CN104990998B - 一种养殖塘底泥中敌百虫对映体的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种养殖塘底泥中敌百虫手性对映体的检测方法，步骤：将底泥样品放入离心管中，加入无水硫酸钠脱除水分，加入乙酸酸化乙腈超声提取后离心，取上层提取液于烧瓶，重复2～3次，合并提取液于27℃水浴旋蒸浓缩，浓缩液加入提前活化CARB/NH2小柱，用乙腈冲洗烧瓶，冲洗液过CARB/NH2小柱，收集流出液，氮吹至近干，正己烷/异丙醇复溶，定溶至1mL，过0.22μm微孔滤膜后得溶液A；以正己烷/异丙醇为流动相对敌百虫对映体进行分离；用高效液相色谱仪对溶液A进行检测，选用IC手性柱，柱温为25℃，流速为1mL/min，波长为207nm。本发明能成功实现敌百虫手性对映体拆分，从而检测底泥中敌百虫对映体的残留量，为底泥养殖中敌百虫的残留风险评估及合理、安全使用提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种养殖塘底泥中敌百虫对映体的检测方法。
背景技术
敌百虫[O,O-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羟基乙基)膦酸酯]属于手性有机磷杀虫剂，是海水养殖中常见的外用或低剂量内服驱虫杀虫药，敌百虫在海水养殖中当中主要用于对虾育苗中杀灭桡足类、轮虫、野生甲壳类等，防止甲壳类携带的对虾病毒进入养殖塘，是对虾养殖清塘预防病毒一种理想药物；杀灭虾池、鱼池中野生小蟹、白虾、蝼蛄虾等以虾苗鱼苗为食或与虾苗鱼苗竞争资源的有害物种，保证虾苗鱼苗存活率。
目前国内外研究表明在海水养殖中，敌百虫的通常使用量为1.0～1.5mg/L，为了获得更好的治疗效果，敌百虫施用量常超出范围，过量使用的敌百虫会造成养殖塘环境或近水域的破坏，残留的敌百虫进入海洋或养殖塘底泥环境会对其他非靶生物造成毒性，敌百虫在水产品当中的残留也会造成食品安全问题，这同样令人担忧。
敌百虫是一种手性药物，具有一个手性碳原子，两个手性对映体，其对映体结构式如图1所示。现已有文献表明敌百虫对映体在毒性上存在差异，对AchE酶的毒性大小为(—)-敌百虫＞(+)-敌百虫＞消旋体敌百虫，在以往的研究中敌百虫一直被当做单一成分进行分析，并没有开展对映体水平上的研究。因此，开展检测底泥中敌百虫对映体的研究，将为敌百虫在海洋底泥中残留的风险评估以及合理、安全使用提供依据。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种养殖塘底泥中敌百虫对映体的检测方法，通过采用高效液相色谱法手性固定相法检测底泥中敌百虫对映体的残留量，实现敌百虫手性对映体的拆分。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种养殖塘底泥中敌百虫对映体的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将4～6g干重的底泥样品放入离心管中，加入9～11g无水硫酸钠脱除样品中的水分，加入0.9～1.1％乙酸酸化乙腈18～22mL，超声提取1～3min后以4000～6000r/min离心4～6min，取离心后的上层提取液，放置于圆底烧瓶中，重复上述提取步骤2～3次，合并提取液在26～28℃水浴条件下旋蒸浓缩至2～3mL，将浓缩后的样品溶液加入到提前活化的CARB/NH2固相萃取小柱中，用7～8mL乙腈冲洗圆底烧瓶，将冲洗液通过CARB/NH2固相萃取小柱，控制流速为1.5～2.5mL/min，待上样溶液全部流出后抽真空将小柱中的残留溶液抽净，收集流出液于容量瓶中；
2)将步骤1)的洗脱液氮吹至近干，用正己烷：异丙醇体积比为85～95:15～5复溶，定溶至1mL，过0.22μm微孔滤膜后得到溶液A；
