CN110187040B - 一种用于淡水养殖水体孔雀石绿残留量液相色谱-可见光和荧光同时检测的样品前处理方法 - Google Patents

Abstract

一种用于淡水养殖水体中孔雀石绿残留量的液相色谱‑可见光和荧光同时检测的前处理方法，具体步骤是：将20mL养殖淡水经膜过滤后，置于离心管中，再依次加入提取液Ⅰ2mL，提取液Ⅱ20mL，涡旋混合器上充分混合后，再加入15g无水硫酸钠固体，4500r/min离心15min后，将离心管中上清液倒入100mL蒸发瓶中，采用旋转蒸发仪，减压蒸干溶剂，向蒸发瓶中加入质量浓度为1％硼氢化钾溶液和1mL乙腈，超声波震荡后，将蒸发瓶中溶液转出，1mL乙腈洗涤蒸发瓶，合并溶液并定容至3mL，膜过滤后进样，液相色谱‑可见光和荧光法同时测定孔雀石绿残留量。优点是：方法简便，孔雀石绿的回收率高，污染小，应用范围广。

Description

一种用于淡水养殖水体孔雀石绿残留量液相色谱-可见光和 荧光同时检测的样品前处理方法

技术领域

本发明涉及一种用于水体孔雀石绿残留量液相色谱检测的前处理方法，特别涉及一种用于淡水养殖水体孔雀石绿残留量液相色谱-可见光和荧光同时检测的样品前处理方法。

背景技术

孔雀石绿(C₂₃H₂₅N₂，MG)学名为四甲基代二氨基三苯甲烷，又名品绿、孔雀绿、碱性绿等，是一类合成的三苯基甲烷类化学物质。可用作丝绸、皮革和纸张的染色，也可用作生物染色剂，还可用于预防和治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等。孔雀石绿在水霉病的治疗方面有特效，曾广泛用于水产养殖业，也曾被用于水产品的运输和贮藏过程。孔雀石绿在水产动物体内会降解成无色孔雀石绿或脱甲基生成芳香胺，这两种代谢产物均具有致畸、致癌和致突变作用。鉴于孔雀石绿自身及其动物体内代谢产物的危害性，目前许多国家都将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物，我国于2002年5月也将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中，禁止用于所有食品和动物。但由于孔雀石绿的多年使用，个别养殖水体中仍旧有痕量孔雀石绿残留，因此建立水中微量或痕量孔雀石绿的检测方法是必要的。国家标准及地方标准中，孔雀石绿的检测方法有液相色谱法、液相色谱质谱法、酶联免疫吸附法、激光拉曼光谱法等，其中以液相色谱法最为常用，检测器主要为紫外/可见光检测器或荧光检测器，液相色谱-荧光检测法检出限和灵敏度均好于液相色谱-紫外/可见光检测法。

近年来，许多学者对于水中孔雀石绿的提取和净化方法进行了探索和改进，鉴于溶剂萃取方法提取孔雀石绿时存在所需有机溶剂多，旋蒸浓缩操作后难于收集样品的缺点，CN201711377954.4公开了一种检测水产品中孔雀石绿的方法，加入适量的无水氯化钙等除水剂除水来获得上样液，但其后期的检测方法为胶体金免疫层析技术，是一种定性分析方法，对样品的净化程度要求低，因此，此种前处理方法不适合于液相色谱-可见光/荧光检测法。广东省曾经使用的地方标准DB44/T570-2008规定了水体中孔雀石绿残留量测定的液相色谱-荧光法，样品前处理方法包括有机溶剂萃取，硼氢化钾还原和固相萃取三步，样品前处理方法较为复杂，且方法的加标回收率不高(≥70％)，桂英爱(2008)对海水孔雀石绿液相色谱-可见光检测的前处理方法进行了简化，采用二氯甲烷和乙腈混合溶剂多次萃取的方法提取海水中孔雀石绿和隐性孔雀石绿，不经过净化，经二氧化铅的柱后氧化后进液相色谱-可见光检测器检测，但隐性孔雀石绿的柱后衍生法对pH要求高，孔雀石绿和隐性孔雀石绿在偏酸或偏碱性的环境中稳定性均很差，柱后衍生法存在隐性孔雀石绿被分解的危险，导致回收率不稳定。

