CN115420813A - 一种结合QuEChERS和柱前衍生前处理测定烟叶中抗蚜威农药残留的方法 - Google Patents

一种结合QuEChERS和柱前衍生前处理测定烟叶中抗蚜威农药残留的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于食品安全检测领域，本发明公开了一种结合QuEChERS和柱前衍生前处理测定烟叶中抗蚜威农药残留的方法，具体是烟叶经过提取和QuEChERS净化后，进行柱前衍生，取衍生化合物用液相色谱检验检测，对于复杂基质的抗干扰能力强，方法灵敏度高，准确性和重复性好，前处理更便捷的检测方法。

Description

一种结合QuEChERS和柱前衍生前处理测定烟叶中抗蚜威农药 残留的方法
技术领域
本发明属于食品安全检测领域，涉及一种结合QuEChERS和柱前衍生前处理测定烟叶中抗蚜威农药残留的方法。
背景技术
抗蚜威农药是以甲酸酯为前体化合物合成从而得到的一种农药，灭虫原理是抑制乙酰胆碱酯酶在昆虫体内的活性从而降低昆虫的神经传导功能的一种神经内毒素，具有一定的遗传毒性和细胞毒性。其广泛应用于农业生产，具有灭虫效果明显、选择性高、和残留期短等特点，但是若大量使用而不加以控制，其残留物则会转移到食品中，造成人和动物的中毒，从而危害人类健康和环境污染，因此，国家标准GB2763-2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》对不同蔬菜中抗蚜威农药的限量有相应的规定。
目前我国对于抗蚜威农药残留量的测定方法主要有：气相色谱法、气相色谱-质谱法、高效液相色谱－质谱法、柱后衍生－荧光检测器的高效液相色谱法、超临界流体色谱法,其中液质和气质联用仪价格昂贵，在各级地方实验室不适合普及实验成本过高，而气相色谱法由于需要在高温高压的条件下将目标物质气化在进入色谱柱进行分离，而抗蚜威农药有一定的热不稳定性，在高温的碱性条件下会分解，所以气相色谱法也有一定的局限性，现在主流的检测方法和我国现行国家标准GB23200.112-2018针对植物源性食品中9种氨基甲酸酯类农药及其代谢物残留的测定采用的都是液相色谱-柱后衍生化法，但是柱后衍生化法由于色谱柱到检测器的过程中还增加了衍生器，所以待测物质还要通过漫长的通路才会进入荧光检测器进行检测，所以会导致仪器死体积过大，进而导致样品扩散致使色谱峰容易变宽及峰型变差，影响对目标物质的定性和定量。而且柱后衍生一般需要衍生试剂大量过载，从而保证充分的衍生反应才能确保定量结果的准确性。还存在衍生试剂大量浪费的情况。
在前处理方面，常用的有固相萃取法，液-液萃取法，凝胶渗透色谱法，固相微萃取法等，这些前处理方法和QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe)法即为“快速、简易、廉价、有效、稳定、安全”的萃取方法相比存在前处理效率低，耗时，实验成本过高的问题。
本文通过对平时日常实验的经验总结，结合大量文献的查阅，创新的建立了一种QuEChERS前处理法和柱前衍生法结合高效液相色谱分析烟叶中抗蚜威农药的检测方法。该方法创新的使用柱前衍生法替代以往普遍使用的柱后衍生法，从而不用使用柱后衍生仪，色谱柱也可以使用普通的C18色谱柱，大大降低了实验成本，并且结合QuEChERS前处理，降低了实验难度，减少了实验时间，大大提高工作效率。目前QuEChERS前处理-柱前衍生法结合高效液相色谱测定烟叶中抗蚜威农药还未见报道，本文着眼于此点开发了此方法。
发明内容
(1)拟解决的问题
本发明的目的在于提供一种结合QuEChERS和柱前衍生前处理测定烟叶中抗蚜威农药残留的方法，该方法创新的使用柱前衍生法替代以往普遍使用的柱后衍生法，从而不用使用柱后衍生仪，色谱柱也可以使用普通的C18色谱柱，大大降低了实验成本，并且结合QuEChERS前处理，降低了实验难度，减少了实验时间，大大提高工作效率，前处理简单，方法灵敏度高，重复性好。
(2)本发明采用如下技术方案实现
本发明创新的结合了柱前衍生、液相色谱分离理论和荧光检测技术实现了烟叶中抗蚜威农药残留含量的稳定、准确测定。
具体而言，本发明测定烟叶中抗蚜威农药残留含量的方法，包括以下步骤：
