对萃取效率的影响图(n＝3)；其中，(a)为萃取溶剂、(b)为四氢呋喃用量、(c)为涡旋时间、(d)为超分子溶剂用量。
图2为本发明中13种硝基咪唑类化合物的多反应监测色谱图。
本发明附图中出现的所有英文的中文翻译如下：
MNI：2-甲硝咪唑；DMZ：二甲硝咪唑；CMNI：氯甲硝咪唑；NBI：苯硝咪唑；IPZ：异丙硝唑；MNZ：甲硝唑；TerNDZ：特尼哒唑；SNZ：赛克硝唑；IPZ-OH：羟基异丙硝唑；MNZ-OH：羟基甲硝唑；RNZ：洛硝哒唑；ONZ：奥硝唑；TNZ：替硝唑。
具体实施方式
一、实验部分
1.1仪器与试剂
ACQUITY超高效液相色谱仪、XEVO TQ三重四极杆质谱仪、MassLynx数据处理系统(美国Waters公司)；MS-H-Pro数显型磁力搅拌器(北京大龙兴创实验仪器有限公司)；Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司)；AB204-S型电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；CR 21N型高速冷冻离心机(日本Hitachi公司)；MS3型涡旋振荡器(德国IKA公司)。
甲醇、乙腈、四氢呋喃(色谱纯)购自美国Fisher公司；正戊醇、正己醇、正辛醇、正癸醇、正十一醇和正十二醇购自百灵威科技有限公司；正庚醇和正壬醇购自日本TCI公司。2-甲硝咪唑、二甲硝咪唑、氯甲硝咪唑、苯硝咪唑、异丙硝唑、甲硝唑、特尼哒唑、赛克硝唑、羟基异丙硝唑、羟基甲硝唑、奥硝唑、替硝唑标准品购自美国Sigma公司；洛硝哒唑标准品购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，所有标准品纯度均大于98％。13种硝基咪唑类化合物的基本信息见表1。
表1 13种硝基咪唑类化合物的基本信息
Figure BDA0001952192240000041
1.2标准溶液的配制
分别准确称取13种硝基咪唑类药物标准品各10mg(精确至0.1mg)至10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成质量浓度为1000mg/L的标准储备溶液。分别量取1mL标准储备溶液至50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成质量浓度为20mg/L的混合标准储备溶液。使用时以甲醇逐级稀释成系列质量浓度的标准工作溶液，现用现配。
1.3超分子溶剂的制备
量取1.5mL正辛醇和8mL四氢呋喃迅速注入50mL玻璃离心管中，加入30.5mL超纯水，磁力搅拌5min后，以3000r/min离心10min，用注射器移取上层有机相于玻璃瓶中，4℃下密封保存。
1.4样品前处理
用2mL注射器从鱼侧线下方约1cm处斜向上进针，直至针头触及鱼脊柱，轻轻转动针尖后略回拉针头。抽拉针管，保持针管处于吸气状态。采血完成后，立即移取0.1mL血液样品，置于预先加入0.2mL超分子溶剂的2mL聚丙烯离心管中，涡旋振荡提取5min，再以3000r/min离心10min。移取0.05mL上层液体过0.45μm微孔滤膜，滤液置于0.3mL微量进样瓶中，加入0.05mL甲醇混匀，待测定。
1.5分析条件
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1mm×50mm×1.7μm)；流速：0.30mL/min；流动相：A为水，B为乙腈；柱温：30℃；进样量：2μL。梯度洗脱程序：0.0～3.0min，10％～60％B；3.0～3.5min，60％～90％B；3.5～4.0min，90％B；4.0～4.2min，90％～10％B；4.2～5.5min，10％B。
电喷雾离子源；正离子模式；毛细管电压：3.5kV；射频透镜电压：0.5V；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：800L/h；锥孔气流量：50L/h；碰撞气：氩气；碰撞气压力：0.32Pa；数据采集模式：多反应监测(MRM)。13种硝基咪唑类化合物的质谱分析参数见表2。
表2 13种硝基咪唑类化合物的质谱分析参数
Figure BDA0001952192240000051
Figure BDA0001952192240000061
*定量子离子。
二、结果与分析
2.1前处理条件的优化
2.1.1烷基醇种类的选择超分子溶剂的萃取作用力主要体现在烷基链的疏水相互作用和亲水头基的氢键作用。本实验选择具有两亲性质的四氢呋喃分别与不同碳原子数的烷基醇(正戊醇、正己醇、正庚醇、正辛醇、正壬醇、正癸醇、正十一醇和正十二醇)组合形成超分子溶剂，对13种硝基咪唑类药物进行萃取。如图1a所示，正辛醇/四氢呋喃/水组成的超分子溶剂对13种药物的萃取率为78.82％～115.89％，均在合理范围内，且比较稳定集中。其它烷基醇虽对部分硝基咪唑类药物的萃取效果较好，但萃取率整体偏高或偏低，波动较大。因此，选择正辛醇/四氢呋喃/水作为超分子溶剂。