孔雀石绿的液相色谱-荧光检测法要求样品经硼氢化钾还原后检测，但对加入的硼氢化钾的量有严格要求，国标GB/T20361-2006《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法》中水产品提取液硼氢化钾还原步骤需要重复2次，目的就是防止过量硼氢化钾对孔雀石绿的降解作用及避免孔雀石绿不完全还原的现象。但在实际检测过程中，由于原料孔雀石绿含量的不同，或色谱缓冲液pH对硼氢化钾的影响，在硼氢化钾还原步骤，经常会面对硼氢化钾加入量过高或者加入量过低的问题，这是导致孔雀石绿回收率不稳定的一个重要原因；液相色谱-可见光和荧光结合检测法有望解决这一问题。但液相色谱-可见光和荧光结合检测方法对样品前处理方法要求较高，寻求一种简便、有效的能用于水体孔雀石绿液相色谱-可见光和荧光检测的前处理方法是当务之急，解决传统方法需大量有机溶剂，步骤繁琐，而硼氢化钾的需要量必需准确的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种简便、有效、回收率高的用于淡水养殖水体孔雀石绿液相色谱-可见光和荧光法同时检测的样品前处理方法。

本发明的技术解决方案是：

一种用于淡水养殖水体中孔雀石绿残留量的液相色谱-可见光和荧光同时检测的前处理方法，其具体步骤是：

将20mL养殖淡水经0.45μm膜过滤后，置于离心管中，再依次加入提取液Ⅰ2mL，提取液Ⅱ20mL，涡旋混合器上充分混合后，再加入15g无水硫酸钠固体，4500r/min离心15min后，将离心管中上清液倒入100mL蒸发瓶中，采用旋转蒸发仪，减压蒸干溶剂，向蒸发瓶中加入质量浓度为1％硼氢化钾溶液和1mL乙腈，超声波震荡后，将蒸发瓶中溶液转出，1mL乙腈洗涤蒸发瓶，合并溶液并定容至3mL，0.45μm膜过滤后进样，液相色谱-可见光和荧光法同时测定孔雀石绿残留量；

1)所述提取液Ⅰ配制方法：对甲苯磺酸0.24g，盐酸羟胺3g，溶于超纯水中，定容至100mL；

2)所述提取液Ⅱ为乙腈和二氯甲烷混合溶液(1:2，v/v)。

进一步的，所述超声波功率为240W～400W，超声波震荡时间为3min～9min。

进一步的，所述旋转蒸发仪转速为30r/min～70r/min，水温30℃～45℃。

进一步的，所述质量浓度为1％硼氢化钾用量为1mL。

进一步的，液相色谱-可见光和荧光同时检测方法：Develosil ODS-UG色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为0.125mol/L乙酸铵(pH 4.5)-乙腈(20:80，v/v)；流速1.0mL/min；柱温35℃；进样量20μL；可见光检测波长618nm，荧光检测器激发波长265nm，发射波长360nm。

进一步的，液相色谱-可见光和荧光同时检测时，液相色谱-可见光检测或液相色谱-荧光检测样品中孔雀石绿残留量的计算公式：

其中：X——样品中孔雀石绿残留量，μg/mL；C_S——待测组分标准工作液的浓度，μg/mL；A————样品中待测组分的峰面积；A_S——待测组分标准工作液的峰面积；V————样液最终定容体积，μg/mL；V_s————样品体积，mL。

本计算方法中孔雀石绿残留量测定结果是指孔雀石绿和它的代谢物隐性孔雀石绿残留量的和，以孔雀石绿表示；

液相色谱-可见光检测的样品中孔雀石绿残留量与液相色谱-荧光检测的样品中孔雀石绿残留量的总和为最终样品中孔雀石绿残留量。

本法发明中样品中孔雀石绿回收率的计算公式

其中：X——孔雀石绿回收率，％；C₂——加标后样品溶液孔雀石绿含量测定值，μg/mL；V₂———加标后样品溶液总体积，mL；C₁———未加标样品孔雀石绿含量，μg/mL；V₁———未加标样品体积，mL；C₀———加标用孔雀石绿标准溶液的浓度，μg/mL；V₀———加入标准溶液的体积，mL。

