CN106018624B - 食品中亚硝胺的hplc检测方法 - Google Patents

食品中亚硝胺的hplc检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106018624B
CN106018624B CN201610565710.8A CN201610565710A CN106018624B CN 106018624 B CN106018624 B CN 106018624B CN 201610565710 A CN201610565710 A CN 201610565710A CN 106018624 B CN106018624 B CN 106018624B
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
nitrosamine
food
fluorescent marker
nitroso
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201610565710.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106018624A (zh
Inventor
李国梁
吴頔
吴永宁
邱楠楠
路帅敏
尤进茂
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qufu Normal University
Original Assignee
Qufu Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qufu Normal University filed Critical Qufu Normal University
Priority to CN201610565710.8A priority Critical patent/CN106018624B/zh
Publication of CN106018624A publication Critical patent/CN106018624A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106018624B publication Critical patent/CN106018624B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/027—Liquid chromatography

Abstract

本发明公开了一种食品中亚硝胺的HPLC检测方法，步骤是：将食品中亚硝胺先脱去亚硝基，然后进行荧光标记，荧光标记后进行分散液液微萃取，所得溶液用高效液相‑荧光检测法进行检测。本发明方法快速、灵敏，能够一次性检测四种亚硝胺（N,N‑二乙基亚硝胺，N,N‑二丙基亚硝胺，N,N‑二丁基亚硝胺，吡咯烷亚硝胺），具有快速性，简洁性，环保性，高灵敏性、杰出选择性等优点，可以用于酱牛肉，泡菜，啤酒，咸鸭蛋，马步鱼、香肠等食品中亚硝胺的检测，在最佳条件下，获得的亚硝胺检测限的范围是0.80‑1.60 ng L‑1，明显低于现有报道过的方法，在食品安全分析方面展现出了远大前景。

Description

食品中亚硝胺的HPLC检测方法
技术领域
本发明涉及一种亚硝胺的检测方法，具体涉及一种食品中亚硝胺的HPLC检测方法。
发明内容
最近，食品安全由于它对公共安全的潜在威胁已经吸引了越来越多的关注。亚硝胺(NAs)作为有毒物质之一，其摄入被认为是众多癌症疾病的重要影响，能够导致一系列疾病比如胃癌，结肠癌和食道癌。一般来说，人类接触到的NAs主要是来自各种不同的食物和饮料，比如海鱼,腊肠,腌肉,植物油,奶酪,饮用水和啤酒等等。他们是由亚硝酸盐或者含氮氧化物的亚硝化作用产生的。因为这些原因，许多亚硝化作用的抑制剂比如α-生育酚和抗坏血酸经常被用于食物加工过程。此外，因为亚硝酸盐是亚硝胺的重要前体，因此用作防腐剂的亚硝酸盐和硝酸盐也被严格控制用量。美国环境保护署综合信息风险体系将八种亚硝胺列为人体可能致癌物，并且不同的国家严格控制了人类接触亚硝胺的最低用量。
但是目前快速灵敏的检测亚硝胺仍然是食品安全领域的一个重大挑战。到目前为止，不同的分析亚硝胺的方法已经被报道出来,比如气相色谱(GC)结合热能量分析器(TEA)或质谱检测器(MS),液相色谱结合质谱检测器(LC–MS),毛细管电泳法(CE)等等。尽管这些方法展现出了不同的特点，但是在实际应用中仍然存在或多或少的缺陷。比如，由于GC-TEA相对高的花费，这个检测器不适用于大多数实验室；因为亚硝胺的低分子量，信号会严重受到质谱背景噪音信号的干扰，同时昂贵的同位素内标试剂和复杂的仪器操作也会限制它的日常应用。相对于现有常用方法，HPLC-FLD(高效液相-荧光检测)法作为一种成熟的技术，拥有杰出的选择性和良好的重复性，在研究亚硝胺新的分析方法时是一种很好的选择，但是NAs没有荧光检测信号，因此荧光衍生化成为了提高检测灵敏度的有效手段，目前还没有关于此方面的研究报道。
此外，样品的复杂性和食品中目标分析物的极低浓度增加了萃取的难度，而分析物的萃取也是检测分析物的关键，因此为了克服这些困难，许多样品预处理技术包括液液微萃取(LLE)和固相萃取(SPE)已经被用于提取目标分析物，然而，在这些方法的应用过程中还有许多限制，比如耗时多，劳动力要求多，需要专业的仪器来自动化操作，还有溶剂消耗多，这些都严重限制了它们的日常应用。
因此，要发展一种灵敏快速的检测痕量亚硝胺的方法在分析物萃取和分析方法研究中还需要进行大量的工作。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种食品中亚硝胺的HPLC检测方法，该方法快速、简便，亚硝胺萃取率高、检测灵敏度高，具有很好的应用前景。