2.1.2正辛醇用量的优化正辛醇/四氢呋喃/水组成的超分子溶剂属于反相胶束类型。保持超分子溶剂总体积为40mL，考察了正辛醇用量(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL)对13种药物萃取率的影响。结果显示，当正辛醇用量不小于1.5mL时，所形成的超分子溶剂对样品均有较好的萃取率。为节省有机溶剂，实验选择正辛醇的用量为1.5mL。
2.1.3四氢呋喃用量的优化保持超分子溶剂总体积为40mL，考察了四氢呋喃用量(2、4、6、8、10、12mL)对13种药物的萃取率。如图1b所示，当四氢呋喃用量为4～8mL时，除羟基甲硝唑外，其余12种药物的萃取率较高且稳定。反相胶束类型的超分子溶剂的体积与四氢呋喃用量呈指数关系，即在固定正辛醇用量的条件下，增加四氢呋喃用量，所得到的超分子溶剂体积会增大，意味着能够获得更多的反向胶束类型的超分子溶剂和有助于获得更好的萃取效果。因此，综合考虑选择四氢呋喃的用量为8mL。
2.1.4涡旋时间的优化在超分子溶剂分散液液微萃取过程中，分析物通过萃取剂和样品间的充分接触可迅速达到分配平衡，但血液样品的粘滞性会阻碍分散过程，降低萃取率，而通过涡旋可以促进超分子溶剂与血液样品中待测药物的充分混合，促进传质过程。实验考察了涡旋时间分别为1、3、5、7、9、11min时样品的萃取率。如图1c所示，当涡旋时间小于5min时，样品的萃取率较高且趋于平稳；而当涡旋时间大于5min时，萃取率则会下降，这可能是由于随着涡旋时间的增加，萃取到超分子溶剂中的待测药物重新被血液吸附，导致萃取剂中的目标物含量降低。因此，综合考虑选择涡旋时间为5min。
2.1.5超分子溶剂用量的优化超分子溶剂与血液样品的体积比会影响整体萃取体系的黏度和分子扩散速度，进而影响萃取效率。考察了超分子溶剂与血液样品的体积比分别为1.5、2.0、2.5、3.0和3.5时样品的萃取率。如图1d所示，当体积比较小时，萃取体系的黏度较大，分子扩散速度低，导致萃取率偏低；随着体积比的增加，更多的目标物从血液中释放出来，导致萃取率增大并趋于稳定。但加入的超分子溶剂过多时，血液中的内源性物质也会被释放出来，产生基质效应。因此，综合考虑选择超分子溶剂与血液样品的体积比为2.0。
2.2色谱-质谱条件的优化
2.2.1流动相的选择考察了反相色谱常用的有机相溶剂(甲醇、乙腈和甲醇-乙腈1:1混合溶剂)与中性、酸性和碱性水相(水，0.01％、0.05％和0.1％的甲酸溶液，0.01％、0.05％和0.1％的氨水溶液)组成的流动相体系对13种待测药物色谱行为的影响。结果表明，以乙腈-水为流动相进行洗脱时，目标物能获得较好的色谱峰形、分离效果和灵敏度。因此选择乙腈-水为流动相。
2.2.2流速的优化考察了流动相流速(0.20、0.25、0.30、0.35、0.40mL/min)对13种待测药物色谱行为的影响。结果表明，低流速能够提高目标物的质谱响应强度，但同时会使色谱峰展宽、峰形变差；高流速虽会造成信号峰强度下降，但对峰形有改善作用。因此，综合考虑选择流动相流速为0.30mL/min。
2.2.3色谱柱类型和温度的选择分别对规格均为2.1mm×50mm×1.7μm的BEH C18、BEH RP18、BEH C8、BEH HILIC等具有不同选择性的色谱柱和色谱柱温度(30、35、40、45℃)进行了考察。结果表明，BEH C18色谱柱在30℃的条件下对13种待测药物的分离效果和信号响应强度最好。因此，最终选择BEH C18(2.1mm×50mm×1.7μm)作为色谱柱。
2.2.4柱温的优化分别考察了色谱柱温度为30、35、40和45℃对13种硝基咪唑类药物色谱行为的影响。结果表明，色谱柱温度的提高会使目标物色谱峰的响应值下降，峰形变差。因此，选择色谱柱的温度为30℃。
2.2.4质谱条件的优化用蠕动泵分别将13种待测药物标准溶液(质量浓度均为1μg/mL)以10μL/min的流速注入电喷雾离子源中，根据各药物的电离性质，选择在正离子模式下进行一级质谱分析，得到准分子离子[M+H]+信息。确定母离子后，再进行子离子扫描二级质谱分析，选择丰度较大的两个碎片离子，其中以丰度较高的碎片离子作为定量离子，另一个作为辅助定性离子。分别对毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量等参数进行了优化。在最佳实验条件下，13种硝基咪唑类药物的多反应监测色谱图见图2。
2.3方法学考察
2.3.1线性范围、检出限及定量下限在优化的实验条件下，测定一系列不同浓度的混合标准溶液，以峰面积(y)对其质量浓度(x)进行线性回归，绘制标准工作曲线。结果表明，13种硝基咪唑类药物在各自线性范围内呈良好的线性关系，相关系数大于0.998。分别以3倍信噪比和10倍信噪比计算方法的检出限和定量限，得到13种待测药物的检出限为0.05～0.2μg/L，定量限为0.1～0.5μg/L(见表3)。