1)烟叶样品震荡提取
称取10.00g均质完毕样品(市售烟叶)于50ml离心管中，加入1％(v/v)乙酸乙腈溶液10ml和2-3g NaCl后，振荡提取10min后，于9500r/min离心5min。
2)QuEChERS净化：
取上层清液5mL于预先加有200mg PSA和900mg无水硫酸镁(MgSO4)的离心管中，涡旋提取15s，在9500r/min离心5min，取上层提取液2.0ml于试管中，氮气浓缩至近干。
3)柱前衍生过程：
取净化好的前处理液，加入(pH＝3)酸化水溶液500μl、250μlOPA/2-巯基乙醇溶液和250μl0.05 mol/L氢氧化钠水溶液涡旋1min溶解，经0.2μm微孔膜过滤于进样小瓶中,用(pH＝3)酸化水溶液定容1ml，80℃避光水浴加热30min后，衍生完成。
4)高效液相色谱-荧光检测器(HPLC-FLD)分析检测。
上述步骤1中，所述的震荡提取方法，包括：提取液通过以下方法制备得到：取1ml乙酸溶于100ml乙腈中得到1％(v/v)乙酸乙腈溶液，Nacl的添加量为2-3g。
上述步骤2中，所述的QuEChERS净化，包括：QuEChERS净化包的吸附剂填料种类和比例为：PSA 200mg+MgSO4 900 mg作为净化吸附剂。
上述步骤3中，所述的柱前衍生过程，包括：
(1)(pH＝3)酸化水溶液通过以下方法制备得到：用HCl将500ml净水酸化到pH＝3，并用已校正的pH计进行测定。
(2)0.05mol/L硼酸钠水溶液通过以下方法制备得到：称取19.1g Na2B4O7·10H2O，完全溶解于1L水中。溶解过程可能会将近1小时。
(3)氢氧化钠水溶液通过以下方法制备得：称取片状NaOH 1g于500mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，混合均匀。用0.45μm的滤膜过滤并脱气，滤液储存于棕色瓶中。
(4)OPA/2-巯基乙醇溶液通过以下方法制备得：取50mg OPA试剂于5mL甲醇中，缓慢旋转使其完全溶解后，转移至一个500mL的容量瓶中，用硼酸钠溶液稀释到刻度并混合均匀，用0.45μm的滤膜过滤并脱气。然后，加入0.5mL 2－巯基乙醇，缓慢旋转直至混合均匀。一旦2-巯基乙醇加入后，切勿再将溶液脱气，将此溶液置于一个密闭的棕色玻璃储液瓶中，用铝箔包裹避光保存。
(5)氢氧化钠水溶液的添加量为250ul
(6)OPA/2-巯基乙醇溶液的添加量为250ul
(7)衍生化温度和时间为80℃避光水浴加热30min后
上述步骤4中，所述的仪器准备为调整各项参数至工作状态：色谱条件EXTEND-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：30℃，进样体积：400μl，流速：1.0ml/min，FLD检测器：激发波长：339nm；发射波长：445nm；增益：10，流动相：A相为纯水，B相为色谱甲醇，C相为色谱乙腈，梯度洗脱程序：0-5.3min,88％A，12％B，5.3-14min,88-68％A，12-16％B，0-16％C，14-18min，68-50％A，16-25％B，16-25％C，20-30min，50-88％A，25-12％B，25-0％C，
发明人进行了大量的实验，以下是本发明所述检测方法的研究
实验例1：检测方法研究
1仪器与试剂
1.1仪器：型号为：1260II高效液相色谱仪并且配备荧光检测器(FLD)美国安捷伦公司；PH校准仪，上海雷磁公司；Milli-Q academic超纯水系统制备(美国Millipore公司)电阻率为18.2MΩ·cm；FSH-II型高速电动匀浆器；TECHNE型氮吹仪；高速离心机：美国赛默飞公司；HZQ/THZ振荡器；C18色谱柱(4.6mm×250mm，5.0μm)：美国沃特世公司；AE100电子分析天平，瑞士MET-TLERTOLEDO公司；