分散液液微萃取(DLLME)具有快速，简便，几乎可以忽略的基质效应，省时，化学试剂低消耗和高的富集效果等优点，已经吸引了越来越多的关注。本发明利用高效液相色谱荧光标记法(HPLC–FLD)结合分散液液微萃取(DLLME)来实现亚硝胺的检测，亚硝胺首先被脱亚硝基，然后用荧光试剂进行荧光标记(也称为衍生)，最后用DLLME富集。本发明使用的荧光试剂为2-(11H-苯[a]咔唑)乙基氯甲酸酯(BCEC-Cl)，亚硝胺在荧光标记后会引入一个大的疏水集团，这会大大提高其在萃取试剂中的溶解性，从而更加容易被DLLME萃取。
本发明具体技术方案如下：
一种食品中亚硝胺的HPLC检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)将食品用二氯甲烷萃取，萃取液过滤、回收二氯甲烷，剩余物用甲醇溶解，得亚硝胺溶液；
(2)将步骤(1)的亚硝胺溶液进行脱亚硝基处理，得脱亚硝基的溶液；
(3)将脱亚硝基的溶液用荧光试剂2-(11H-苯[a]咔唑)乙基氯甲酸酯(BCEC-Cl)进行荧光标记，得荧光标记的溶液；
(4)向荧光标记的溶液中加入水，然后加入萃取剂与分散剂的混合液，超声萃取后离心分离，取底层液体，得待测样品溶液；
(5)将待测样品溶液加入高相液相色谱仪，用荧光检测器检测。
上述HPLC检测方法中，所述亚硝胺为下述四种亚硝胺：N,N-二乙基亚硝胺(NPYR)，N,N-二丙基亚硝胺(NDEA)，N,N-二丁基亚硝胺(NDPA)，吡咯烷亚硝胺(NDBA)，结构式如下：
上述HPLC检测方法中，所述食品包括酱肉、泡菜、酒、咸蛋、鱼或香肠等能够工业化生产的即食食品。
上述步骤(1)中，首先要将食品中的亚硝胺进行初步的提取，基于本发明四种亚硝胺的特性，采用二氯甲烷为萃取剂进行提取。当食品为酒等液体时，每10ml食品萃取所得剩余物用1ml甲醇溶解，当食品为固态时，每10g食品萃取所得剩余物用1ml甲醇溶解。
上述HPLC检测方法中，先对亚硝胺溶液进行脱亚硝基化处理再进行荧光标记，荧光标记后再采用步骤(4)的分散液液微萃取(DLLME)方法进行富集，所用荧光试剂为2-(11H-苯[a]咔唑)乙基氯甲酸酯，简称BCEC-Cl，也可以称之为衍生化试剂。与其他荧光试剂相比，本发明所用的BCEC-Cl稳定性好、检测灵敏度更高。该BCEC-Cl可以按照现有技术公开的方法制备，例如文献：Wu H,Li G,Liu S,et al.Monitoring the contents ofsixsteroidal and phenolic endocrine disrupting chemicals in chicken,fish andaquaculture pond water samples using pre-column derivatization and dispersiveliquid–liquid microextraction with the aid ofexperimental design methodology[J].Food chemistry,2016,192:98-106.亚硝胺脱亚硝基后形成仲胺，仲胺与荧光试剂BCEC-Cl反应更快，选择性更高，副反应更少，确保了检测的快速性、充分性和灵敏性。亚硝胺在荧光标记后会引入一个大的疏水集团，这会大大提高其在萃取试剂中的溶解性，从而更加容易被DLLME萃取。如果先进行分散液液微萃取再进行荧光标记，亚硝胺的富集萃取率将大大降低，也降低了后续的检测效果。因此，本发明这一步骤顺序对亚硝胺的检测灵敏度的提升有非常有利的作用。
进一步的，上述步骤(2)中，脱亚硝基处理可以采用现有技术中公开的方法进行，例如文献:Zhao M,Li G,Kong W,et al.Convenient and Sensitive HPLC Method forDetermination of Nitrosamines in Foodstuffs Based on Pre-column FluorescenceLabeling[J].Chromatographia,2016,79(7-8):431-439.在本发明具体实施方式中，亚硝胺溶液用酸脱去亚硝基，然后调整溶液pH至中性，所得混合溶液用甲醇稀释8-10倍，得脱亚硝基的溶液，所用酸优选为体积比为5:1的乙酸和氢溴酸的混合物，脱亚硝基温度优选为70-75℃。
上述步骤(3)中，用BCEC-Cl进行荧光标记，步骤为：将脱亚硝基的溶液、pH9-10的缓冲液、乙腈、水和浓度1.0×10-3mol L-1的BCEC-Cl乙腈溶液按体积比10:80：140:700:70混合，在45-55℃下反应10-20min，反应后冷却至室温，加乙酸调节pH至酸性，得荧光标记的溶液。
上述步骤(4)中，荧光标记的溶液、水、萃取剂和分散剂的体积比为1000:6000:95:1490。
上述步骤(4)中，所述萃取剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳或二氯乙烷，优选为氯仿；所述分散剂为乙腈、丙酮或甲醇，优选为乙腈。
上述步骤(4)中，超声萃取时间为1-4min，优选为1.25min。该萃取时间短、效率高，省时省力。
上述步骤(4)中，超声萃取后，在5000rpm的速度下离心5min，取底层液体即为待测样品溶液。
进一步的，本发明采用外标法检测食品中的亚硝胺。同样的，外标法所用的亚硝胺标准品在进入高相液相色谱仪前采用与步骤(1)的亚硝胺溶液同样的脱亚硝基、荧光标记的步骤进行荧光标记。步骤包括：取亚硝胺标准品溶液，先进行脱亚硝基处理，然后用荧光试剂进行荧光标记，即得荧光标记的亚硝胺标准品溶液。
进一步的，步骤(5)中，所用色谱柱为反相ZORBAX SB-C18色谱柱，流动相A为体积分数5％的乙腈水溶液，流动相B为纯乙腈，洗脱程序为：0-20min，流动相B 75-85％；20-25min，流动相B 85-100％；荧光检测器的激发波长为279nm，发射波长为380nm。