本发明的有益效果是：

(1)采用加入硫酸钠吸取水分后低速离心的方法替代液液萃取操作，降低了操作的复杂程度，更加简单，废液少，且不影响孔雀石绿加标回收率。

(2)孔雀石绿提取液减压干燥后很容易粘在瓶壁上，难以完全溶解到乙腈中，导致和硼氢化钾的还原反应不彻底，而超声波辅助溶解的方法有效提高了这一步骤的孔雀石绿被硼氢化钾还原的效率，有效提高了孔雀石绿加标回收率。

(3)在35℃的旋转蒸发仪水浴温度条件下，通过转速的合理保证对于微量孔雀石绿的回收率。

(4)由于水体中孔雀石绿的含量不一，导致硼氢化钾用量过高或者过低的问题，在本发明中，硼氢化钾用量无需准确，解决了硼氢化钾用量需准确的问题。

硼氢化钾的定量加入，通过液相色谱-可见光检测法检测未还原的孔雀石绿，即完全还原的孔雀石绿可经液相色谱-荧光法检测并定量，而未还原的孔雀石绿会保留原有结构和颜色，可经液相色谱-可见光检测法检测并定量，两者相加即为总的孔雀石绿含量，提高孔雀石绿的回收率。方法简便，污染小，应用范围广。

具体实施方式

实施例1

将20mL养殖淡水置于离心管中，加入10mL1μg/mL孔雀石绿标准溶液，经0.45μm膜过滤后，再依次加入提取液Ⅰ2mL，提取液Ⅱ20mL，1)所述提取液Ⅰ配制方法：对甲苯磺酸0.24g，盐酸羟胺3g，溶于超纯水中，定容至100mL；2)所述提取液Ⅱ为乙腈和二氯甲烷混合溶液(1:2，v/v)；涡旋混合器上充分混合后，再加入15g无水硫酸钠固体，4500r/min离心15min后，将离心管中上清液倒入100mL蒸发瓶中，采用旋转蒸发仪，在35℃水温下，旋转蒸发转速50r/min条件下减压蒸干溶剂，向蒸发瓶中加入1mL质量浓度为1％硼氢化钾溶液和1mL乙腈，320W超声波震荡6min后，将蒸发瓶中溶液转出，1mL乙腈洗涤蒸发瓶，合并溶液并定容至3mL，0.45μm膜过滤后进样，液相色谱-可见光和液相色谱-荧光法测定孔雀石绿含量，液相色谱-可见光和荧光同时检测方法：Develosil ODS-UG色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为0.125mol/L乙酸铵(pH 4.5)-乙腈(20:80，v/v)；流速1.0mL/min；柱温35℃；进样量20μL；可见光检测波长618nm，荧光检测器激发波长265nm，发射波长360nm；液相色谱-可见光检测或液相色谱-荧光检测样品中孔雀石绿残留量的计算公式：

其中：X——样品中孔雀石绿残留量，μg/mL；C_S——待测组分标准工作液的浓度，μg/mL；A————样品中待测组分的峰面积；A_S——待测组分标准工作液的峰面积；V————样液最终定容体积，μg/mL；V_s————样品体积，mL。

本计算方法中孔雀石绿残留量测定结果是指孔雀石绿和它的代谢物隐性孔雀石绿残留量的和，以孔雀石绿表示；

液相色谱-可见光检测的样品中孔雀石绿残留量与液相色谱-荧光检测的样品中孔雀石绿残留量的总和为最终样品中孔雀石绿残留量。

样品中孔雀石绿回收率采用以下计算公式进行计算：

其中：X——孔雀石绿回收率，％；C₂——加标后样品溶液孔雀石绿含量测定值，μg/mL；V₂———加标后样品溶液总体积，mL；C₁———未加标样品孔雀石绿含量，μg/mL；V₁———未加标样品体积，mL；C₀———加标用孔雀石绿标准溶液的浓度，μg/mL；V₀———加入标准溶液的体积，mL。经计算孔雀石绿加标回收率为84.5±4.2％。