1.2试剂：抗蚜威农药标准品浓度为：1000μg/mL，上海安谱实验科技股份有限公司；样品：市售烟叶，甲醇、乙腈(色谱纯)；德国Merck公司；盐酸，分析纯，上海沃凯生物；N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳黑(GCB)、C18固相吸附剂，安捷伦科技公司；邻苯二甲醛(OPA)稀释溶液、邻苯二甲醛(OPA)，纯度≥97％、2-巯基乙醇，纯度≥98％Pickering公司，片状氢氧化钠，氯化钠，无水硫酸镁，十水硼酸钠均为分析纯，上海国药集团。
1.3溶液配制
1.3.1：衍生试剂的配制：0.05mol/L硼酸钠水溶液：称取19.1g Na2B4O7·10H2O，完全溶解于1L水中。溶解过程可能会将近1小时。氢氧化钠水溶液的配制(0.05mol/L)称取片状NaOH1g于500mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，混合均匀。用0.45μm的滤膜过滤并脱气，滤液储存于棕色瓶中。OPA/2-巯基乙醇溶液：取50mg OPA试剂于5mL甲醇中，缓慢旋转使其完全溶解后，转移至一个500mL的容量瓶中，用上述中的硼酸钠缓冲液稀释到刻度并混合均匀，用0.45μm的滤膜过滤并脱气。然后，加入0.5mL 2－巯基乙醇，缓慢旋转直至混合均匀。一旦2-巯基乙醇加入后，切勿再将溶液脱气，将此溶液置于一个密闭的棕色玻璃储液瓶中，用铝箔包裹避光保存。
标准溶液的配制：(pH＝3)酸化水溶液用HCl将500ml净水酸化到pH＝3，并用已校正的pH计进行测定。
标准储备液：准确吸取浓度为：1000μg/mL标准溶液1ml，于10ml容量瓶中，最后用乙腈定容，得到100μg/ml的混合标准储备液。
标准工作液的配制：分别吸取100μg/ml的标准储备液10,100,200,500,1000μl于5个100ml容量瓶中，用(pH＝3)酸化水溶液稀释到刻度。完全混合，得到0.01,0.1,0.2,0.5,1.0μg/ml标准曲线。储存于棕色玻璃瓶中，充氮气，除湿隔绝空气于冷冻装置中密闭保存，此溶液至少稳定3个月。
2实验操作
2.1样品前处理
2.1.1样品提取
称取10.00g均质完毕样品(市售烟叶)于50ml离心管中，加入1％(v/v)乙酸乙腈溶液10ml和2-3g NaCl后，振荡提取10min后，于9500r/min离心5min。
2.1.2.QuEChERS净化
取上层清液5mL于预先加有200mg PSA和900mg无水硫酸镁(MgSO4)的离心管中，涡旋提取15s，在9500r/min离心5min，取上层提取液2.0ml于试管中，氮气浓缩至近干。
2.1.3柱前衍生过程
取上述试管，加入(pH＝3)酸化水溶液500μl、250μlOPA/2-巯基乙醇溶液和250μl0.05 mol/L氢氧化钠水溶液涡旋1min溶解，经0.2μm微孔膜过滤于进样小瓶中,用(pH＝3)酸化水溶液定容1ml，80℃避光水浴加热30min后，衍生完成，供液相色谱检测。
2.2 HPLC色谱条件
EXTEND-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：30℃，进样体积：400μl，流速：1.0ml/min，FLD检测器：激发波长：339nm；发射波长：445nm；增益：10，流动相：A相为纯水，B相为色谱甲醇，C相为色谱乙腈，梯度洗脱程序：0-5.3min,88％A，12％B，5.3-14min,88-68％A，12-16％B，0-16％C，14-18min，68-50％A，16-25％B，16-25％C，20-30min，50-88％A，25-12％B，25-0％C，2.3线性关系，线性范围
配制抗蚜威农药标准溶液，浓度分别为0.01,0.1,0.2,0.5,1.0μg/ml按照上述色谱条件进样分析。以的质量浓度为横坐标(X，μg/ml)、峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。使用阴性烟叶样品中添加0.01mg/kg和0.05mg/kg分别做检出限和定量限实验，分别以3倍信噪比(S/N＝3)和10倍信噪比(S/N＝10)，确定方法检出限和(LOD)方法定量限(LOQ)。从下表1可以看抗蚜威农药在给定的浓度范围内线性关系良好，相关系数R2为0.9995，可以满足定性定量检测需求。
表1烟叶中抗蚜威农药的线性回归方程，相关系数及检出限