进一步的，色谱柱柱温为30℃，待测样品溶液在高效液相色谱仪中的流速保持0.1mL min-。所有试剂在进入高效液相色谱仪前，均用0.2μm的膜滤器过滤。
本发明开发了一种利用高效液相色谱荧光标记法(HPLC–FLD)结合分散液液微萃取(DLLME)来快速、灵敏的一次性检测四种亚硝胺(N,N-二乙基亚硝胺，N,N-二丙基亚硝胺，N,N-二丁基亚硝胺，吡咯烷亚硝胺)的方法。亚硝胺首先被脱亚硝基，然后被BCEC-Cl荧光标记，最后用DLLME富集。本发明方法具有快速性，简洁性，环保性，高灵敏性、杰出选择性等优点，可以用于酱牛肉，泡菜，啤酒，咸鸭蛋，马步鱼、香肠等食品中亚硝胺的检测，在最佳条件下，目标分析物仅仅在1.25分钟内即可实现萃取富集，获得的亚硝胺检测限的范围是0.80-1.60ng L-1，明显低于现有报道过的方法，在食品安全分析方面展现出了远大前景。
附图说明
图1ZORBAX SB-C18色谱柱所得各亚硝胺标准品的色谱图。
图2Eclipse XDB-C8色谱柱所得各亚硝胺标准品的色谱图。
图3Hypersil BDS C8色谱柱所得各亚硝胺标准品的色谱图。
图4Hypersil C18色谱柱所得各亚硝胺标准品的色谱图。
图5Akasil-C18色谱柱所得各亚硝胺标准品的色谱图。
图6萃取剂和分散剂的种类与峰面积的关系曲线。
图7萃取剂和分散剂体积对NDEA的萃取效率的影响。
图8超声时间和分散剂体积对NDEA的萃取效率的影响。
图9萃取剂体积和超声时间对NDEA的萃取效率的影响。
图10四种亚硝胺标准品的色谱图。
图11酱牛肉样品中各亚硝胺的色谱图。
图12泡菜样品中各亚硝胺的色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明原理及优势进行解释和说明，以便本领域技术人员更好的理解本发明。下述说明仅是示例性的，并不对其内容进行限定。
实施例1色谱条件的筛选
1、仪器
安捷伦1260HPLC仪器被用于分析NAs。反相ZORBAX SB-C18(4.6mm×150mm,5μm)色谱柱用于NAs的色谱分离。TGL16M高速冷冻离心机被用于DLLME操作。
2、试剂
所有的NAs标准品(N,N-二乙基亚硝胺(NPYR)，N,N-二丙基亚硝胺(NDEA)，N,N-二丁基亚硝胺(NDPA)，吡咯烷亚硝胺(NDBA))购买于西格玛公司。
BCEC-Cl使用文献Wu H,Li G,Liu S,et al.Monitoring the contents of sixsteroidal and phenolic endocrine disrupting chemicals in chicken,fish andaquaculture pond water samples using pre-column derivatization and dispersiveliquid–liquid microextraction with the aid ofexperimental design methodology[J].Food chemistry,2016,192:98-106.中的方法自行合成。
3、样品准备
溶解3.2mg的BCEC-Cl于10mL乙腈中，获得1.0×10-3mol L-1的BCEC-Cl溶液。
分别取N,N-二乙基亚硝胺、N,N-二丙基亚硝胺、N,N-二丁基亚硝胺和吡咯烷亚硝胺，溶于甲醇中，配成各亚硝胺浓度均为1.0×10-2mol L-1的标准品溶液。
脱亚硝基试剂由乙酸和氢溴酸混合而成(体积比为5：1)。
所有的试剂溶液保存在4℃下。
4、荧光标记标准品溶液制备
4.1NAs脱亚硝基步骤
首先，将100μL NAs标准品溶液和10μL的脱亚硝基试剂溶液混合于安剖瓶中，随后置于70-75℃水浴中30min，然后加入0.1mol L-1的氢氧化钠溶液调节溶液至中性，此混合溶液用甲醇稀释至1mL，得脱亚硝基标准品溶液。脱亚硝基反应式如下：
4.2衍生化
将10μL脱亚硝基标准品溶液，80μL Na2B4O7–H3BO3缓冲液(pH＝9)，140μL乙腈，700μL水和70μL BCEC-Cl乙腈溶液(1.0×10-3mol L-1)依次加入锥形管中，充分混合后置于50℃条件下水浴10min，冷却至室温后，加入10μL 50％的乙酸调节pH为酸性，得荧光标记或衍生化的标准品溶液。衍生化反应式如下：
5、色谱条件的筛选
5.1将衍生化的标准品溶液用微量进样器取样，加入高相液相色谱仪进行HPLC分析，并用荧光检测器进行检测。
5.2为了得到好的分离效果，对不同的色谱柱和流动相进行试验，选择最佳的色谱条件，所用色谱柱和流动相如下表1，采用线性梯度洗脱模式。
表1
按照上表的色谱条件对衍生化的标准品溶液进行分析检测，结果显示只有ZORBAXSB-C18色谱柱展现了最佳的分离效果(见图1)，而Eclipse XDB-C8色谱柱不能将NPYR和NDEA分开(见图2)，Hypersil BDS C8色谱柱不能将NDPA和NDBA分开(见图3)，Hypersil C18色谱柱不能将NPYR和NDEA分开(见图4)，Akasil-C18色谱柱不能将NPYR和杂质峰分开(见图5)。关于流动相，结果显示乙腈水溶液比甲醇水溶液对各亚硝胺的分离效果更好，当流动相A选择体积分数5％的乙腈水溶液时，分离出峰效果最好。因此，最佳色谱条件为：ZORBAX SB-C18色谱柱，流动相A5％乙腈水溶液、流动相B 100％纯乙腈。在最佳色谱柱和流动相的基础上，经过大量的实验，对洗脱程序、柱温、进样流速进行了选择，最佳的洗脱程序为：0-20min，流动相B 75-85％；20-25min，流动相B 85-100％。柱温为30℃，流速为0.1mL min-1。
实施例2分散液液微萃取条件筛选
