CN103926340B - 一种化妆品中硝基呋喃类抗生素的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种化妆品中硝基呋喃类抗生素的测定方法,包括如下步骤:(1)样品的预处理:将样品置于体积比为70:30的乙腈和甲醇的混合溶液中,混匀后超声提取,离心,取上清液氮吹至近干,采用体积比为85:15的15mmol/L乙酸铵溶液和乙腈的混合溶液溶解残渣,过0.22μm微孔滤膜,滤液备用;(2)对所述滤液进行高效液相色谱分离,流动相采用梯度洗脱程序进行洗脱,外标法定量;(3)检出的阳性样品采用高效液相色谱-质谱/质谱法进行确证,本发明所述方法同时完成呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮和呋喃西林四种硝基呋喃类抗生素的检测。本发明所述方法准确、可靠且灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗生素的测定方法,特别是涉及一种化妆品中硝基呋喃类抗生素的测定方法。
背景技术
硝基呋喃类药物是一种广谱抗生素,因其杀菌能力强、抗菌谱广、不易产生耐药性、价格低廉及疗效好,在临床得到广泛应用。该类抗生素主要用于治疗泌尿系统感染、肠道细菌感染、皮肤创伤感染以及作为食品添加剂预防家禽肠道传染病。常见的硝基呋喃类抗生素主要包括四种:呋喃妥因(Furadantin,NFT)、呋喃唑酮(Furazolidone,FZD)、呋喃它酮(Furaltadone,FTD)及呋喃西林(Furacilin,NFZ),它们都是人工合成的具有5-硝基呋喃基本结构的抗菌药物。据了解,硝基呋喃类药物尽管不会产生急性、亚急性危害,但人体长期大量接触或摄入硝基呋喃类化合物,存在致癌、致畸胎的可能性,而且长期接触该类药物会使使用者产生耐药性,降低此类药物的临床治疗效果,对人体的潜在危害不容忽视。
硝基呋喃类药物进入人体后迅速被吸收,其主要毒副作用主要表现为:(1)对人体有较强的毒性作用,长时间或大剂量接触硝基呋喃类药物均能对人体产生毒性作用,其中呋喃西林的毒性最大,呋喃唑酮的毒性相对较小;(2)致癌致畸致突变副作用:呋喃它酮为强致癌性药物,呋喃唑酮为中等强度致癌药物;(3)周围神经炎,表现为手足麻木,久之可致肌萎缩,往往迁延难愈;(4)过敏反应(包括气喘、胸闷、皮疹、药物热、嗜酸性粒细胞增多);(5)胃肠道反应和中毒性精神症状如幻听、幻觉、烦躁等;(6)溶血性贫血、黄疸、肺部并发症等。
鉴于硝基呋喃类药物有可能作为祛痘化妆品添加剂使用,为了避免含有此类药物的化妆品给消费者带来健康危害,欧盟化妆品法规(EC1223/2009)、我国《化妆品卫生规范》等法律法规中均明确规定硝基呋喃类抗生素在化妆品中为禁用物质。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种准确、可靠且灵敏度高的化妆品中硝基呋喃类抗生素的测定方法。
一种化妆品中硝基呋喃类抗生素的测定方法,包括如下步骤:
(1)样品的预处理:将样品置于体积比为70:30的乙腈和甲醇的混合溶液中,混匀后超声提取,离心,取上清液氮吹至近干,采用体积比为85:15的15mmol/L乙酸铵溶液和乙腈的混合溶液溶解残渣,过0.22μm微孔滤膜,滤液备用;
(2)对所述滤液进行高效液相色谱分离,流动相采用梯度洗脱程序进行洗脱,外标法定量,色谱分离条件:色谱柱:WatersXTerraMSC18,5μm,4.6mm×250mm;流动相:乙酸铵和乙腈的混合溶液;柱温:30℃;进样量:10μL;检测器:二极管阵列检测器,检测波长:365nm;