Figure BDA0003711530450000051
3.结果
3.1衍生条件优化
3.1.1氢氧化钠溶液添加量的优化
在不加氢氧化钠浓度水溶液时，衍生反应无法发生，本实验采用氢氧化钠水溶液作为水解试剂，考察了固定衍生反应时间、温度、待测物质和OPA衍生试剂浓度时，分别考察了50；100；150；200；250；300μl不同氢氧化钠水溶液添加量的水解效果，结果见(附图1)表明当添加量达到200μl时各标准物质衍生效果接近最大当浓度达到250μl时各标准物质峰面积稳定，再次增大氢氧化钠水溶液添加量，目标物质峰面积不变，综合考虑，本实验优选250μl为氢氧化钠水溶液的最佳添加量。
3.1.2.OPA/2-巯基乙醇溶液添加量的优化
由于抗蚜威农药不具备典型的荧光和紫外吸收基团，所以需要进行衍生化反应使之具有荧光吸收的特征检验基团，方能在荧光检测器上有特征响应。本实验选用OPA/2-巯基乙醇溶液为衍生试剂，按照分别1.3.3中所述方法配制，分别考察了固定衍生反应时间、温度、待测物质和氢氧化钠水解液浓度时50；100；150；200；250；300μl不同衍生试剂添加量的衍生效果，对比衍生后待测分析物的峰面积，结果见(附图2)，实验结果表明添加量达到200μl时各标准物质衍生效果最大各标准物质峰面积稳定，衍生化反应一般需要衍生试剂过载才能够保证衍生反应完全，本实验本着保证衍生化反应充分，定量准确和节约试剂用量的原则，最终选择250μl为最佳衍生试剂添加量。
3.1.3色谱柱选择
氨基甲酸酯类农药没有特征的光谱吸收基团,需要在碱性条件下可以与OPA/2-巯基乙醇反应生成具有强荧光吸收的异氮(杂)茚基衍生物，可以降低待测物的极性，增大离子的电离效率，改善色谱分离度，提高检测器响应，由于待测物的极性降低，从而可以使用普通的非极性C18色谱柱进行色谱分离，本实验考察了BEH-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；T3色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)和EXTEND-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)。结果表明，使用T3色谱柱分离后，存在拖尾，峰型较差。在所选定的仪器条件下，色谱图见(附图3和附图4)。
3.1.4提取溶剂优化
现在果蔬中农药的提取多是采用甲醇，乙腈或是酸性的甲醇和乙腈，本实验以烟叶为基质，同时以1mg/kg浓度加标，本别考察了乙腈，甲醇，1％(v/v)乙酸甲醇，1％(v/v)乙酸乙腈，结果表明甲醇和1％(v/v)乙酸甲醇，提取效率不如乙腈和1％(v/v)乙酸乙腈的效果好，根据平时实验经验分析，甲醇相较于乙腈与水的互溶性更强，导致在后续前处理中加入盐，分层效果不如乙腈甚至是无法分层，导致有相当大一部分水残留在有机相中，增大了共提取物的含量，而盐的加入能够明显的使乙腈有机相和水相明显分离，所以乙腈作为提取剂的提取效果更好，比较纯乙腈和1％(v/v)乙酸乙腈提取效果，发现1％(v/v)乙酸乙腈提取效果略好，是因为酸化的乙腈溶液形成了弱酸性的缓冲提取溶剂体系，能够一定程度的提高回收率，各种类氨基甲酸酯类农药平均回收率达到92.8％，所以本实验优选1％(v/v)乙酸乙腈为提取溶剂。
3.1.5QuEChER方法的优化
目前QuEChERS中用到的吸附剂填料主要有乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基键合硅胶(C18)、石墨化炭黑(GCB)和无水硫酸镁(MgSO4)，根据平时实验经验和文献的查阅可知，PSA可通过弱阴离子和极性相互作用，从而吸附极性强的脂肪酸类和酚类干扰物，而C18则相反通过非极性相互作用，吸附极性较弱的色素，维生素E，油脂，烯烃类，甾类干扰物质，GCB主要用于吸附样品中的色素，(MgSO4)主要用于吸附样品中水分。本实验以1mg/kg加标浓度，选取5种氨基甲酸酯类农药分别考查了4种吸附剂组合，分别为I：PSA 200mg+MgSO4900 mg；II:GCB 15mg+PSA 200mg+MgSO4 900 mg；III：PSA 150mg+C18 50 mg+MgSO4 900mg；IV：GCB 15mg+PSA 150mg+C18 50mg+MgSO4 900 mg，按照2.1中所述的前处理提取和衍生，但是净化分别考察上述4种组合净化，结果见附图5。