CN104237414A - 液质联用仪同时检测柑橘中多种防腐保鲜剂残留的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检验检疫技术，尤其涉及一种液质联用仪同时检测柑橘中多种防腐保鲜剂残留的方法。该发明采用QuEChERS净化技术-超高效液相色谱－电喷雾串联四级杆质谱检测，优化分析程序和参数，对常用于柑橘保鲜的多种保鲜剂残留检测进行定性和定量方法研究，分别是多菌灵、噻菌灵、咪酰胺、抑霉唑、甲基硫菌灵、咪酰胺和2,4-D。从而建立高灵敏度、准确、快速、能同时检测多种防腐保鲜剂残留的检测技术。

Description

液质联用仪同时检测柑橘中多种防腐保鲜剂残留的方法

技术领域

本发明涉及检验检疫技术，尤其涉及一种液质联用仪同时检测柑橘中多种防腐保鲜剂残留的方法。

背景技术

我国柑橘种植面积和产量分别约占世界柑橘总面积和总产量的39％和31.6％，位列世界第一。柑橘富含多种营养成分和独特的生理活性物质，深受人们的喜爱。柑橘除用于鲜食外，也可加工成多种副产品。柑橘是我国南方地区栽培面积最大、经济地位最重要的果树之一，浙江省是我国重要的柑橘生产基地。近年来，随着柑橘产量的激增，柑橘供求关系发生了根本的变化，由卖方市场转向了买方市场，由数量型消费转变为质量型消费。柑橘产量的连年增长，使得柑橘的国内市场竞争越来越激烈，因此，扩大柑橘出口量是增加柑橘销售的重要途径。浙江省柑橘以出口鲜果和橘子罐头为主，以欧美、俄罗斯、日本和东南亚为主要市场。

然而，我国出口的一些农产品往往由于有毒有害物质残留量超过外方的限制标准，被拒收、扣留、退货、索赔和终止合同的现象屡屡发生，部分传统大宗出口创汇商品被迫退出国际市场。我国是第一水果生产大国，但在世界水果出口贸易中我国水果所占份额很小，而且售价低，有毒有害物质含量超标是造成这一局面的原因之一。发达国家通过设立严格限量标准,一方面保证本国公民的身体健康,一方面为阻碍包括水果在内的农产品进入国际市场制造技术贸易壁垒。

近年来，柑橘中的化学防腐保鲜剂对人体的危害越来越受到人们的关注。由于柑橘在采摘后的贮藏中由于自身生理活动和有害生物危害等原因，会造成损失。目前我国普遍使用防腐保鲜剂来降低因病原微生物浸染而导致柑橘在贮藏期的损失，其中化学防腐剂因其效果好、成本低、使用方便等优势占据了市场主导地位。化学防腐保鲜剂虽然具有良好的防腐保鲜的作用，但大多化学防腐保鲜剂有不同程度的毒性，柑橘中的保鲜剂残留会对人体健康产生不利影响，甚至出现致癌、致畸、致突变等情况，化学防腐保鲜剂在柑橘贮藏中的应用造成的高毒高残留问题因此也越来越受到人们的关注。一些发达国家修订的水果或柑橘中化学防腐保鲜剂限量要求日趋严格。例如我国柑橘中咪鲜胺限量为5mg/kg,而加拿大对其的限量为0.1mg/kg。日本2006年实行的农药、兽药及相关化学物质“肯定列表制度”规定水果中苯菌灵，硫菌灵，甲基硫菌灵和多菌灵总量最低限量不超过2mg/kg等。这些都有可能成为国外限制我国柑橘出口的技术壁垒，影响我国橘农增收。因此，为帮助出口企业降低风险，有效规避发达国家对我国出口柑橘的技术壁垒，发展快速、可靠、灵敏的防腐保鲜剂残留检测技术无疑是控制有毒有害物质残留、保障进出口食品安全、避免国际间有关贸易争端的基础。本研究具有重要的社会和经济意义。

