CN108872448A - 一种超高效液相色谱-串联质谱检测烟用香精中5种甜味剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于烟用香精中食品添加剂残留的理化检验技术领域，具体是一种超高效液相色谱‑串联质谱检测烟用香精中5种甜味剂的方法，其特征在于：首先将烟用香精称取后加超纯水，然后振荡萃取，萃取液净化、过滤后、并经超纯水稀释后直接以超高效液相色谱‑串联质谱测定烟用香精中的甜味剂。本方法能够快速、准确检测烟用香精中甜味剂残留量，具有方法环保、结果准确、干扰少、灵敏度高及重复性好的优点。

Description

一种超高效液相色谱-串联质谱检测烟用香精中5种甜味剂的 方法

技术领域

本发明属于烟用香精中食品添加剂残留的理化检验技术领域，主要涉及烟用香精中5种甜味剂的测定方法，具体说是采用振荡方式萃取甜味剂，以超高效液相色谱-串联质谱直接测定的方法。

背景技术

甜味剂是一类重要的食品添加剂，用以改善食品口感和风味，其中非糖类甜味剂由于高甜度、低热量、多不参与代谢过程等优点而成为蔗糖的代用品在现代食品工业中普遍应用。近年来，随着消费和认识水平的提高，人们对食品安全问题日益关注，食品中各种添加剂特别是甜味剂的使用情况越来越受到人们的重视。食品添加剂在规定的剂量范围内使用对人无害，若超量使用，则可能引起各种形式的毒性表现。因此，必须对其使用量进行严格管理，发挥其有利作用，防止其不利影响。目前，各国对糖精钠、甜蜜素等甜味剂采取了严格限制使用的政策，均制定了大量的标准，已成为国际贸易和国内标准中考察的重点。我国国家标准GB 2760《食品添加剂使用标准》中对可用于食品加工的甜味剂，包括甜蜜素、安塞蜜、木糖醇、阿力甜等的适用范围和添加限量都有明确规定。食用香精是由各种天然或合成香料及许可使用的附加物调配的，以改善、强化和模仿食品香气和香味的食品添加剂。为改善香精的口感和风味，所使用的香精中会不同程度的添加甜味剂。为实现对该类产品的监管和测定，因此亟需发展一种快速、准确、高灵敏度的测定方法。

目前文献报道的有乳制品【宋戈等，色谱，2011，29(12)】、白酒【姚明静等，酿酒科技，2017(10)】、饮料【 稽超等，色谱，2009，27(1)】等食品中甜味剂的测定。甜味剂的测定方法有离子色谱法，液相色谱法，液相色谱串联质谱法，气相色谱法和气相色谱质谱联用法。由于香精的基质较饮料、乳制品等更为复杂，很多是天然提取物，通过现有的方法无法进行准确的定性和定量。本发明通过对超高效液相-串联质谱(UPLC-MS/MS)色谱方法和分散固相萃取净化，最大程度上消除了基质干扰，提高方法的特异性和灵敏度，建立了一种简单、高效、准确可实现同时测定香精中5种甜味剂的UPLC-MS/MS方法，更好的满足了检测分析工作的需求。

发明内容：

本发明的目的正是基于上述现有状况而提供的一种超高效液相色谱-串联质谱检测烟用香精中5种甜味剂的方法，本方法克服了现有技术缺陷，能够快速、准确检测烟用香精中甜味剂残留量，方法环保，且测定结果准确、干扰少。

本发明鉴于上述现有的分析方法，考虑到烟用香精中甜味剂的含量很低，而且甜味剂沸点较高，基质干扰大的特点因此选用灵敏度高、抗干扰能力强的超高效液相色谱-串联质谱的方法分析。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种超高效液相色谱-串联质谱检测烟用香精中5种甜味剂的测定方法，首先将烟用香精称取后加超纯水，然后振荡萃取，萃取液过滤、并经超纯水稀释后直接以超高效液相色谱-串联质谱测定香精中甜味剂的方法，具体包括以下步骤：