结果表明：组合I的回收率高于组合II，这是因为GCB对抗蚜威农药有一定的吸附作用，导致回收率降低，C18在日常检测中主要用于吸附酯类物质，而烟叶中脂类物质较少，导致C18对抗蚜威农药产生了吸附，所以可以看出组合II的回收率高于组合III，组合Ⅳ的回收率为4种组合中最低，是由于GCB和C18共同对氨基甲酸酯类农药的吸附而导致的结果，为本结论和冯婉莹等研究结果一致，所以本实验优选组合I：PSA 200mg+MgSO4 900 mg作为净化吸附剂。
3.2方法学验证
3.2.1线性关系，线性范围
配制抗蚜威农药标准溶液，浓度分别为0.01,0.1,0.2,0.5,1.0μg/ml按照上述色谱条件进样分析。以的质量浓度为横坐标(X，μg/ml)、峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。使用阴性烟叶样品中添加0.01mg/kg和0.05mg/kg分别做检出限和定量限实验，分别以3倍信噪比(S/N＝3)和10倍信噪比(S/N＝10)，确定方法检出限和(LOD)方法定量限(LOQ)。从下表1可以看抗蚜威农药在给定的浓度范围内线性关系良好，相关系数R2为0.9995，可以满足定性定量检测需求。
表1烟叶中抗蚜威农药的线性回归方程，相关系数及检出限
Figure BDA0003711530450000071
3.2.2方法可行性验证
加标回收实验
使用检测为阴性的烟叶作为样品进行加标回收实验，对样品0.05、0.25、0.5mg/kg进行三个水平的加标回收实验，每个试验对象做6次平行试验并计算其平均回收率，结果见表2，可以看出平均回收率在84.44％-87.09％之间，相对标准偏差(RSD)在1.4％-2.4％之间，表明该方法的精密性和重现性良好，可以满足GB27404中有关多残留测定的要求。
表2烟叶中抗蚜威3个水平下的添加回收率及相对标准偏差(n＝6)
Figure BDA0003711530450000072
3.3实际烟叶样品的检测
从贵阳市农贸市场随机购买30份烟叶样品，通过前处理，色谱条件检测，结果显示有6份样品检测出阳性，检出率为20％，其中最高的检出值为0.06mg/kg，其余样品均未检出。
4.结论
本实验建立了一种QuEChERS前处理-柱前衍生法结合高效液相色谱测定烟叶中抗蚜威农药残留的分析方法，相较于传统的检测方法能够减少柱后衍生仪的使用，大大降低实验成本，和简化前处理步骤。该方法的重现性好，准确度高，线性关系良好，平均回收率在84.44％-87.09％，相对标准偏差(RSD)在1.4％-2.4％之间，可满足烟叶中抗蚜威的快速定性和定量检测。
附图说明
图1是氢氧化钠水溶液用量对抗蚜威回收率的影响的柱状图
图2是衍生剂OPA/2-巯基乙醇溶液用量对抗蚜威回收率的影响的柱状图
图3抗蚜威标准溶液色谱图
图4烟叶空白基质色谱图
图5烟叶中抗蚜威在4种净化剂中的回收率(1.0mg/kg)
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例一：
1、仪器与试剂
1.1仪器型号为：1260II高效液相色谱仪并且配备荧光检测器(FLD)美国安捷伦公司；PH校准仪，上海雷磁公司；Milli-Q academic超纯水系统制备(美国Millipore公司)电阻率为18.2MΩ·cm；FSH-II型高速电动匀浆器；TECHNE型氮吹仪；高速离心机：美国赛默飞公司；HZQ/THZ振荡器；C18色谱柱(4.6mm×250mm，5.0μm)：美国沃特世公司；AE100电子分析天平，瑞士MET-TLERTOLEDO公司；
1.2试剂
抗蚜威农药标准品浓度为：1000μg/mL，上海安谱实验科技股份有限公司；样品：市售烟叶，甲醇、乙腈(色谱纯)；德国Merck公司；盐酸，分析纯，上海沃凯生物；N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳黑(GCB)、C18固相吸附剂，安捷伦科技公司；邻苯二甲醛(OPA)稀释溶液、邻苯二甲醛(OPA)，纯度≥97％、2-巯基乙醇，纯度≥98％Pickering公司，片状氢氧化钠，氯化钠，无水硫酸镁，十水硼酸钠均为分析纯，上海国药集团。