不同的提取剂对孔雀石绿加标回收率有不同的影响

本发明盐酸羟胺是还原剂，加入盐酸羟胺对杂质较少的水体中孔雀石绿加标回收率的影响不大，而对富含氧气的水体中孔雀石绿回收率的影响较大。而淡水养殖水是比较复杂的水体，不同养殖水体有机质和含氧量变化较大，按照本发明的实施例1的方法，对甲苯磺酸和盐酸羟胺提取剂Ⅰ(2mL)和提取剂Ⅱ(20mL)的体积不变，分别按照加入或不加入对甲苯磺酸和盐酸羟胺，及加入不同有机溶剂，对孔雀石绿回收率的影响，结果如表1所示。

表1不同提取剂和提取溶剂对孔雀石绿回收率的影响(n＝3)

从表1可以看出，以二氯甲烷为提取溶剂时，是否加入对甲苯磺酸和盐酸羟胺对孔雀石绿的回收率影响不大，而用乙腈做提取剂时，不加入对甲苯磺酸和盐酸羟胺显著降低了孔雀石绿的回收率，这与乙腈的极性相对较高有关，离子对试剂的加入增加了孔雀石绿在乙腈中的溶解能力，而在混合溶剂乙腈/二氯甲烷(1:2，v/v)中，孔雀石绿溶解性较好。考虑到养殖淡水的杂质多，一般会含氧化性物质，因此，采取加入对甲苯磺酸和盐酸羟胺作为提取剂Ⅰ，同时采用乙腈和二氯甲烷混合溶液(1:2，v/v)作为提取剂Ⅱ提取水体中孔雀石绿。

实施例2

将20mL养殖淡水置于离心管中，加入10mL1.0μg/mL孔雀石绿标准溶液，经0.45μm膜过滤后，加入提取液Ⅰ2mL，提取液Ⅱ20mL，1)所述提取液Ⅰ配制方法：对甲苯磺酸0.24g，盐酸羟胺3g，溶于超纯水中，定容至100mL；2)所述提取液Ⅱ为乙腈和二氯甲烷混合溶液(1:2，v/v)，涡旋混合器上充分混合后，再加入15g无水硫酸钠固体，4500r/min离心15min后，将离心管中上清液倒入100mL蒸发瓶中，采用旋转蒸发仪，采用旋转蒸发仪，在30℃水温下，旋转蒸发转速70r/min条件下减压蒸干溶剂，减压蒸干溶剂，向蒸发瓶中加入1mL质量浓度为1％硼氢化钾溶液和1mL乙腈，320W超声波震荡6min后，将蒸发瓶中溶液转出，1mL乙腈洗涤蒸发瓶，合并溶液并定容至3mL，0.45μm膜过滤后进样，液相色谱-可见光和荧光法同时测定孔雀石绿含量同实施例1，计算孔雀石绿加标回收率同实施例1，经计算加标回收率为76.5±6.2％。

实施例3

将20mL养殖淡水置于离心管中，加入10mL1.0μg/mL孔雀石绿标准溶液，经0.45μm膜过滤后，加入提取液Ⅰ2mL，提取液Ⅱ20mL，1)所述提取液Ⅰ配制方法：对甲苯磺酸0.24g，盐酸羟胺3g，溶于超纯水中，定容至100mL；2)所述提取液Ⅱ为乙腈和二氯甲烷混合溶液(1:2，v/v)，涡旋混合器上充分混合后，再加入15g无水硫酸钠固体，4500r/min离心15min后，将离心管中上清液倒入100mL蒸发瓶中，采用旋转蒸发仪，采用旋转蒸发仪，在45℃水温下，旋转蒸发转速30r/min条件下减压蒸干溶剂，减压蒸干溶剂，向蒸发瓶中加入1mL质量浓度为1％硼氢化钾溶液和1mL乙腈，320W超声波震荡6min后，将蒸发瓶中溶液转出，1mL乙腈洗涤蒸发瓶，合并溶液并定容至3mL，0.45μm膜过滤后进样，液相色谱-可见光和荧光法同时测定孔雀石绿含量同实施例1，计算孔雀石绿加标回收率同实施例1，经计算加标回收率为74.8±6.5％。