3)采用高效液相色谱仪对上述溶液A进行检测；检测时选用IC手性柱，流动相为正己烷和异丙醇，其体积比为85～95:15～5，检测时的柱温为20～35℃流速为0.7mL/min～1mL/min，波长为207nm。
作为改进，所述步骤1)中的CARB/NH2固相萃取小柱是经9～11ml乙腈活化。
作为优选，所述步骤2)和步骤3)中的正己烷和异丙醇的体积比为90:10。
再改进，所述步骤3)中的IC手性柱的填料为5μm硅胶耐溶剂性键合纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)。
作为优选，所述步骤3)中的检测时的流速为1mL/min，检测柱温为25℃。
与现有技术相比，本发明的优点在于：采用高效液相色谱法手性固定相法检测底泥中敌百虫对映体的残留量，成功实现了敌百虫手性对映体的拆分，其中对映体在0.5～25.0mg/L浓度范围内与其响应值呈良好的线性关系，左敌百虫和右敌百虫的回归方程及相关系数分别为y＝19.649x+0.0416、R2＝0.9994及y＝18.032x+0.1374、R2＝0.9998，样品平均回收率分别为88.53％和89.26％，日间精密度分别为5.71％和4.25％，定量限为0.097μg/g和0.09μg/g。本发明工艺简单易操作，能成功实现敌百虫手性对映体的拆分，从而检测底泥中敌百虫对映体的残留量，为底泥养殖中敌百虫的残留风险评估及合理、安全使用提供依据。
附图说明
图1是本发明提供的敌百虫对映体分子结构式；
图2A～2D是色谱图，其中A是敌百虫消旋体色谱图；B是白底泥样品色谱图；C是R-(–)-TF色谱图；D是S-(+)-TF色谱图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
本实施例的养殖塘底泥中敌百虫手性对映体的检测方法，包括以下步骤：
(1)将5g底泥样品(干重)放入50mL离心管中，加入10g无水硫酸钠脱除样品中的水分，加入1％乙酸酸化乙腈20mL，超声提取2min后以5000r/min离心5min，取离心后的上层提取液，放置于250mL圆底烧瓶中，重复上述提取步骤2次，合并3次提取液共计60ml，27℃水浴条件下旋蒸至浓缩至近2～3mL，浓缩后的样品溶液加入到过提前经10ml乙腈活化CARB/NH2固相萃取小柱，用7～8mL乙腈冲洗圆底烧瓶，将冲洗液通过CARB/NH2固相萃取小柱，控制流速为2ml/min，待上样溶液全部流出后抽真空将CARB/NH2固相萃取小柱中的残留溶液抽净，收集流出液于10mL容量瓶中。
(2)将步骤1)的洗脱液氮吹至近干，用流动相(正己烷：异丙醇＝90:10(v:v))复溶，定溶至1mL，过0.22μm微孔滤膜后得到溶液A；
(3)采用高效液相色谱仪对上述溶液A进行检测；IC耐溶剂性键合纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)手性色谱柱(4.6mm×250mm粒径,5μm)检测时选用IC手性柱，手性柱的柱温为20～35℃，流动相为正己烷和异丙醇，其体积比为85～95:15～5，检测时的流速为0.7mL/min～1mL/min，波长为207nm。
在本实施例中，步骤(3)中使用的柱温为20、25、30、35℃，正己烷与异丙醇体积比分别为85:15、90:10和95:5对敌百虫进行手性拆分，拆分结果如表1所示，可以看出，随着流动相中异丙醇比例的增大，分离度增加，但分离时间延长，因此，所使用流动相正己烷与异丙醇的最佳体积比为90:10；在任何柱温条件下敌百虫对映体均可实现分离，但高温对色谱柱会造成损伤，因此选择室温25℃，在该条件下，对映体分离效果良好且分析时间较短。
表1 流动相比例及温度对敌百虫对映体分离的影响
a:R of peak 1and peak 2.b:αof peak 1and peak 2.
Flow rate:1.0mL min-1,wavelength:207nm.