a、称取0.2~0.5 g样品（精确至0.01 g），并置于50 mL具塞三角瓶中；

b、样品的提取：准确加入10 mL 萃取液：超纯水，振荡萃取10 min；

c、样品净化：静置5 min, 吸取2mL上清液于5mL的离心管中，并在离心管中加入25mg的C18粉末，涡旋振荡2min，取上清液经0.22μm水相滤膜过滤；

d、移取100μL的滤液，用超纯水将样品稀释至1.0 mL，作为样品待测液进UPLC-MS/MS分析；

e、准备混合标准工作溶液：称取各甜味剂标准品用超纯水配制具有浓度梯度的混合标准工作溶液；

f、液相色谱-串联质谱测定：吸取配制好的不同浓度的混合标准工作溶液以及样品待测液，分别注入超高效液相色谱-串联质谱仪；

g、甜味剂测定结果的计算

以外标法进行定量分析，即以甜味剂标准品的定量离子对峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，相关系数大于等于0.995。对提取后的样品待测液进行测定，测得检出甜味剂的定量离子对峰面积，代入标准曲线求得样品中的甜味剂的残留量。

在本发明中标准工作溶液的配制方式如下：分别准确称取5种甜味剂各10 mg于同一个100 mL容量瓶中，精确至0.1 mg，用超纯水溶解并定容，配制成浓度为100μg/mL混合标准储备溶液；移取1000μL 混合标准储备溶液到10 mL容量瓶中，用超纯水定容，此混合标准溶液浓度为10.0 μg/mL；分别移取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL混合标准溶液于10 mL容量瓶中，用超纯水稀释定容，即配制成不同浓度的混合标准工作溶液，系列混合标准工作溶液中各种甜味剂的浓度均分别为：100 ng/mL，200 ng/mL，500 ng/mL，1000 ng/mL和2000 ng/mL；

采用的液相色谱条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18，规格100 mm×2.1 mm,1.7 μm；流动相A：甲醇，B：0.1 %甲酸水溶液，流速：200 μL/min，梯度洗脱；洗脱程序见表2；柱温：40 ℃；进样量：2μL；

采用的质谱条件：扫描方式：负离子扫描; 电喷雾离子源(ESI); 离子源温度：150 ℃；毛细管电压：-3.0 KV；锥孔气气流量：50L/hour；脱溶剂气流量为650L/hour; 脱溶剂气温度：350℃; 停留时间：100 ms；检测方式：多离子反应监测（MRM）；MRM参数见表1。

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本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对烟用香精样品优化了样品前处理方法和仪器检测条件。与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：

（1）本发明方法利用UPLC-MS/MS测定烟用香精中甜味剂的含量，抗基质干扰能力强，前处理方法简单。

（2）本发明所用的萃取溶剂为超纯水，对环境无污染，符合绿色发展理念。

（3）本发明采用C18粉末进行固相分散萃取，C18可以有效的去除样品基质中的色素等杂质，同时不会吸附目标物，可以有效的净化样品。而且，与固相萃取相比，分散固相萃取操作简单，方便。

（4）本发明通过稀释的方法降低了基质效应的干扰。由于试样在提取过程中，分析靶标物被提取的同时还有很多共提物存在于提取液中，从而影响靶标物在分析仪器上的定性定量分析，需要考虑基质效应对检测的影响。基质效应通常不能被消除，但通过有效途经可以减小其影响。本发明对比了溶剂标准曲线和基质标准曲线各浓度点响应信号。基质对响应信号的影响十分明显。但随着稀释倍数的增加，基质效应对响应信号的影响有明显改善。稀释10倍的基质标准曲线各浓度点响应信号可以达到同浓度标准溶液响应信号的95%左右，基本完全排除了基质效应。

（5）本发明方法具有操作准确、灵敏度高及重复性好的优点。

①本发明方法的检测限：

将不同浓度的混合标准工作溶液注入UPLC－MS/MS，以3倍信噪比（S/N = 3）计算检测限（LOD）。

②本发明方法的重复性和加标回收率：

在空白样品中加入甜味剂的标准溶液，然后分别进行前处理和UPLC－MS/MS分析，并按照加标量和测定值计算其回收。

甜味剂的线性范围，回收率，相对标准偏差，检出限见表3。

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附图说明

图1为本发明的测定方法流程图（该图作为摘要附图）。

图2 为标准溶液选择离子色谱图。

具体实施方式

本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。

实例1：

1．仪器与试剂：

5种甜味剂、甲醇均为色谱级试剂；符合GB/T 6682中一级水的要求。

Waters TQD 四极杆串联质谱仪；瑞士Mettler AE 163电子天平（感量：0.0001g）。

2．样品处理：

称取0.2 g烟用香精样品（精确至0.01 g），并置于50 mL具塞三角瓶中。准确加入10 mL萃取液：超纯水，振荡萃取10 min；样品净化：静置5 min, 吸取2mL上清液于5mL的离心管中，并在离心管中加入25mg的C18粉末，涡旋振荡2min，取上清液经0.22μm水相滤膜过滤。移取100 μL的滤液，用超纯水将样品稀释至1.0 mL，作为样品待测液进UPLC-MS/MS分析；