(3)经过步骤(2)得到的检出阳性样品采用高效液相色谱-质谱/质谱法进行确证,所述高效液相色谱-质谱/质谱法确证条件为:
色谱柱:WatersSunfireC18,3.5μm,2.1mm×150mm;流动相:乙腈和0.1%甲酸-水的混合溶液,梯度洗脱;柱温:30℃;流速:0.2mL/min;进样量:5μL;毛细管电压:3.2kV;脱溶剂气温度:400℃;脱溶剂气流速:800L/h;锥孔气体流速:50L/h;离子源温度:150℃;萃取电压:3.00V;射频透镜电压:0.10V;碰撞气体:氩气;数据采集模式:多反应监测;
所述方法同时完成呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮和呋喃西林四种硝基呋喃类抗生素的检测。
本发明所述的化妆品中硝基呋喃类抗生素的测定方法,其中,步骤(2)中所述乙酸铵溶液的浓度为15mmol/L,由1.1g乙酸铵溶于1000mL水中制备而成,所述梯度洗脱程序见表1,其中,A为乙酸铵溶液,B为乙腈;
表1.高效液相色谱梯度洗脱程序
本发明所述的化妆品中硝基呋喃类抗生素的测定方法,其中,步骤(3)中所述梯度洗脱程序见表2,其中,A为乙腈,B为0.1%甲酸水溶液,四种硝基呋喃类抗生素的质谱分析参数见表3;
表2.高效液相色谱-质谱/质谱确证条件中高效液相色谱梯度洗脱程序
表3.四种硝基呋喃类抗生素的质谱分析参数
*定量离子
本发明所述的化妆品中硝基呋喃类抗生素的测定方法,其中,步骤(1)具体包括如下步骤:称取0.5g化妆品于25mL比色管中,加入体积比为70:30的乙腈和甲醇的混合溶液,定容至10mL刻度,涡旋振荡混匀,于超声波水浴中超声提取30min后,5000rpm高速离心10min,取2mL上清液氮吹至近干,加入1mL体积比为85:15的15mmol/L乙酸铵溶液和乙腈的混合溶液溶解残渣,过0.22μm微孔滤膜,滤液供高效液相色谱分析测定及高效液相色谱-质谱/质谱确证。
本发明所述的化妆品中硝基呋喃类抗生素的测定方法,其中,取样0.5g时,呋喃妥因、呋喃唑酮及呋喃西林的检出限为2mg/kg,定量限为5mg/kg,呋喃它酮的检出限为2.5mg/kg,定量限为7.5mg/kg。
本发明化妆品中硝基呋喃类抗生素的测定方法与现有技术不同之处在于:本发明化妆品中硝基呋喃类抗生素的测定方法对样品进行处理后,首先采用高效液相色谱分离检测找到疑似的阳性样品,进而再采用高效液相色谱-质谱/质谱法对疑似阳性样品进行确证;本发明建立的化妆品中四种硝基呋喃类抗生素的测定方法准确、可靠、简便、特异性及灵敏度高;采用质谱确证手段,有效避免了假阳性结果的产生。因此,建立的方法可以为化妆品的检验工作和日常生产的质量控制提供有效的科学依据及技术支持。
本发明化妆品中硝基呋喃类抗生素的测定方法中,取样0.5g时,呋喃妥因、呋喃唑酮及呋喃西林的检出限为2mg/kg,定量限为5mg/kg,呋喃它酮的检出限为2.5mg/kg,定量限为7.5mg/kg。在添加浓度为5~20mg/kg范围内,呋喃妥因、呋喃唑酮及呋喃西林的平均回收率在85.0%~96.6%,6次平行测定结果相对标准偏差在2.4%~9.5%之间;在添加浓度为7.5~30mg/kg范围内,呋喃它酮的平均回收率为92.8%~99.6%,6次平行测定结果相对标准偏差为2.1%~8.9%。
下面结合附图对本发明的化妆品中硝基呋喃类抗生素的测定方法作进一步说明。