不同的旋转蒸发水温条件和转速对孔雀石绿加标回收率有不同的影响

按照本发明的实施例1的方法，对不同的旋转蒸发水温条件(30℃-45℃)和不同转速下(30r/min-90r/min)加标回收率进行检测，检测结果见表2所示，由表2可以看出较高转速或较高温度都降低了孔雀石绿回收率，而水浴温度35℃和旋转速度30r/min-70r/min是比较适合的条件。温度超过35℃以后，超过一定转速后，蒸发瓶中液体会有少量倒流入接收瓶中，使得测定结果的平行性较差。而更大的蒸发瓶(＞100mL)则使得浓缩后的孔雀石绿提取液粘壁面积更大，少量乙腈难以完全溶解，孔雀石绿的回收变得更加困难。因此，在不影响孔雀石绿回收率的前提下，适当控制旋转蒸发仪的水温和转速是必要的。

表2旋转蒸发仪的水浴温度和旋转速度对孔雀石绿回收率的影响(％，n＝3)

实施例4

将20mL养殖淡水置于离心管中，加入10mL1.0μg/mL孔雀石绿标准溶液，经0.45μm膜过滤后，加入提取液Ⅰ2mL，提取液Ⅱ20mL，1)所述提取液Ⅰ配制方法：对甲苯磺酸0.24g，盐酸羟胺3g，溶于超纯水中，定容至100mL；2)所述提取液Ⅱ为乙腈和二氯甲烷混合溶液(1:2，v/v)，涡旋混合器上充分混合后，再加入15g无水硫酸钠固体，4500r/min离心15min后，将离心管中上清液倒入100mL蒸发瓶中，采用旋转蒸发仪，在转速为50r/min和温度为35℃条件下减压蒸干溶剂，向蒸发瓶中加入1mL质量浓度为1％硼氢化钾溶液和1mL乙腈，240W超声波震荡9min后，超声波处理后，将蒸发瓶中溶液转出，1mL乙腈洗涤蒸发瓶，合并溶液并定容至3mL，0.45μm膜过滤后进样，液相色谱-可见光和荧光法同时测定孔雀石绿含量同实施例1，计算孔雀石绿加标回收率同实施例1，经计算加标回收率为78.2±5.7％。

实施例5

将20mL养殖淡水置于离心管中，加入10mL1.0μg/mL孔雀石绿标准溶液，经0.45μm膜过滤后，加入提取液Ⅰ2mL，提取液Ⅱ20mL，1)所述提取液Ⅰ配制方法：对甲苯磺酸0.24g，盐酸羟胺3g，溶于超纯水中，定容至100mL；2)所述提取液Ⅱ为乙腈和二氯甲烷混合溶液(1:2，v/v)，涡旋混合器上充分混合后，再加入15g无水硫酸钠固体，4500r/min离心15min后，将离心管中上清液倒入100mL蒸发瓶中，采用旋转蒸发仪，在转速为50r/min和温度为35℃条件下减压蒸干溶剂，向蒸发瓶中加入1mL质量浓度为1％硼氢化钾溶液和1mL乙腈，400W超声波震荡3min后，超声波处理后，将蒸发瓶中溶液转出，1mL乙腈洗涤蒸发瓶，合并溶液并定容至3mL，0.45μm膜过滤后进样，液相色谱-可见光和荧光法同时测定孔雀石绿含量同实施例1，计算孔雀石绿加标回收率同实施例1，经计算加标回收率为81.0±1.8％。

不同超声波功率和超声波时间对孔雀石绿回收率影响

按照本发明的实施例1的方法，对不同超声波功率和不同超声波时间加标回收率进行检测，检测结果如表3所示。由表3可以看出在不加超声波震荡处理的时候，孔雀石绿回收率为73.5±2.3％，远低于超声波震荡处理组。孔雀石绿提取液减压干燥后很容易粘在瓶壁上，难以完全溶解到乙腈中，导致和硼氢化钾的还原反应不彻底，而超声波清洗器的机械震荡和空化作用在原理上可使粘在瓶壁上的提取物脱离瓶壁，更易溶解于乙腈中。

表3超声波功率和时间对孔雀石绿回收率的影响(％)