1、仪器
安捷伦1260HPLC仪器被用于分析NAs。反相ZORBAX SB-C18(4.6mm×150mm,5μm)色谱柱用于NAs的色谱分离。TGL16M高速冷冻离心机被用于DLLME操作。
2、试剂
所有的NAs标准品(N,N-二乙基亚硝胺(NPYR)，N,N-二丙基亚硝胺(NDEA)，N,N-二丁基亚硝胺(NDPA)，吡咯烷亚硝胺(NDBA))购买于西格玛公司。
BCEC-Cl使用文献Wu H,Li G,Liu S,et al.Monitoring the contents of sixsteroidal and phenolic endocrine disrupting chemicals in chicken,fish andaquaculture pond water samples using pre-column derivatization and dispersiveliquid–liquid microextraction with the aid ofexperimental design methodology[J].Food chemistry,2016,192:98-106.中的方法自行合成。
HPLC级分析纯乙腈，乙醇，三氯甲烷，甲醇和丙酮购买于国药化学试剂集团。氢溴酸，乙酸和二氯甲烷购买于富宇试剂公司。其他的分析级试剂被购于济宁化学试剂厂。实验过程中所用的超纯水都是由Milli-Q system净化而来。
3、色谱条件
色谱柱：反相ZORBAX SB-C18(4.6mm×150mm,5μm)色谱柱，流动相A是体积分数5％的乙腈水溶液，流动相B是100％的乙腈，采用线性梯度洗脱模式，洗脱程序如下：0-20min，流动相B 75-85％；20-25min，流动相B 85-100％。流速保持0.1mL min-1，柱温保持30℃。荧光检测器的激发波长设置在279nm，发射波长设置在380nm。所有试剂在使用之前用0.2μm的膜滤器过滤。
4、标准品准备
溶解3.2mg的BCEC-Cl于10mL乙腈中，获得1.0×10-3mol L-1的BCEC-Cl溶液。
四种浓度为1.0×10-2mol L-1的Nas标准品溶液通过溶解相应的亚硝胺于甲醇中获得。
脱亚硝基试剂由乙酸和氢溴酸混合而成(体积比为5：1)。
所有的试剂溶液保存在4℃下。
5、样品溶液制备
取2g超市购买的酱牛肉，粉碎，分别按照30ng/g、30ng/g、150ng/g、10ng/g的量向其中加入NPYR、NDEA、NDPA和NDBA，以加入不同亚硝胺的4份酱牛肉作为样品。样品处理如下：将2g加有不同亚硝胺的酱牛肉样品分别与8ml二氯甲烷混合于离心管中，然后置于超声仪中充分超声30min，随后放于离心机中以12000rpm的速度离心5min。上清液收集于安剖瓶中，经过氮吹，再重新溶于0.2mL的甲醇中，作为样品溶液。安剖瓶被封口并置于4℃条件下存放。
6、待测样品溶液和荧光标记标准品溶液制备
6.1NAs脱亚硝基步骤
首先，将100μL样品溶液(或100μLNAs标准品溶液)和10μL的脱亚硝基试剂溶液混合于安剖瓶中，随后置于70-75℃水浴中30min，然后加入0.1mol L-1的氢氧化钠溶液调节溶液至中性，此混合溶液用甲醇稀释至1mL，得脱亚硝基样品溶液或标准品溶液。
6.2衍生化
将10μL脱亚硝基样品溶液或脱亚硝基标准品溶液，80μL Na2B4O7–H3BO3缓冲液(pH＝9)，140μL乙腈，700μL水和70μL BCEC-Cl乙腈溶液(1.0×10-3mol L-1)依次加入锥形管中，充分混合后置于50℃条件下水浴10min，冷却至室温后，加入10μL 50％的乙酸调节pH为酸性，得荧光标记或衍生化的样品溶液或标准品溶液。
6.3分散液液微萃取(DLLME)
将1ml衍生化的样品溶液和6ml水混合加入10mL离心管，随后，将萃取剂和分散剂的混合液注入离心管中，超声后，混合溶液在5000rpm速度下离心5min，取沉淀在底部的有机相，为待测样品溶液。
7、HPLC-FLD检测
7.1将四种衍生化的标准品溶液分别用甲醇稀释至不同浓度，然后按照上述色谱条件进行高相液相色谱荧光检测，绘制峰面积对四种亚硝胺浓度的标准曲线。
7.2将4种待测样品溶液用微量进样器取样，加入高效液相色谱仪进行HPLC分析，并用荧光检测器进行检测，根据各样品中各亚硝胺的峰面积得到亚硝胺的含量。
7.3为了获得更高的萃取效率，通过响应面法优化法对分散液液微萃取条件进行优化。7.3.1萃取剂和分散剂优化
选择合适的萃取剂对提高DLLME的萃取效率有很大的作用。萃取剂必须满足两个条件：一方面，萃取剂的密度必须比水相的密度大，才能使包含被分析物的萃取剂在离心后沉淀在离心管底部。另一方面，萃取剂必须是不溶于水的，但能溶解分析物来确保足够大的萃取效率。此外，分散剂的选择在增大萃取剂和分析物的接触面积和加速平衡方面也起着非常重要的作用。基于萃取剂的特点，本发明选择二氯甲烷，氯仿，四氯化碳和二氯乙烷作为萃取剂，结果显示氯仿表现出了最佳的萃取效率。本发明选择乙腈，丙酮和甲醇作为分散剂，结果显示乙腈提供了最强的萃取效率。因此氯仿和乙腈被选作最佳的萃取剂和分散剂(见图6)。
7.3.2DLLME参数优化
DLLME的三个重要参数包括分散剂溶液体积(DV)，萃取剂溶液体积(EV)和超声时间(T)，这三个参数通过响应面法系统优化。实验包括了十七组随机数据实验，结果展示在表2中。所有的实验结果被多重回归分析方法分析得到如下二阶多项式模型：Y＝6.74+0.93A+0.83B－0.72C－1.08AB－0.12AC－0.025BC－1.66A2－1.31B2－1.06C2，Y代表反应变量，A,B和C分别代表DV,EV和T。
方差分析(ANOVA)被用于分析实验数据和评估模型效果。数据表明所有参数的相互作用呈现显著性(P<0.01)，同时F值呈现非显著性。相关系数R2(0.978)展示出实验数据和峰面积预测值之间的良好相符性，这进一步证明了此模型的可靠性和精确性。