2.色谱条件
EXTEND-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：30℃，进样体积：400μl，流速：1.0ml/min，FLD检测器：激发波长：339nm；发射波长：445nm；增益：10，流动相：A相为纯水，B相为色谱甲醇，C相为色谱乙腈，梯度洗脱程序：0-5.3min,88％A，12％B，5.3-14min,88-68％A，12-16％B，0-16％C，14-18min，68-50％A，16-25％B，16-25％C，20-30min，50-88％A，25-12％B，25-0％C，3.溶液配制
3.1衍生试剂的配制
1.3.1：0.05mol/L硼酸钠水溶液：
称取19.1g Na2B4O7·10H2O，完全溶解于1L水中。溶解过程可能会将近1小时。
1.3.2：氢氧化钠水溶液的配制(0.05mol/L)
称取片状NaOH 1g于500mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，混合均匀。用0.45μm的滤膜过滤并脱气，滤液储存于棕色瓶中。
1.3.3：OPA/2-巯基乙醇溶液：
取50mg OPA试剂于5mL甲醇中，缓慢旋转使其完全溶解后，转移至一个500mL的容量瓶中，用步骤1.3.1中的硼酸钠缓冲液稀释到刻度并混合均匀，用0.45μm的滤膜过滤并脱气。然后，加入0.5mL 2－巯基乙醇，缓慢旋转直至混合均匀。一旦2-巯基乙醇加入后，切勿再将溶液脱气，将此溶液置于一个密闭的棕色玻璃储液瓶中，用铝箔包裹避光保存。
4.样品前处理
样品提取
称取10.00g均质完毕样品(市售烟叶)于50ml离心管中，加入1％(v/v)乙酸乙腈溶液10ml和2-3g NaCl后，振荡提取10min后，于9500r/min离心5min。
QuEChERS净化
取上层清液5mL于预先加有200mg PSA和900mg无水硫酸镁(MgSO4)的离心管中，涡旋提取15s，在9500r/min离心5min，取上层提取液2.0ml于试管中，氮气浓缩至近干。
柱前衍生过程
取上述试管，加入(pH＝3)酸化水溶液500μl、250μlOPA/2-巯基乙醇溶液和250μl0.05 mol/L氢氧化钠水溶液涡旋1min溶解，经0.2μm微孔膜过滤于进样小瓶中,用(pH＝3)酸化水溶液定容1ml，80℃避光水浴加热30min后，衍生完成，供液相色谱检测。
5.色谱分析
色谱条件：EXTEND-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：30℃，进样体积：400μl，流速：1.0ml/min，FLD检测器：激发波长：339nm；发射波长：445nm；增益：10，流动相：A相为纯水，B相为色谱甲醇，C相为色谱乙腈，梯度洗脱程序：0-5.3min,88％A，12％B，5.3-14min,88-68％A，12-16％B，0-16％C，14-18min，68-50％A，16-25％B，16-25％C，20-30min，50-88％A，25-12％B，25-0％C，
6.最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (9)

1.一种结合QuEChERS和柱前衍生前处理测定烟叶中抗蚜威农药残留的方法，其特征在于：
先将烟叶样品用1％(v/v)乙酸乙腈溶液震荡提取后，通过QuEChERS前处理除去杂质，取除杂后的前处理液在高温强碱(NAOH)条件下水解，样品水解后与.OPA/2-巯基乙醇溶液发生衍生化反应，生成具有强荧光吸收的异氮(杂)茚基衍生物，使用高效液相色谱仪-荧光检测器检测。
具体包括以下步骤：
步骤1：烟叶样品震荡提取：称取10.00g均质完毕样品(市售烟叶)于50ml离心管中，加入1％(v/v)乙酸乙腈溶液10ml和2-3g NaCl后，振荡提取10min后，于9500r/min离心5min。