表3 13种硝基咪唑类药物的线性范围、相关系数、检出限、定量限、回收率及相对标准偏差
Figure BDA0001952192240000081
2.3.2回收率与相对标准偏差以不含待测物的血液样品为空白基质，分别添加低、中、高3个水平的混合标准溶液，按照本方法进行测定，每个水平平行6次，计算加标回收率。结果表明，13种硝基咪唑类药物的平均回收率为88.4％～105％，相对标准偏差为4.3％～11％(见表3)，可满足实际检测需求。
2.3.3基质效应评估由于血液基质复杂，蛋白质、磷脂和内源性代谢物等成分与目标组分在雾滴表面离子化过程中可能会产生竞争，使目标离子的生成效率及离子强度增强或抑制，进而影响测定结果的精密度和准确度。采用提取后加入法对绝对基质效应进行了计算。实验结果表明，13种待测药物的基质效应为86.12％～100.90％。可见通过采用超分子溶剂作为萃取剂，可以有效的提取目标物质，很好地消除血液样品基质效应的干扰。
三、结论
本发明建立了超分子溶剂分散液液微萃取结合超高效液相色谱-串联质谱测定鱼血中13种硝基咪唑类药物残留的分析方法，并对烷基醇的种类与用量、四氢呋喃用量、涡旋时间和超分子溶剂用量等因素进行了考察。在最佳条件下，13种待测药物的检出限为0.05～0.2μg/L，定量下限为0.1～0.5μg/L；在低、中、高3个加标水平下的平均回收率为88.4％～105％，相对标准偏差为4.3％～11％。本发明的方法无需复杂的样品前处理，具有准确高效、环境友好的优点。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种测定血液样品中硝基咪唑类药物残留的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)超分子溶剂的制备：量取1.5mL正辛醇和8mL四氢呋喃迅速注入50mL玻璃离心管中，加入30.5mL超纯水，磁力搅拌5min后，以3000r/min离心10min，用注射器移取上层有机相于玻璃瓶中，4℃下密封保存；
(2)样品前处理：取血液样品置于超分子溶剂中，振荡提取、离心后移取上层液体过滤膜，滤液置于微量进样瓶中，加入甲醇，混匀得到待测液；
(3)采用超高效液相色谱-串联质谱法测定所述待测液中硝基咪唑类药物残留；质谱条件为：
电喷雾离子源；正离子模式；毛细管电压：3.5kV；射频透镜电压：0.5V；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：800L/h；锥孔气流量：50L/h；碰撞气：氩气；碰撞气压力：0.32Pa；数据采集模式：多反应监测；
所述硝基咪唑类药物为2-甲硝咪唑、二甲硝咪唑、氯甲硝咪唑、苯硝咪唑、异丙硝唑、甲硝唑、特尼哒唑、赛克硝唑、羟基异丙硝唑、羟基甲硝唑、奥硝唑、替硝唑和洛硝哒唑，共13种硝基咪唑类化合物。
2.根据权利要求1所述的测定血液样品中硝基咪唑类药物残留的方法，其特征在于：所述超高效液相色谱-串联质谱法中的色谱条件为：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18，2.1mm×50mm×1.7μm；流速：0.30mL/min；流动相：A为水，B为乙腈；柱温：30℃；进样量：2μL；梯度洗脱程序：0.0～3.0min，10％～60％B；3.0～3.5min，60％～90％B；3.5～4.0min，90％B；4.0～4.2min，90％～10％B；4.2～5.5min，10％B。
3.根据权利要求2所述的测定血液样品中硝基咪唑类药物残留的方法，其特征在于：所述13种硝基咪唑类化合物的质谱分析参数为：
Figure FDA0003300816300000011
Figure FDA0003300816300000021
*定量子离子。
4.根据权利要求3所述的测定血液样品中硝基咪唑类药物残留的方法，其特征在于：所述血液样品为鱼血液样品。
5.根据权利要求4所述的测定血液样品中硝基咪唑类药物残留的方法，其特征在于：步骤(2)中所述样品前处理具体包括以下步骤：用2mL注射器从鱼侧线下方1cm处斜向上进针，直至针头触及鱼脊柱，轻轻转动针尖后略回拉针头，抽拉针管，保持针管处于吸气状态，采血完成后，立即移取0.1mL血液样品，置于预先加入0.2mL超分子溶剂的2mL聚丙烯离心管中，涡旋振荡提取5min，再以3000r/min离心10min，移取0.05mL上层液体过0.45μm微孔滤膜，滤液置于0.3mL微量进样瓶中，加入0.05mL甲醇混匀，待测定。
6.根据权利要求5所述的测定血液样品中硝基咪唑类药物残留的方法，其特征在于：还包括标准溶液的配制。
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