实施例6

将20mL养殖淡水置于离心管中，各加入10mL0.1μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL孔雀石绿标准溶液，分别经0.45μm膜过滤后，再各加入提取液Ⅰ2mL，提取液Ⅱ20mL，1)所述提取液Ⅰ配制方法：对甲苯磺酸0.24g，盐酸羟胺3g，溶于超纯水中，定容至100mL；2)所述提取液Ⅱ为乙腈和二氯甲烷混合溶液(1:2，v/v)；涡旋混合器上充分混合后，再各加入15g无水硫酸钠固体，4500r/min离心15min后，将离心管中上清液倒入100mL蒸发瓶中，采用旋转蒸发仪，在转速为50r/min和温度为35℃条件下分别减压蒸干溶剂，向各蒸发瓶中分别加入1mL质量浓度为1％硼氢化钾溶液和1mL乙腈，320W超声波震荡6min后，将蒸发瓶中溶液转出，1mL乙腈洗涤蒸发瓶，合并溶液并定容至3mL，0.45μm膜过滤后进样，液相色谱-可见光和荧光法同时测定孔雀石绿含量同实施例1，计算孔雀石绿加标回收率同

实施例1，检测结果如表4所示。

对比例1常规液液萃取且过PRS柱净化

将三份20mL养殖淡水分别置于100mL分液漏斗中，各加入10mL0.1μg/mL、1μg/mL和5μg/mL孔雀石绿标准溶液，经0.45μm膜过滤后，再向三组溶液中分别加2mL提取液Ⅰ，20mL提取液Ⅱ，1)所述提取液Ⅰ配制方法：对甲苯磺酸0.24g，盐酸羟胺3g，溶于超纯水中，定容至100mL；2)所述提取液Ⅱ为乙腈和二氯甲烷混合溶液(1:2，v/v)；剧烈震荡5min后静置1h，取下层有机相于100mL蒸发瓶中，再往分液漏斗中加入20mL提取液Ⅱ，充分振摇，静置10min后，收集下层溶液，与第一次萃取的有机相合并。将合并收集液转移到旋转蒸发装置上，于35℃、50r/min条件下减压蒸干溶剂，用2mL乙腈洗涤蒸发瓶，洗涤液中加入1mL质量浓度为1％的硼氢化钾溶液，轻轻振摇，获得溶液Ⅰ。

将PRS柱接到固相萃取装置上，先用5mL乙腈分两次活化柱，将上述加入硼氢化钾后的溶液Ⅰ过柱，将PRS柱抽干，用3mL乙腈和乙酸铵缓冲溶液(0.1mol/L)的混合液(1:1，v/v)洗脱，收集洗脱液并定容至3mL，0.45μm膜过滤，液相色谱-可见光和荧光法同时测定孔雀石绿残留，计算孔雀石绿加标回收率。

对比例2常规液液萃取不过PRS柱

前处理方法同对比例1，直到“......洗涤液中加入1mL质量浓度为1％的硼氢化钾溶液，轻轻振摇。”为止，不经PRS柱净化，所得溶液直接用乙腈补足至3mL，0.45μm膜过滤，液相色谱-可见光和荧光法同时检测孔雀石绿含量，计算孔雀石绿加标回收率。

对比例3液相色谱-荧光法检测

采用实施例4的方法提取、净化养殖淡水中孔雀石绿，单独采用液相色谱荧光检测法检测硼氢化钾还原后孔雀石绿含量，计算孔雀石绿加标回收率。

对比例4液相色谱-可见光法检测

采用实施例4的方法提取、净化养殖淡水中孔雀石绿，旋蒸步骤不加入硼氢化钾溶液，单独采用液相色谱-可见光检测法检测孔雀石绿含量，计算孔雀石绿加标回收率。

实施例1～实施例6和对比例1～对比例4中孔雀石绿浓度的检测方法和最低检出限按下列方法进行：

(1)将浓度为1μg/mL的孔雀石绿标准溶液连续稀释成不同浓度后进样，在色谱的分析条件下，根据3倍信噪比法(检出限＝标准溶液浓度(1.0μg/mL)×3/信噪比)和10倍信噪比法(检出限＝标准溶液浓度(1.0μg/mL)×10/信噪比)，分别检测液相色谱-可见光检测法和液相色谱-荧光检测法的检出限和定量限。液相色谱-可见光检测法最低检出限为0.002μg/mL，定量限为0.007μg/mL，液相色谱-荧光检测法最低检出限为0.0002μg/mL，定量限为0.0007μg/mL。