我国发布实施的国家标准《食品中农药最大残留限量》(GB2763-2014)规定了水果中杀菌剂的最大残留限量，其中，多数杀菌剂可用作食品保鲜剂。多菌灵、噻菌灵、咪酰胺、抑霉唑、甲基硫菌灵、咪酰胺、2,4-D等都是常用的化学防腐保鲜剂，广泛应用于水果等多种作物生长期和储存期真菌性病害的防治，若使用不当，会在水果及由水果制成的果汁中残留。

目前，虽然已有涂膜、减压处理、高压处理、天然保鲜剂、生物保鲜剂等柑橘保鲜新技术的研究与报道，但受到技术、成本等因素影响，我国对于柑橘防腐保鲜处理普遍使用的仍是化学防腐保鲜剂。针对防腐保鲜剂的检测分析方法，已报道的主要有高效液相色谱、气相色谱、液相色谱一质谱联用及酶联免疫法等。气相色谱法或液相色谱法易受杂质干扰，且灵敏度低；酶联免疫方法操作过程繁琐，且条件要求苛刻；而液相色谱一质谱联用法溶剂消耗量大、耗时长。

由于防腐保鲜剂混配使用具有协同作用，我国柑橘主产区大多采用混配药剂来提高柑橘的防腐保鲜效果。随着混配防腐保鲜剂的广泛应用，单个防腐保鲜剂检测方法已不能满足现实需要，迫切需要能够快速、可靠的高通量检测方法，这对于保障消费者健康，避免和减少不必要的农业损失和国际贸易争端具有重要的理论和实践意义。

QuEChERS净化技术为Qucik，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe首字母的缩写，中文解释为快速、简单、经济、高效、安全的分析前处理方法，2003年由美国农业部MAnastassiades等共同研发，后经过多方面的验证和改进，正式提出了QuEChERS方法。现在QuEChERS已经成为了全球检测水果、蔬菜中农残时的标准样品处理方法。除此以外，其应用也涉及到越来越多的不同领域，比如肉类、血液样品、酒、甚至土壤中抗生素、药物、滥用药、还有其他污染物的检测。

在HPLC基础上发展起来的超高效液相色谱(UPLC)技术采用了3.5μm，甚至1.7μm细颗粒固定相，比起传统的HPLC技术,UPLC提供了更大的色谱峰容量、更高的分辨率和灵敏度以及更快的分析速度。由于柑橘中防腐保鲜剂有些化学结构，性质类似，很难在短时间内同时分离，因此本研究采用快速高效液相(UPLC)能有效的缩短分析时间、提高色谱分辨率和分析通量。液相色谱-质谱联用检测法是近几年兴起的新技术，由于液质联用技术具有极高的灵敏度，适合进行痕量分析，同时可提供的分子量和碎片质量等结构信息，可靠性较高，可同时测定多种物质，欧盟、美国等均将液质联用方法列为确证方法。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种液质联用仪同时检测柑橘中多种防腐保鲜剂残留的方法，该方法具有高灵敏度、准确、快速、能同时检测多种防腐保鲜剂残留的特点。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

液质联用仪同时检测柑橘中多种防腐保鲜剂残留的方法，所述的多种防腐保鲜剂为多菌灵、噻菌灵、咪酰胺、抑霉唑、甲基硫菌灵、咪酰胺和2,4-滴，该方法包括以下的步骤：

1)标准储备液的配制

用十万分之一天平准确称取7种保鲜剂标准品10mg于烧杯中，精确至0.1mg，加乙腈溶解并定容至10mL容量瓶中，其中噻菌灵用甲醇溶解，多菌灵用5％甲酸乙腈溶解，混匀配制成浓度为1000μg/mL的单标储备液，在冰箱中1℃～4℃保存；