由于检测时流速不同拆分效果可能不同，本实施例在选用体积分数分别为90与10的正己烷与异丙醇作为流动相，25℃为检测柱温的前提下，分别检测了流速为0.7mL/min、0.8mL/min、0.9mL/min和1mL/min时对映体之间的拆分情况，拆分结果如表2所示。由表可知，当流速增大时敌百虫保留时间缩短，但分离度降低。因此本实施例检测时的流速优选为1mL/min，在此流速下分离效果较好，且检测时间短。
表2 流速对敌百虫对映体分离的影响
a:R of peak 1and peak 2.b:αof peak 1and peak 2.
Wavelength:207nm,temperature:25℃,mobile phase:n-hexane/2-proportion/enthanol(90:10,v/v).
将5g底泥样品(干重)放入50mL离心管中，加入10g无水硫酸钠脱除样品中的水分，加入1％乙酸酸化乙腈20mL，超声提取2min后以5000r/min离心5min，取离心后的上层提取液，放置于250mL圆底烧瓶中，重复上述提取步奏2次，合并3次提取液共计60ml，27℃水浴条件下旋蒸至浓缩至近2～3mL，浓缩后的样品溶液加入到过提前经10ml乙腈活化CARB/NH2小柱，用7～8mL乙腈冲洗圆底烧瓶，将冲洗液通过CARB/NH2小柱，控制流速为2mL/min，待上样溶液全部流出后抽真空将小柱中的残留溶液抽净，收集流出液于10mL容量瓶中，洗脱液氮吹至近干后用异丙醇定容至1mL，过0.22μm微孔滤膜后上机检测。敌百虫对映体浓度在0.5mg/L～25mg/L范围内与其响应值呈良好的线性关系。以X表示浓度，Y表示敌百虫对映体峰面积，左敌百虫和右敌百虫的回归方程及相关系数分别为y＝19.649x+0.0416、R2＝0.9994及y＝18.032x+0.1374、R2＝0.9998。在空白底泥中添加0.6μg/g、2μg/g和4μg/g这3个浓度的敌百虫标准溶液，按本方法进行回收率实验。每个添加浓度平行操作3次，计算回收率和精密度，左敌百虫及右敌百虫的样品平均回收率分别为88.53％和89.26％，日间精密度分别为分别为5.71％和4.25％，定量限为0.097μg/g和0.090μg/g。
由图2A～2D可知，本方法能成功实现敌百虫对映体的拆分，两个对映体的分离度为6.91。
Claims (5)
1.一种养殖塘底泥中敌百虫对映体的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将4～6g干重的底泥样品放入离心管中，加入9～11g无水硫酸钠脱除样品中的水分，加入0.9～1.1％乙酸酸化乙腈18～22mL，超声提取1～3min后以4000～6000r/min离心4～6min，取离心后的上层提取液，放置于圆底烧瓶中，重复上述提取步骤2～3次，合并提取液在26～28℃水浴条件下旋蒸浓缩至2～3mL，将浓缩后的样品溶液加入到提前活化的CARB/NH2固相萃取小柱中，用7～8mL乙腈冲洗圆底烧瓶，将冲洗液通过CARB/NH2固相萃取小柱，控制流速为1.5～2.5mL/min，待上样溶液全部流出后抽真空将小柱中的残留溶液抽净，收集流出液于容量瓶中；
2)将步骤1)的洗脱液氮吹至近干，用正己烷：异丙醇体积比为90～95:10～5复溶，定溶至1mL，过0.22μm微孔滤膜后得到溶液A；
3)采用高效液相色谱仪对上述溶液A进行检测；检测时选用IC手性柱，流动相为正己烷和异丙醇，其体积比为90～95:10～5，检测时的柱温为20～35℃，流速为0.7mL/min～1mL/min，波长为207nm。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤1)中的CARB/NH2固相萃取小柱是经9～11ml乙腈活化。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤2)和步骤3)中的正己烷和异丙醇的体积比为90:10。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤3)中的IC手性柱的填料为5μm硅胶耐溶剂性键合纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤3)中的检测时的流速为1mL/min，检测柱温为25℃。
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