(2)孔雀石绿含量的计算方法

1)液相色谱-可见光检测方法标准曲线的线性方程为：Y＝208.09X-0.7692，其中Y为孔雀石绿浓度(μg/mL)，X为峰面积(mAU*min)，相关系数r²＝0.9999，对比例4按此方法计算孔雀石绿浓度。

2)液相色谱-荧光法标准曲线的线性方程为：Y＝760.45X+13.095，其中Y为孔雀石绿浓度(μg/mL)，X为峰面积(mAU*min)，相关系数r²＝0.9996，对比例3按此方法计算孔雀石绿浓度。

3)水体中孔雀石绿液相色谱-可见光和荧光法同时检测的孔雀石绿残留量为上述1)和2)两种方法计算所得孔雀石绿含量的总和，实施例1-实施例6和对比例1-对比例4按此方法计算孔雀石绿浓度。

表4为实施例6和对比例1-对比例4的孔雀石绿回收率的对比表。各实施例和对比例的实验所用养殖淡水的孔雀石绿含量均为0，通过人为添加孔雀石绿标准品测定其回收率的方法来检验各检测方法的准确度。

孔雀石绿的加标量均设三个水平，分别为1μg、10μg和50μg，考察在中、低、高浓度时不同前处理方法和检测方法对孔雀石绿回收率的影响。

其中，对比例1采用传统的前处理方法：微孔滤膜过滤→溶剂提取→减压干燥→硼氢化钾还原→PRS柱净化；对比例2省略了PRS柱净化步骤，从孔雀石绿回收率的结果看，与实施例6相比，对比例1和对比例2的孔雀石绿加标回收率较低，与传统的液液萃取操作相比，加入硫酸钠脱水并低速离心的操作没有导致孔雀石绿过多的损失，操作相对容易，且不需要大量溶剂。

比较对比例1和对比例2的回收率，可以看出，是否过PRS柱净化对孔雀石绿回收率没有明显影响。但由于淡水养殖水体中藻类、淤泥等固体物质的影响，在不经过PRS柱净化的情况下，色谱柱柱效降低较快，但本发明的实施例一开始就对水体进行了0.45μm微孔滤膜过滤处理，去除了固体杂质，不会明显影响柱效，因此，在不降低孔雀石绿回收率和色谱柱柱效的前提下，可不经PRS净化处理。

对比例3是单独采用液相色谱-荧光法的检测结果，对比例3的孔雀石绿回收率相对较低，这跟硼氢化钾用量不是那么精确有关，但过量的硼氢化钾会导致孔雀石绿的损失，在加标量较高的情况下(50μg)，可能会导致孔雀石绿还原不完全，回收率较低，因此，对比例3的孔雀石绿回收率低于实施例6。

对比例4是单独采用液相色谱-可见光法的检测结果，此方法的回收率变化范围较大，检出限和定量限较高。在水体中，孔雀石绿受pH、温度、光照、水中消毒剂、自由基等的影响而发生不同程度的降解，使其618nm吸光度产生很大影响，这也是液相色谱-可见光检测法回收率不稳定的主要原因，反应在RSD相对较高。而隐性孔雀石绿是孔雀石绿的主要代谢产物，孔雀石绿和隐性孔雀石绿同时检测，一定程度上缓解了孔雀石绿受外界环境因素影响造成的回收率不稳定问题，所以，实施例6的孔雀石绿回收率高于对比例4。

综上所述，采用本发发明检测方法，微量的未还原的孔雀石绿和绝大部分已还原的隐性孔雀石绿可同时检测，与孔雀石绿的液相色谱-荧光检测法相比，采用液相色谱-可见光和荧光同时检测法可同时检测孔雀石绿和隐性孔雀石绿含量，硼氢化钾用量无需准确，避免过量硼氢化钾对孔雀石绿残留稳定性的影响，且如果出现未被硼氢化钾还原的孔雀石绿，可同时采用液相色谱-可见光检测法检测，此方法可提高孔雀石绿的回收率，比只采用液相色谱-可见光检测法检出限低且稳定，比只采用液相色谱-荧光法检测的回收率高。