2)标准工作溶液

分别准确移取1mL各单标储备液置于100mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配成10μg/mL的混合标准中间液；根据需要移取适量混合标准中间液，用稀释成2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的标准工作溶液，所述的乙腈-水溶液含0.15％甲酸，乙腈-水的体积比为1:1，各种标准溶液密封保存于4℃冰箱中；

3)试样制备

取200g带皮柑橘样品经四分法选取一定量的样本，经粉碎或组织捣碎机匀浆，装入样品袋中，密封、标记、1℃～4℃冰箱中冷藏待用；

4)样品提取

称取试样10g于50mL具塞离心管中，精确至0.01g，加入20mL5％甲酸-乙腈溶液，漩涡混合2min，加入1g氯化钠盐析至少30min，然后以6000r/min离心5min待净化；

5)样品净化

称取900mg无水硫酸镁、150mg PSA、150mg C18于15mL塑料离心管中，混匀作为净化试剂；准确移取6mL离心后的上清液于净化管中，涡旋混匀，以3000r/min离心5min，取1mL净化后上清液用蒸馏水稀释一倍后过0.22μm滤膜，供液相色谱串联质谱仪测定；

6)色谱测定

a)色谱柱：Hypersil GOLD C18,1.9μm,2.1mm×50mm，或相当者；

b)梯度洗脱条件：

时间/min	流速/mL/min	乙腈/％	水(含0.15％甲酸)/％
				0.00	0.2	10.0	90.0

2.00	0.2	10.0	90.0
				11.00	0.2	95.0	5.0
14.00	0.2	95.0	5.0
				14.10	0.2	10.0	90.0
18.00	0.2	10.0	90.0

c)柱温：35℃

d)进样量：2μL；

7)质谱测定

a)离子源:电喷雾离子源；

b)扫描方式:正负切换扫描；

c)检测方式:多反应监测；

d)毛细管温度：350℃；

e)蒸发温度：300℃；

f)电喷雾电压：+3500(-3000)V；

g)鞘气：30arb；

h)辅助气：10arb；

i)碰撞气：氩气；

j)SRM监测离子对、S-Lens电压、碰撞电压、扫描模式和保留时间如下：

8)仪器测定

样品进样的程序为：试剂空白、标准工作曲线、样品空白、样品添加与实际样品，重复以上步骤；

9)定量方法

按步骤8)进样，用色谱工作站建立标准工作曲线，样品采用工作曲线定量。

作为优选，所述的柑橘为蜜桔、椪柑或胡柚。

本发明采用QuEChERS净化技术-超高效液相色谱－电喷雾串联四级杆质谱检测，优化分析程序和参数，对常用于柑橘保鲜的多种保鲜剂残留检测进行定性和定量方法研究，分别是多菌灵、噻菌灵、咪酰胺、抑霉唑、甲基硫菌灵、咪酰胺和2,4-D。从而建立高灵敏度、准确、快速、能同时检测多种防腐保鲜剂残留的检测技术。

附图说明

图1为标准品的色谱图。

图2～图8为7种保鲜剂标准工作溶液线性图。

具体实施方式

1.1仪器、试剂与材料

Ultimate 3000超高效液相色谱—TSQ Vantage三重四极杆串联质谱联用仪(美国ThermoScientific公司)；MS 3digital漩涡混合器(德国IKA公司)；TGC-10M高速离心机(上海卢湘仪离心机有限公司)，用于5mL离心管；MULTIFUGE XIR高速离心机(美国Thermo公司)，用于50mL离心管。

2,4-D(98.0％)、咪鲜胺(99.0％)、抑霉唑(99.0％)、噻菌灵(99.0％)、嘧霉胺(99.0％)、甲基硫菌灵(99.0％)、多菌灵(99.5％)均购自德国DR公司。