附图说明
图1为本发明方法中四种硝基呋喃类抗生素的结构式,其中编号1为呋喃妥因,2为呋喃唑酮,3为呋喃它酮,4为呋喃西林;
图2为本发明方法中四种硝基呋喃类抗生素的高效液相色谱图,其中编号1为呋喃西林,编号2为呋喃妥因编号3为呋喃唑酮,编号4为呋喃它酮;
图3为本发明方法中四种硝基呋喃类抗生素的高效液相色谱-质谱/质谱多反应监测色谱图,其中,编号1为呋喃它酮,编号2为呋喃西林,编号3为呋喃妥因,编号4为呋喃唑酮;
图4为本发明方法中四种硝基呋喃类抗生素色谱图随光照时间的变化情况;
图5为本发明方法中不同提取溶剂对硝基呋喃类抗生素的提取效果;其中,编号1为呋喃西林,编号2为呋喃妥因,编号3为呋喃唑酮,编号4为呋喃它酮;
图6为本发明方法中1μg/mL混合标准溶液的色谱图;
图7为本发明方法中20mg/kg空白加标样品的色谱图;
图8为本发明方法中空白水剂类化妆品的色谱图;
图9为本发明方法中空白膏霜类化妆品的色谱图。
具体实施方式
实施例1
1、仪器及试剂
Agilent1200液相色谱仪(配二极管阵列检测器)(美国Agilent公司);紫外可见分光光度计(SHIMADZUUV-3600);电子天平(AB204-S,美国METTLERTOLEDO公司);超纯水器(Milli-Q,美国Millipore公司);高速冷冻离心机(CR21G,日本Hitachi公司);MS2型涡旋振荡器(德国IKA公司);氮吹仪(N-EVP112,美国OrganomationAssociatesInc);通风柜(FC-150,大连莱博泰克实验室设备有限公司);微孔滤膜(0.22μm,有机系,美国Pall公司);甲醇、乙腈为色谱纯(Fisher公司);乙酸铵为分析纯(含量≥98.0%,广东省汕头市西陇化工股份有限公司)
呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮及呋喃西林四种物质的详细信息见表4,四种硝基呋喃类抗生素的结构式见图1。
表4.四种硝基呋喃类抗生素物质的CAS号、分子式及保存条件等信息
2、标准溶液的配制
四种1mg/mL硝基呋喃类抗生素的标准储备溶液:分别称取呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮及呋喃西林各10.0mg(精确至0.0001g)于10mL棕色容量瓶中,呋喃妥因、呋喃唑酮及呋喃它酮均用10mL乙腈溶解至刻度,摇匀;呋喃西林用甲醇-乙腈(2mL+8mL)溶解至刻度,摇匀。各标准储备溶液均在避光、4℃条件下保存。
100μg/mL硝基呋喃类抗生素混合标准储备溶液:取呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮及呋喃西林标准储备溶液各1mL于10mL棕色容量瓶中,用乙腈稀释至刻度,避光、4℃条件下保存。
硝基呋喃类抗生素混合标准工作溶液:用初始流动相逐级稀释100μg/mL硝基呋喃类药物混合标准储备溶液,配制成0.1,0.2,0.5,1,2,5,10,20,50μg/mL混合标准工作溶液
3、样品预处理
称取0.5g(精确至0.01g)化妆品于25mL比色管中,加入乙腈+甲醇(70+30)比例混合溶剂,定容至10mL刻度,涡旋振荡混匀,于超声波水浴中超声提取30min后,5000rpm高速离心10min,取2mL上清液氮吹至近干,准确加入1mL体积比为85:15的15mmol/L乙酸铵溶液和乙腈的混合溶液溶解残渣,过0.22μm微孔滤膜,滤液供分析测定。