步骤2：QuEChERS净化：取上层清液5mL于预先加有200mg PSA和900mg无水硫酸镁(MgSO4)的离心管中，涡旋提取15s，在9500r/min离心5min，取上层提取液2.0ml于试管中，氮气浓缩至近干。
步骤3：柱前衍生过程：取净化好的前处理液，分别加入(pH＝3)酸化水溶液500μl、250μlOPA/2-巯基乙醇溶液和250μl0.05 mol/L氢氧化钠水溶液涡旋1min溶解，经0.2μm微孔膜过滤于进样小瓶中,用(pH＝3)酸化水溶液定容1ml，80℃避光水浴加热30min后，衍生完成。
步骤4、高效液相色谱-荧光检测器(HPLC-FLD)分析检测。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤1中，所述的震荡提取方法，包括：
提取液通过以下方法制备得到：取1ml乙酸溶于100ml乙腈中得到1％(v/v)乙酸乙腈溶液，Nacl的添加量为2-3g。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤2中，所述的QuEChERS净化，包括：QuEChERS净化包的吸附剂填料种类和比例为：PSA 200mg+MgSO4900 mg作为净化吸附剂。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤3中，所述的柱前衍生过程包括：(pH＝3)酸化水溶液通过以下方法制备得到：用HCl将500ml净水酸化到pH＝3，并用已校正的pH计进行测定。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤3中，所述的柱前衍生过程包括：0.05mol/L硼酸钠水溶液通过以下方法制备得到：称取19.1g Na2B4O7·10H2O，完全溶解于1L水中。溶解过程可能会将近1小时。
6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤3中，所述的柱前衍生过程包括：氢氧化钠水溶液通过以下方法制备得：称取片状NaOH 1g于500mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，混合均匀。用0.45μm的滤膜过滤并脱气，滤液储存于棕色瓶中。
7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤3中，所述的柱前衍生过程包括：OPA/2-巯基乙醇溶液通过以下方法制备得：取50mg OPA试剂于5mL甲醇中，缓慢旋转使其完全溶解后，转移至一个500mL的容量瓶中，用硼酸钠溶液稀释到刻度并混合均匀，用0.45μm的滤膜过滤并脱气。然后，加入0.5mL 2－巯基乙醇，缓慢旋转直至混合均匀。一旦2-巯基乙醇加入后，切勿再将溶液脱气，将此溶液置于一个密闭的棕色玻璃储液瓶中，用铝箔包裹避光保存。
8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤3中，所述的柱前衍生过程包括：氢氧化钠水溶液的添加量为250ul,OPA/2-巯基乙醇溶液的添加量为250ul.衍生化温度和时间为80℃避光水浴加热30min后。
9.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤4中，HPLC-FLD分析检测，包括：
(1)色谱条件如下：EXTEND-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：30℃，进样体积：400μl，流速：1.0ml/min，FLD检测器：激发波长：339nm；发射波长：445nm；增益：10，流动相：A相为纯水，B相为色谱甲醇，C相为色谱乙腈，梯度洗脱程序：0-5.3min,88％A，12％B，5.3-14min,88-68％A，12-16％B，0-16％C，14-18min，68-50％A，16-25％B，16-25％C，20-30min，50-88％A，25-12％B，25-0％C。
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