乙腈、甲酸为色谱纯，分析纯无水硫酸镁，用前在650℃灼烧4小时，贮存于干燥器中备用；氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠均为分析纯；N-丙基乙二胺吸附剂(PSA，上海安谱科学仪器公司)，十八烷基键合硅胶吸附剂(C18，上海安谱科学仪器公司)。水应为蒸馏水或同等纯度的水，至少应达到ISO 3696二级水水平。所有试剂应适用于农药残留量分析。所有溶剂应依照与样品测定(萃取和液相色谱测定)相同的程序做空白实验以检查其纯度，溶剂色谱图的基线上应没有明显会影响残留农药测定的峰出现。

1.2标准溶液的配制

1.2.1标准储备液的配制

用十万分之一天平准确称取7种保鲜剂标准品10mg(精确至0.1mg)于烧杯中，加乙腈溶解并定容至10mL容量瓶中，其中噻菌灵用甲醇溶解，多菌灵用5％甲酸乙腈溶解，混匀配制成浓度为1000μg/mL的单标储备液。(在冰箱中1℃～4℃保存)。

1.2.2标准工作溶液

分别准确移取1mL各单标储备液置于100mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配成10μg/mL的混合标准中间液；根据需要移取适量混合标准中间液，用乙腈-水溶液(含0.15％甲酸)(1:1；v/v)稀释成2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的标准工作溶液。各种标准溶液密封保存于4℃冰箱中。

1.3实验方法

1.3.1试样制备

取200g柑橘(蜜桔、椪柑和胡柚)样品(带皮)经四分法选取一定量的样本，经粉碎或组织捣碎机匀浆，装入样品袋中，密封、标记、1℃～4℃冰箱中冷藏待用。若需留样较长时间可-18℃冷冻保存。

1.3.2样品提取

QuEChERS方法包含两个步骤即液液萃取(LLE)和微型的固相萃取(DSPE)。目前，已经形成的标准方法有加入醋酸盐缓冲体系的“AOAC Official Method 2007.01”以及采用柠檬酸盐缓冲体系的“European Standard EN 15662”,这两种方法通过缓冲盐体系的加入，使QuEChERS方法更加适用于一些对pH值较为敏感的农药的检测。

本发明对传统QuEChERS方法、AOAC方法以及EN方法进行了比较，结果显示这三种方法对抑霉唑、咪鲜胺等保鲜剂的提取回收率均较好；但由于2,4-D的分子结构中含有羧基，易溶于酸性溶剂中，采用AOAC法和EN法提取2,4-D的回收率并不理想；由于甲酸能提高测定目标物化合物的离子化效率，同时相对简单易操作，所以本研究采用甲酸乙腈溶液作为提取溶剂。此外，本研究还优化了提取溶剂甲酸乙腈溶液中甲酸的浓度。考察了0.5％、1％、2％、5％甲酸乙腈溶液作为提取溶剂，结果表明，在乙腈中加入5％的甲酸，提取回收率最佳。

称取试样10g(精确至0.01g)于50mL具塞离心管中，加入20mL5％甲酸-乙腈溶液，漩涡混合2min，加入1g氯化钠盐析至少30min，然后以6000r/min离心5min待净化。

1.3.3样品净化

称取900mg无水硫酸镁、150mg PSA、150mg C18于15mL塑料离心管中，混匀作为净化试剂。准确移取6mL离心后的上清液于净化管中，涡旋混匀，以3000r/min离心5min，取1mL净化后上清液用蒸馏水稀释一倍后过0.22μm滤膜，供液相色谱串联质谱仪测定。