表2四种亚硝胺通过响应面法优化所得的实验数据(n＝3)
响应面曲线可以反映出各变量之间的相互作用关系，图7-9是分散剂、萃取剂体积变化和超声时间对NDEA的萃取效率的影响。从图中可以看出，保持相同的超声时间，EV和DV之间展现出正相关性。随着DV或EV的值的增加，峰面积快速增长，到达最大峰值后不再有明显的变化。保持EV值不变，峰面积随着时间的增加逐渐增长，到达最高点后呈现微弱的下降趋势。同样的，EV值和T之间也呈现出了相同的变化趋势。结果表明，最佳的实验参数为：DV：1490μL；EV：95μL；T：1.25min。
实施例3
根据实施例1和2的优化，得到了本发明优选的检测方法，其具体如下：
1、色谱条件
色谱柱：反相ZORBAX SB-C18(4.6mm×150mm,5μm)色谱柱，流动相A是体积分数5％的乙腈水溶液，流动相B是100％的乙腈，采用线性梯度洗脱模式，洗脱程序如下：0-20min，流动相B 75-85％；20-25min，流动相B 85-100％。流速保持0.1mL min-1，柱温保持30℃。荧光检测器的激发波长设置在279nm，发射波长设置在380nm。所有试剂在使用之前用0.2μm的膜滤器过滤。
2、标准品准备
溶解3.2mg的BCEC-Cl于10mL乙腈中，获得1.0×10-3mol L-1的BCEC-Cl溶液。
四种浓度为1.0×10-2mol L-1的Nas标准品溶液通过溶解相应的亚硝胺于甲醇中获得。
脱亚硝基试剂由乙酸和氢溴酸混合而成(体积比为5：1)。
所有的试剂溶液保存在4℃下。
3、样品溶液制备
所有的样品处理如下：将粉碎的2g固体样品或2mL液体样品与8ml二氯甲烷混合于离心管中。然后置于超声仪中充分超声30min，随后放于离心机中以12000rpm的速度离心5min。上清液收集于安剖瓶中，经过氮吹，再重新溶于0.2mL的甲醇中。安剖瓶被封口并置于4℃条件下存放。
4、待测样品溶液和荧光标记标准品溶液制备
4.1NAs脱亚硝基步骤
首先，将100μL样品溶液(或100μLNAs标准品溶液)和10μL的脱亚硝基试剂溶液混合于安剖瓶中，随后置于70-75℃水浴中30min，然后加入0.1mol L-1的氢氧化钠溶液调节溶液至中性，此混合溶液用甲醇稀释至1mL，得脱亚硝基样品溶液或标准品溶液。
4.2衍生化
将10μL脱亚硝基样品溶液或脱亚硝基标准品溶液，80μL Na2B4O7–H3BO3缓冲液(pH＝9)，140μL乙腈，700μL水和70μL BCEC-Cl乙腈溶液(1.0×10-3mol L-1)依次加入锥形管中，充分混合后置于50℃条件下水浴10min，冷却至室温后，加入10μL 50％的乙酸调节pH为酸性，得荧光标记或衍生化的样品溶液或标准品溶液。
4.3分散液液微萃取(DLLME)
将1mL的衍生化的样品溶液和6mL水混合加入10mL离心管，随后，将95μL三氯甲烷(萃取剂)和1490μL的乙腈(分散剂)的混合液注入离心管中，超声1.25min后，混合溶液在5000rpm速度下离心5min，取沉淀在底部的有机相，为待测样品溶液。
5、HPLC-FLD检测
5.1将四种衍生化的标准品溶液分别用甲醇稀释至不同浓度，然后按照上述色谱条件进行高相液相色谱荧光检测，绘制峰面积对四种亚硝胺浓度的标准曲线。
5.2将待测样品溶液用微量进样器取样，加入高相液相色谱仪进行HPLC分析，并用荧光检测器进行检测，根据各样品中各亚硝胺的峰面积得到亚硝胺的含量。
6、方法验证
对本发明方法的线性，检测限(LOD)，定量限(LOQ)，重复性，精确度和准确度进行验证，见表3。结果显示：四种亚硝胺的浓度在3.5-400ng L-1的范围内时，峰面积和标准NAs溶液呈现出良好的线性范围，相关系数高于0.9996。检测限(信噪比为3)和定量限(信噪比为10)的范围分别为0.80-1.60ng L-1和2.50-5.10ng L-1，灵敏度高。实验的重复性通过重复测试六次来获得峰面积和保留时间的相对标准偏差(RSD)表示，从表3中看出，峰面积和保留时间的RSD分别小于2.2％和0.05％，表现出了良好的重复性。实验的精密度通过测定日内和日间的RSD来获得，从表3可以看出，日内和日间的RSD范围分别为2.0-3.2％和3.2-5.4％，精密度好。
表3线性回归方程,相关系数,检测限,定量限,重复性和日内和日间的精密度(n＝6)
将本发明方法和现有技术中最常用亚硝胺检测方法进行比较，结果如表4所示。从对比可以看出，本发明使用的仪器和检测器简单，成本低，易操作，萃取时间仅仅为1.25min，大大提高了实验效率。更重要的是，本发明检测限的范围是从0.8到1.6ng L-1，远远低于其他方法，表现出了本发明的方法对食品中痕量亚硝胺检测的可靠性。
表4本发明方法和其他方法的比较
方法 富集方法 样品类型 萃取时间 检测限 引用文献
GC–MS SPE 水 – 1.0-2.0ng/L 1
GC–MS HS-SPME 水 约63min 1.0-5.0ng/L 2
HPLC–DAD SBSE 水 约165min 80-280ng/L 3
UPLC-MS/MS SPE 水 – 500-5000ng/L 4
HPLC–FLD DLLME 食品 约1.25min 0.8-1.60ng/L 本发明
引用文献
1、Pozzi,R.,Bocchini,P.,Pinelli,F.,&Galletti,G.C.(2011).Determinationof nitrosamines in water by gas chromatography/chemical ionization/selectiveion trapping mass spectrometry.Journal of Chromatography A,1218(14),1808-1814.