3.准备标准工作溶液：配制方式见发明内容部分，此处不再重复。

4、UPLC－MS/MS测定。

5.测定结果计算：以外标法进行定量分析，即以各种甜味剂标准品的定量离子对峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到各种甜味剂标准曲线，相关系数均大于等于0.995，对提取后的样品进行测定，得出目标物的定量离子对峰面积，代入标准曲线求得样品中甜味剂的含量，其中此样品中仅检出甜蜜素，其含量为1.20 mg/kg。

为判断方法的准确性，在此样品中加入甜蜜素的标准溶液，使得样品中甜蜜素的理论含量为2.20 mg/kg，进行同上的样品前处理，以UPLC-MS/MS测得甜蜜素的选择离子峰面积，代入标准曲线，求得此时样品中的甜蜜素的含量为2.12 mg/kg，即甜蜜素的加标回收率为92.0％，说明此方法是准确的。

实例2：

如实例1所述方法，选择另一烟用香精样品，未检出上述5种甜味剂。

Claims (4)

1.一种超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测烟用香精中5种甜味剂的方法，所述5种甜味素分别为甜蜜素、糖精钠、阿巴斯甜、安赛蜜和纽甜，其特征在于：首先称取烟用香精后加超纯水，然后振荡萃取，萃取液净化、过滤、并经超纯水稀释后直接以超高效液相色谱-串联质谱测定纸张中的甜味剂，具体包括以下步骤：

a、称取0.2~0.5 g样品，并置于50 mL具塞三角瓶中；

b、样品的提取：准确加入10 mL 萃取液：超纯水，然后振荡萃取10 min；

c、样品净化：静置5 min, 吸取2mL上清液于5mL的离心管中，并在离心管中加入25mg的C18粉末，涡旋振荡2min，取上清液经0.22μm水相滤膜过滤；

d、移取100μL的滤液，用超纯水将样品稀释至1.0 mL，作为样品待测液进UPLC-MS/MS分析；

e、准备混合标准工作溶液：称取各甜味剂标准品用超纯水配制具有浓度梯度的混合标准工作溶液；

f、液相色谱-串联质谱测定:吸取配制好的不同浓度的混合标准工作溶液以及样品待测液，分别注入超高效液相色谱-串联质谱仪；

采用的液相色谱条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18，规格100 mm×2.1 mm,1.7 μm；流动相A：甲醇，B：0.1 %甲酸水溶液，流速：200 μL/min，梯度洗脱；柱温：40 ℃；进样量：2μL；

采用的质谱条件：扫描方式：负离子扫描; 电喷雾离子源(ESI); 离子源温度：150 ℃；毛细管电压：-3.0 KV；锥孔气气流量：50L/hour；脱溶剂气流量为650L/hour；脱溶剂气温度：350℃；停留时间：100 ms；检测方式：多离子反应监测（MRM）；

g、甜味剂测定结果的计算

以外标法进行定量分析，即以甜味剂标准品的定量离子对峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，相关系数大于等于0.995；对提取后的样品待测液进行测定，测得甜味剂的定量离子对峰面积，代入标准曲线求得样品中甜味剂的残留量。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：混合标准工作溶液的配制方式如下：分别准确称取5种甜味剂各10 mg于同一个100 mL容量瓶中，精确至0.1 mg，用超纯水溶解并定容，配制成浓度为100μg/mL混合标准储备溶液；移取1000μL 混合标准储备溶液到10mL容量瓶中，用超纯水定容，此混合标准溶液浓度为10.0 μg/mL；分别移取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL混合标准溶液于10 mL容量瓶中，用超纯水稀释定容，即配制成不同浓度的混合标准工作溶液，系列混合标准工作溶液中各种甜味剂的浓度均分别为：100 ng/mL，200 ng/mL，500 ng/mL，1000 ng/mL和2000 ng/mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤f中，所述梯度洗脱程序如下表：

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4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中，所述MRM参数见下表：

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