1.3.4仪器参数与测定条件

1.3.4.1色谱测定条件优化

分别考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.15％甲酸水溶液、甲醇-0.15％甲酸水溶液等流动相对多菌灵、2,4-滴、咪鲜胺、抑霉唑、噻菌灵、嘧霉胺、甲基硫菌灵等目标分析物的分离效果。结果表明，以乙腈-0.15％甲酸水溶液为流动相时，目标物的分离度和峰形较好。

a)色谱柱：Hypersil GOLD C18,1.9μm,2.1mm×50mm，或相当者；

b)梯度洗脱条件见表2。

表2 梯度洗脱条件

时间/min	流速/mL/min	乙腈/％	水(含0.15％甲酸)/％
				0.00	0.2	10.0	90.0
2.00	0.2	10.0	90.0
				11.00	0.2	95.0	5.0
14.00	0.2	95.0	5.0
				14.10	0.2	10.0	90.0
18.00	0.2	10.0	90.0

c)柱温：35℃

d)进样量：2μL

1.3.4.2质谱测定条件优化

将保鲜剂标准品溶液分别采用流动注射直接进样，通过全扫描确定化合物母离子，再对母离子进行二级质谱扫描，得到碎片离子，通过优化S-Lens、碰撞能量(Collision Energy)等参数进行优化，得到二级质谱图。通过多反应离子监测(SRM)选择相对丰度较高的离子对，确定为定量和定性离子对，S-lens电压、碰撞电压等参数，优化后的质谱参数见表3。

a)离子源:电喷雾离子源。

b)扫描方式:正负切换扫描。

c)检测方式:多反应监测(SRM)

d)毛细管温度(Capillary Temperature)：350℃

e)蒸发温度(Vaporizer Temperature)：300℃

f)电喷雾电压(Spray voltage)：+3500(-3000)V

g)鞘气(Sheath gas pressure)：30arb

h)辅助气(Auxiliary gas flow)：10arb

i)碰撞气：氩气(1.5mtorr)

j)SRM监测离子对、S-Lens电压、碰撞电压、扫描模式和保留时间等信息见下表3。

表3 7种保鲜剂的多反应监测质谱参数

1.3.4.3仪器测定

样品进样的程序为：试剂空白、标准工作曲线(1.2.2)、样品空白、样品添加与实际样品，重复以上步骤。标准品的色谱图见图1。

1.3.5定量方法

按1.3.4.3进样，用色谱工作站建立标准工作曲线，样品采用工作曲线定量，工作曲线见图3。本方法线性范围为2ng/mL～100ng/mL，实验结果表明多菌灵、2，4-D等7种保鲜剂在该线性范围内其浓度与峰面积呈良好的线性关系。

按式(1)计算试样中保鲜剂含量。

$X=\frac{\mathrm{CV}}{m}\×2\·\·\·\left(1\right)$

式中：X—试样中保鲜剂的残留量，单位为微克每千克(μg/kg)；

C—由标准工作曲线得到样液中保鲜剂的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；

V—样液定容体积，单位为毫升(mL)；

m—称样量，单位为克(g)。

1.3.5基质效应

近几年，与液相色谱－电喷雾电离质谱法有关的基质效应问题逐渐引起分析工作者的关注。在常规液相色谱－质谱法的方法确证过程中，一般采用同一来源的空白样品配制系列标准样品和QC样品，以抵消基质效应对方法精密度及结果准确度产生的影响。但在实际应用中，因所测定的样品具有不同的来源或大批量测定时所涉及到的样品基质复杂多样，使得无法严格执行样品测定与基质配制曲线定量一一对应。因此，通常选择对样品进行稀释、延长目标化合物的保留时间(尽量大于3min)以及选择性质相近的基质配制曲线进行定量分析，以减小基质效应带来的误差。在本试验中，分别以椪柑、蜜桔及胡柚的空白提取液作为标准溶液的稀释液，以各组分的峰面积对质量浓度绘制基质加标标准曲线，将其斜率与标准品的标准曲线的斜率相比，斜率为80％-120％。结果表明椪柑、蜜桔和胡柚对各保鲜剂的基质效应影响不明显。

1.3.6检出限、线性范围、回收率范围和精密度

以实际检测时的信噪比(S/N>10)确定方法检出限为2μg/kg。线性范围选择2ng/mL～100ng/mL。分别在1μg/kg、5μg/kg和40μg/kg三个水平下进行空白样品加标回收和精密度试验，每个水平重复8次，实验结果表明回收率范围为80％～120％。添加回收率和精密度结果见表4-6。方法的回收率和精密度符合SN/T 0005-1996《出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定》对回收率和精密度的要求。