2、Llop,A.,Borrull,F.,&Pocurull,E.(2010).Fully automated determinationof N‐nitrosamines in environmental waters by headspace solid‐phasemicroextraction followed by GC–MS–MS.Journal of separation science,33(23‐24),3692-3700.
3、Talebpour,Z.,Rostami,S.,&Rezadoost,H.(2015).Evaluation of a methodfor the simultaneous quantification of N‐nitrosamines in water samples basedon stir bar sorptive extraction combined with high‐performance liquidchromatography and diode array detection.Journal of separation science,38(9),1601-1609.
4、Wang,C.,Zhang,X.,Wang,J.,&Chen,C.(2012).Detecting N-nitrosamines inwater treatment plants and distribution systems in China using ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry.FrontiersofEnvironmental Science&Engineering,6(6),770-777.
7、在实际样品中的应用验证
以购自曲阜当地超市的酱牛肉，泡菜，啤酒，咸鸭蛋，马步鱼和香肠为例，采用上述步骤检测它们中的四种亚硝胺情况。四种亚硝胺标准品和酱牛肉、泡菜样品的色谱图如图10-12所示，分离效果好。六种样品中四种亚硝胺的含量检测结果见下表5。从表5中可以看出，泡菜中的亚硝胺含量是最高的，随后是酱牛肉。另一方面，NPYR和NDEA在六种样品中都被检测到，范围从5.90到45.72ng g-1，NDPA在啤酒和马步鱼中没有被发现，在其他4种样品中存在，浓度明显高于其他亚硝胺，范围为36.37-125.90ng g-1，NDBA仅仅在咸鸭蛋中被发现，含量较少。以上证明了本发明方法选择性好、灵敏度高，在检测食物中痕量亚硝胺方面表现出了强大的潜在应用价值。
表5各样品中4种亚硝胺的含量(n＝3)
对比例1
以酱牛肉为例，按照实施例3的方法制备待测样品溶液和对待测样品溶液进行检测，不同的是：先进行分散液液微萃取，再进行荧光标记，步骤如下：
将粉碎的2g酱牛肉与8ml二氯甲烷混合于离心管中。然后置于超声仪中充分超声30min，随后放于离心机中以12000rpm的速度离心5min。上清液收集于安剖瓶中，经过氮吹，再重新溶于0.2mL的甲醇中，得样品溶液。安剖瓶被封口并置于4℃条件下存放。
将1mL的样品溶液和6mL水混合加入10mL离心管，随后，将95μL三氯甲烷(萃取剂)和1490μL的乙腈(分散剂)的混合液注入离心管中，超声1.25min后，混合溶液在5000rpm速度下离心5min，取沉淀在底部的有机相，得富集的样品溶液。
将100μL富集的样品溶液和10μL的脱亚硝基试剂溶液混合于安剖瓶中，随后置于70-75℃水浴中30min，然后加入0.1mol L-1的氢氧化钠溶液调节溶液至中性，此混合溶液用甲醇稀释至1mL，得待测样品溶液。
将该待测样品溶液进行HPLC-FLD检测，结果如下表6所示。
表6
对比例2
以酱牛肉为例，按照实施例3的方法检测酱牛肉中四种亚硝胺的含量，不同的是：衍生化的样品溶液按照以下方法进行分散液液微萃取(DLLME)：将1mL的衍生化的样品溶液和6mL水混合加入10mL离心管，随后，将200μL二氯乙烷(萃取剂)和1600μL的甲醇(分散剂)的混合液注入离心管中，超声1.25min后，混合溶液在5000rpm速度下离心5min，取沉淀在底部的有机相，为待测样品溶液。
将该待测样品溶液进行HPLC-FLD检测，结果如下表7所示。
表7
对比例3
以酱牛肉为例，按照实施例3的方法检测酱牛肉中四种亚硝胺的含量，不同的是，衍生化样品溶液按照下述不同的方法制得：
方法1：将10μL脱亚硝基样品溶液或脱亚硝基标准品溶液，80μLpH＝5-6的磷酸盐缓冲液，200μL乙腈,500μL水和70μLBCEC-Cl乙腈溶液(1.0×10-3mol L-1)依次加入锥形管中，充分混合后置于80℃条件下水浴10min，冷却至室温后，加入10μL 50％的乙酸调节pH为酸性，得荧光标记或衍生化的样品溶液或标准品溶液。
方法2：将10μL脱亚硝基样品溶液或脱亚硝基标准品溶液，80μLpH＝9的磷酸盐缓冲液，140μL乙腈，700μL水和70μL 1,2-benzo-3,4-dihydrocarbazole-9-ethylchloroformate(BCEOC)乙腈溶液(1.0×10-3mol L-1)依次加入锥形管中，充分混合后置于50℃条件下水浴10min，冷却至室温后，加入10μL 50％的乙酸调节pH为酸性，得荧光标记或衍生化的样品溶液或标准品溶液。
方法3：将10μL脱亚硝基样品溶液或脱亚硝基标准品溶液，80μLpH＝9的磷酸盐缓冲液，140μL乙腈，700μL水和70μL 2-(9-carbazole)-ethyl(CEOC)乙腈溶液(1.0×10-3molL-1)依次加入锥形管中，充分混合后置于50℃条件下水浴10min，冷却至室温后，加入10μL50％的乙酸调节pH为酸性，得荧光标记或衍生化的样品溶液或标准品溶液。
将按照这三种衍生化方法得到的待测样品溶液进行HPLC-FLD检测，结果如下表8所示。
表8
对比例4
采用实施例3的方法检测食品中莱克多巴胺的含量，步骤如下：
1、标准溶液配制
(1)莱克多巴胺标准品溶液：准确取一定量莱克多巴胺标准品，用甲醇配成1.0×10-3mol L-1的溶液。
(2)衍生试剂溶液：溶解3.2mg的BCEC-Cl于10mL乙腈中，获得1.0×10-3mol L-1的BCEC-Cl溶液。
2、样品溶液配制
因实际样品中一般不含莱克多巴胺，所以采用在样品中加入莱克多巴胺的方式模拟含有莱克多巴胺的样品。取超声购买的酱牛肉2g，按照50ng/g的量加入莱克多巴胺标准品，搅拌混匀，作为待检样品，将待检样品用4mL的乙腈－水(80:20，v/v)萃取两次，超声5min，离心5min(5000rpm)。随后，将收集的上清液在氮气下干燥，再用1mL水溶解，然后通过0.22μm的尼龙过滤器过滤，得样品溶液。
3、衍生化处理
3.1、将10μL样品溶液或标准品溶液，80μL Na2B4O7–H3BO3缓冲液(pH＝9)，140μL乙腈，700μL水和70μL BCEC-Cl乙腈溶液(1.0×10-3mol L-1)依次加入锥形管中，充分混合后置于50℃条件下水浴10min，冷却至室温后，加入10μL 50％的乙酸调节pH为酸性，得荧光标记或衍生化的样品溶液或标准品溶液。
3.2、将1mL的衍生化的样品溶液和6mL水混合加入10mL离心管，随后，将95μL三氯甲烷(萃取剂)和1490μL的乙腈(分散剂)的混合液注入离心管中，超声1.25min后，混合溶液在5000rpm速度下离心5min，取沉淀在底部的有机相，为待测样品溶液。
4、HPLC-FLD检测
4.1将标准品溶液分别用甲醇稀释至不同浓度，然后按照下述色谱条件进行高相液相色谱荧光检测，绘制峰面积对浓度的标准曲线。色谱条件为：反相ZORBAX SB-C18(4.6mm×150mm,5μm)色谱柱，流动相A是体积分数5％的乙腈水溶液，流动相B是100％的乙腈，采用线性梯度洗脱模式，洗脱程序如下：0-20min，流动相B 75-85％；20-25min，流动相B85-100％。流速保持0.1mL min-1，柱温保持30℃。荧光检测器的激发波长设置在279nm，发射波长设置在380nm。所有试剂在使用之前用0.2μm的膜滤器过滤。