表4实施例1～4与对比例1～5中不同前处理和检测方法对三个不同水平加标量孔雀石绿回收率的影响(n＝3)

在理论上，固相萃取剂对待测物质和杂质的吸附能力同为物理吸附，无差别吸附作用导致待测物质回收率降低。而传统方法中，样品溶液提取液经硼氢化钾还原后，被PRS固相萃取柱吸附后用乙腈洗脱，可能出现PRS柱层析吸附后洗脱不彻底问题，本发明解决了这一问题。

与水产品相比，水体中干扰杂质少，但由于水体孔雀石绿残留量非常低，因此，选择灵敏度较高而检出限较低的液相色谱-荧光检测方法比液相色谱-可见光检测方法更合适。因为过量的硼氢化钾会导致孔雀石绿的降解，液相色谱-荧光法对硼氢化钾的量要求较高，理论上需准确。经过前期预实验后，在本发明预处理方法中，质量浓度为1％硼氢化钾溶液的加入量可固定为1mL，避免硼氢化钾浓度过高或者用量过大对隐性孔雀石绿稳定性的影响，若因原料不同的原因而导致硼氢化钾用量不够，可通过液相色谱-可见光检测法检测未还原的孔雀石绿，即完全还原的孔雀石绿可经液相色谱-荧光法检测并定量，而未还原的孔雀石绿会保留原有结构和颜色，可经液相色谱-可见光检测法检测并定量，两者相加即为总的孔雀石绿含量，提高孔雀石绿的回收率。方法简便，污染小，应用范围广。

Claims (2)

1.一种用于淡水养殖水体中孔雀石绿残留量的液相色谱-可见光和荧光同时检测的前处理方法，其特征是：

具体步骤是：

将20mL养殖淡水经0.45μm膜过滤后，置于离心管中，再依次加入提取液Ⅰ2mL，提取液Ⅱ20mL，涡旋混合器上充分混合后，再加入15g无水硫酸钠固体，4500r/min离心15min后，将离心管中上清液倒入100mL蒸发瓶中，采用旋转蒸发仪，减压蒸干溶剂，向蒸发瓶中加入质量浓度为1%硼氢化钾溶液和1mL乙腈，超声波震荡后，将蒸发瓶中溶液转出，1mL乙腈洗涤蒸发瓶，合并溶液并定容至3mL，0.45μm膜过滤后进样，液相色谱-可见光和荧光法同时测定孔雀石绿残留量；

所述超声波功率为320W，超声波震荡时间为 6 min；

所述旋转蒸发仪转速为50r/min，水温35℃；

所述质量浓度为 1%硼氢化钾溶液用量为 1 mL；

液相色谱-可见光和荧光同时检测时，液相色谱-可见光检测或液相色谱-荧光检测样品中孔雀石绿残留量的计算公式：

其中：X——样品中孔雀石绿残留量，μg/mL；C _S——待测组分标准工作液的浓度，μg/mL；

A——样品中待测组分的峰面积；A _S——待测组分标准工作液的峰面积；V——样液最终定容体积，L；Vs——样品体积，mL；本计算方法中孔雀石绿残留量测定结果是指孔雀石绿和它的代谢物隐性孔雀石绿残留量的和，以孔雀石绿表示；

液相色谱-可见光检测的样品中孔雀石绿残留量与液相色谱-荧光检测的样品中孔雀石绿残留量的总和为最终样品中孔雀石绿残留量；

1）所述提取液Ⅰ配制方法：对甲苯磺酸0.24g，盐酸羟胺3g，溶于超纯水中，定容至100mL；

2）所述提取液Ⅱ为体积比为1:2的乙腈和二氯甲烷混合溶液。

2.根据权利要求1所述的用于淡水养殖水体中孔雀石绿残留量的液相色谱-可见光和荧光同时检测的前处理方法，其特征是：液相色谱-可见光和荧光同时检测方法：DevelosilODS-UG色谱柱，250mm×4.6mm，5μm；流动相为0.125mol/L乙酸铵-乙腈，其中乙酸铵的pH4.5，乙酸铵和乙腈的体积比为20:80；流速1.0mL/min；柱温35℃；进样量20μL；可见光检测波长618nm，荧光检测器激发波长265nm，发射波长360nm。