表4 胡柚、蜜桔、柑橘样品添加回收率(％)及精密度(n＝8)(1μg/kg)

表5 胡柚、蜜桔、柑橘样品添加回收率(％)及精密度(n＝8)(5μg/kg)

表6 胡柚、蜜桔、柑橘样品添加回收率(％)及精密度(n＝8)(40μg/kg)

Claims (2)

1.液质联用仪同时检测柑橘中多种防腐保鲜剂残留的方法，所述的多种防腐保鲜剂为多菌灵、噻菌灵、嘧霉胺、抑霉唑、咪酰胺、甲基硫菌灵和2,4-滴，其特征在于该方法包括以下的步骤：

1)标准储备液的配制

用十万分之一天平准确称取7种保鲜剂标准品10mg于烧杯中，精确至0.1mg，加乙腈溶解并定容至10mL容量瓶中，其中噻菌灵用甲醇溶解，多菌灵用5％甲酸乙腈溶解，混匀配制成浓度为1000μg/mL的单标储备液，在冰箱中1℃～4℃保存；

2)标准工作溶液

分别准确移取1mL各单标储备液置于100mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配成10μg/mL的混合标准中间液；根据需要移取适量混合标准中间液，用稀释成2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的标准工作溶液，所述的乙腈-水溶液含0.15％甲酸，乙腈-水的体积比为1:1，各种标准溶液密封保存于4℃冰箱中；

3)试样制备

取200g带皮柑橘样品经四分法选取一定量的样本，经粉碎或组织捣碎机匀浆，装入样品袋中，密封、标记、1℃～4℃冰箱中冷藏待用；

4)样品提取

称取试样10g于50mL具塞离心管中，精确至0.01g，加入20mL5％甲酸-乙腈溶液，漩涡混合2min，加入1g氯化钠盐析至少30min，然后以6000r/min离心5min待净化；

5)样品净化

称取900mg无水硫酸镁、150mg PSA、150mg C18于15mL塑料离心管中，混匀作为净化试剂；准确移取6mL离心后的上清液于净化管中，涡旋混匀，以3000r/min离心5min，取1mL净化后上清液用蒸馏水稀释一倍后过0.22μm滤膜，供液相色谱串联质谱仪测定；

6)色谱测定

a)色谱柱：Hypersil GOLD C18,1.9μm,2.1mm×50mm，或相当者；

b)梯度洗脱条件：

时间/min 流速/mL/min 乙腈/％ 水(含0.15％甲酸)/％ 0.00 0.2 10.0 90.0 2.00 0.2 10.0 90.0 11.00 0.2 95.0 5.0

14.00 0.2 95.0 5.0 14.10 0.2 10.0 90.0 18.00 0.2 10.0 90.0

c)柱温：35℃

d)进样量：2μL；

7)质谱测定

a)离子源:电喷雾离子源；

b)扫描方式:正负切换扫描；

c)检测方式:多反应监测；

d)毛细管温度：350℃；

e)蒸发温度：300℃；

f)电喷雾电压：+3500(-3000)V；

g)鞘气：30arb；

h)辅助气：10arb；

i)碰撞气：氩气；

j)SRM监测离子对、S-Lens电压、碰撞电压、扫描模式和保留时间如下：

8)仪器测定

样品进样的程序为：试剂空白、标准工作曲线、样品空白、样品添加与实际样品，重复以上步骤；

9)定量方法

按步骤8)进样，用色谱工作站建立标准工作曲线，样品采用工作曲线定量。

2.根据权利要求1所述的液质联用仪同时检测柑橘中多种防腐保鲜剂残留的方法，其特征在于所述的柑橘为蜜桔、椪柑或胡柚。