4.2将待测样品溶液用微量进样器取样，加入高效液相色谱仪进行HPLC分析，并用荧光检测器进行检测，结果如表9所示。
表9

Claims (7)

1.一种食品中亚硝胺的HPLC检测方法，其特征是包括以下步骤：
（1）将食品用二氯甲烷萃取，萃取液过滤、回收二氯甲烷，剩余物用甲醇溶解，得亚硝胺溶液；
（2）将步骤（1）的亚硝胺溶液进行脱亚硝基处理，得脱亚硝基的溶液；
（3）将脱亚硝基的溶液用荧光试剂2-(11H-苯[a]咔唑)乙基氯甲酸酯进行荧光标记，得荧光标记的溶液；
（4）向荧光标记的溶液中加入水，然后加入萃取剂与分散剂的混合液，超声萃取后离心分离，取底层液体，得待测样品溶液；
（5）将待测样品溶液加入高相液相色谱仪，用荧光检测器检测；
步骤（3）中，荧光标记的步骤为：将脱亚硝基的溶液、pH9-10的缓冲液、乙腈、水和浓度1.0×10-3 mol L-1的BCEC-Cl乙腈溶液按体积比10:80：140:700:70混合，在45-55℃下反应10-20min，反应后冷却至室温，加乙酸调节pH至酸性，得荧光标记的溶液；
步骤（4）中，荧光标记的溶液、水、萃取剂和分散剂的体积比为1000:6000:95:1490；
步骤（4）中，所述萃取剂为氯仿；所述分散剂为乙腈；
步骤（5）中，所用色谱柱为反相ZORBAX SB-C18色谱柱，流动相A为体积分数5%的乙腈水溶液，流动相B为纯乙腈，洗脱程序为：0-20 min，流动相B 75-85%；20-25min，流动相B 85-100%；荧光检测器的激发波长为279 nm，发射波长为380 nm；
所述亚硝胺为N,N-二乙基亚硝胺、N,N-二丙基亚硝胺、N,N-二丁基亚硝胺或吡咯烷亚硝胺。
2.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征是：所述食品为即食食品，包括酱肉、泡菜、酒、咸蛋、鱼或香肠。
3.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征是：步骤（1）中，食品为液体时，每10ml食品萃取所得剩余物用1ml甲醇溶解，食品为固态时，每10g食品萃取所得剩余物用1ml甲醇溶解。
4.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征是：步骤（2）中，将亚硝胺溶液在70-75℃下用酸脱去亚硝基，然后调整溶液pH至中性，所得混合溶液用甲醇稀释8-10倍，得脱亚硝基的溶液，所述酸为体积比为5:1的乙酸和氢溴酸的混合物。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征是：采用外标法检测食品中的亚硝胺，外标法所用的亚硝胺标准品在进入高相液相色谱仪前通过与步骤（1）的亚硝胺溶液同样的脱亚硝基、荧光标记的步骤进行荧光标记。
6.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征是：步骤（4）中，超声萃取时间为1-4min；超声萃取后，在5000rpm的速度下离心5 min，取底层液体即为待测样品溶液。
7.根据权利要求6所述的HPLC检测方法，其特征是：步骤（4）中，超声萃取时间为1.25min。
CN201610565710.8A 2016-07-19 2016-07-19 食品中亚硝胺的hplc检测方法 Expired - Fee Related CN106018624B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610565710.8A CN106018624B (zh) 2016-07-19 2016-07-19 食品中亚硝胺的hplc检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610565710.8A CN106018624B (zh) 2016-07-19 2016-07-19 食品中亚硝胺的hplc检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106018624A CN106018624A (zh) 2016-10-12
CN106018624B true CN106018624B (zh) 2018-10-12

Family

ID=57119594

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610565710.8A Expired - Fee Related CN106018624B (zh) 2016-07-19 2016-07-19 食品中亚硝胺的hplc检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106018624B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106483230B (zh) * 2016-03-16 2019-10-18 南方医科大学南方医院 一种尿液羟基多环芳烃的快速检测方法
CN107064385A (zh) * 2017-04-13 2017-08-18 国家烟草质量监督检验中心 一种基于疏水离子交换固相萃取的牛肝菌中n‑亚硝胺的提取及测定方法
CN109593676B (zh) * 2018-12-21 2023-04-07 江苏大学 一种用于酸菜发酵液中微生物分离的培养基及其制备方法
CN109856260B (zh) * 2018-12-29 2021-12-03 广电计量检测(南宁)有限公司 一种肉类食品中n-二甲基亚硝胺的检测方法
CN111122739A (zh) * 2019-12-31 2020-05-08 苏州弘森药业股份有限公司 一种检测雷尼替丁中n-二甲基亚硝胺的方法
CN112129853A (zh) * 2020-09-07 2020-12-25 天地恒一制药股份有限公司 一种坎地沙坦酯中亚硝胺类杂质的检测方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103149297A (zh) * 2013-03-01 2013-06-12 红云红河烟草(集团)有限责任公司 尿液中(s)-nnal和(r)-nnal的高效液相色谱-质谱-质谱联用检测方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9128106B2 (en) * 2013-11-05 2015-09-08 King Fahd University Of Petroleum And Minerals Dispersive liquid-liquid microextraction method of detecting N-nitrosoamines

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103149297A (zh) * 2013-03-01 2013-06-12 红云红河烟草(集团)有限责任公司 尿液中(s)-nnal和(r)-nnal的高效液相色谱-质谱-质谱联用检测方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mei Zhao等.Convenient and Sensitive HPLC Method for Determination of Nitrosamines in Foodstuffs Based on Pre‑column Fluorescence Labeling.《Chromatographia》.2016,第79卷第432-434页Materials and Methods, Results and Discussion. *
Optimization of analytical conditions for the determination of nitrosamines in chlorinated tap water by high performance liquid chromatography;Kichan Han等;《Analytical Science & Technology》;20101231;第23卷(第6期);第551-559页 *
Simultaneous Determination of Seven Biogenic Amines in Foodstuff Samples Using One-Step Fluorescence Labeling and Dispersive Liquid–Liquid Microextraction Followed by HPLC-FLD and Method Optimization Using Response Surface Methodology;Hongliang Wu等;《Food Anal. Methods》;20140802;第8卷;第687-689页和图4 *
高效液相色谱串联质谱法测定含藻水氯化消毒后7种亚硝胺物质;刘津津等;《分析化学》;20150430;第43卷(第4期);第502-506页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106018624A (zh) 2016-10-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106018624B (zh) 食品中亚硝胺的hplc检测方法
Zhang et al. A review of pretreatment and analytical methods of biogenic amines in food and biological samples since 2010
Quilliam et al. Recent developments in the analysis of phycotoxins by liquid chromatography-mass spectrometry
Erim Recent analytical approaches to the analysis of biogenic amines in food samples
Shen et al. Screening, determination and confirmation of chloramphenicol in seafood, meat and honey using ELISA, HPLC–UVD, GC–ECD, GC–MS–EI–SIM and GCMS–NCI–SIM methods
Preti et al. Fast determination of biogenic amines in beverages by a core–shell particle column
CN105866302B (zh) 一种利用超高效合相色谱串接QDa同时快速检测白酒中7种生物胺的方法
CN107941936B (zh) 分离测定利伐沙班及其杂质的方法及应用
CN101620206B (zh) 一种检测黄酒中氨基甲酸乙酯的方法
Cai et al. Rapid determination of trans-resveratrol in red wine by solid-phase microextraction with on-fiber derivatization and multidimensional gas chromatography–mass spectrometry
CN107748210A (zh) Hplc‑dad同时检测面食中多种合成色素的方法
CN101718752A (zh) 气相色谱-质谱测定化妆品中多溴联苯醚残留的检测方法
Boroduleva et al. Development of fluorescence polarization immunoassays for parallel detection of pesticides carbaryl and triazophos in wheat grains
CN104237414A (zh) 液质联用仪同时检测柑橘中多种防腐保鲜剂残留的方法
Donthuan et al. Ultrasound-assisted dispersive liquid–liquid microextraction combined with high performance liquid chromatography for sensitive determination of five biogenic amines in fermented fish samples
Iijima et al. Optimization of an online post-column derivatization system for ultra high-performance liquid chromatography (UHPLC) and its applications to analysis of biogenic amines
CN104316638A (zh) 同时检测蔬菜和水果中7种杀软体动物剂的lc-ms/ms测定方法
Yu et al. Determination of organochlorine pesticides in green leafy vegetable samples via Fe3O4 magnetic nanoparticles modified QuEChERS Integrated to dispersive liquid-liquid microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry
CN113281440A (zh) 基于UHPLC-Q-Orbitrap MS筛查和定量30种合成染料的方法及应用
Xu et al. Determination of seven biogenic amines in tuna with high-performance liquid chromatography coupled to electrospray ionization ion mobility spectrometry
CN106198788B (zh) 一种饲料或肉类食品中沙丁胺醇的hplc检测方法
CN104597186A (zh) 一种水基胶中甲醛的气相色谱/质谱联用检测方法
Du et al. Determination of 43 pesticide residues in intact grape berries (Vitis vinifera L.) by using an ultrasound-assisted acetonitrile extraction method followed by LC–MS/MS
Janeček et al. Analysis of paralytic shellfish poisoning toxins by automated pre-column oxidation and microcolumn liquid chromatography with fluorescence detection
CN113267589B (zh) 一种头发中16种合成大麻素类物质及其代谢物的分析方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20181012

Termination date: 20190719