4、色谱分离条件:
色谱柱:WatersXTerraMSC18(5μm,4.6mm×250mm)
流动相:A:15mmol/L乙酸铵溶液(1.1g乙酸铵溶于1000mL水)
B:乙腈
柱温:30℃
进样量:10μL
检测器:二极管阵列检测器,检测波长:365nm
表1.高效液相色谱梯度洗脱程序
四种硝基呋喃类抗生素的高效液相色谱图见图2。
5、高效液相色谱-质谱/质谱确证条件
色谱柱:WatersSunfireC18(3.5μm,2.1mm×150mm)
流动相:A:乙腈B:0.1%甲酸水溶液
柱温:30℃
流速:0.2mL/min
进样量:5μL
毛细管电压:3.2kV
脱溶剂气温度:400℃
脱溶剂气流速:800L/h
锥孔气体流速:50L/h
离子源温度:150℃
萃取电压:3.00V
射频透镜电压:0.10V
碰撞气体:氩气
数据采集模式:多反应监测
高效液相色谱-质谱/质谱确证中流动相梯度洗脱程序见表2,四种硝基呋喃类抗生素化合物的质谱分析相关参数见表3,高效液相色谱-质谱/质谱多反应监测色谱图见图3。
表2.高效液相色谱-质谱/质谱确证条件中高效液相色谱梯度洗脱程序
表3.四种硝基呋喃类抗生素的质谱分析参数
*定量离子
实施例2
标准溶液的配制及稳定性考察
在标准溶液配制过程中,根据文献中的操作要求,当配制1mg/mL储藏液时,发现用一般的单一有机溶剂(乙腈及甲醇)很难将呋喃西林标准品完全溶解,实验中采用乙腈和甲醇之间的比例混合溶液作为溶解该物质的溶剂,发现当用20%的甲醇-乙腈时,可完全溶解该化合物。
由于硝基呋喃类物质本身不稳定,在高温、空气暴露及阳光直射等条件下会部分降解损失,因此,本实验考察了四种化合物在阳光直射1h、2h及3h条件下的色谱图变化情况,如图4所示,考察了四种硝基呋喃类抗生素的高效液相色谱图随时间的变化情况,结果显示,随时间的延长,色谱峰数量的增加及信号响应强度的降低,均表明硝基呋喃类抗生素可能遭部分降解。因此,本实验操作过程中应尽量在避光条件下进行。
紫外吸收波长的选择
采用紫外可见分光光度计对呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮及呋喃西林进行200~400nm波长范围内的紫外光谱扫描,实验结果表明,四种物质的紫外光谱图相似。在261nm和365nm附近均有两个吸收高峰,同时使用261nm和365nm检测波长进行分析,结果发现,前者的杂质响应值较高,对实验结果会造成较大干扰,而后者的杂质响应值极低,检测效果较好,因此,本实验选择365nm作为该高效液相色谱分析测定方法中的紫外检测波长。
流动相的选择
在液相色谱分析过程中,流动相的组成对目标物质色谱峰的保留时间及峰形起着至关重要的作用。根据文献检索,在硝基呋喃类药物分析检测中,通常采用乙腈和其他不同种类的缓冲盐或有机弱酸。因此,本研究考察了不同种类的流动相:(I)乙腈+0.2%甲酸;(II)乙腈+0.3%甲酸;(III)乙腈+0.4%甲酸;(IV)乙腈+0.2%乙酸;(V)乙腈+0.3%甲酸;(VI)乙腈+0.4%甲酸;(VII)15mmol/L乙酸铵-乙腈对四种硝基呋喃类物质色谱峰形的影响。实验结果表明,前六种流动相对呋喃它酮和呋喃西林色谱峰形影响较大,使得呋喃它酮的信号响应值较低,而呋喃西林的色谱峰形前展严重。而采用15mmol/L乙酸铵-乙腈作流动相进行梯度洗脱,四种硝基呋喃类物质均表现为峰形尖锐、对称,响应值高,出峰时间也较合理。因此,本实验中采用15mmol/L乙酸铵-乙腈作为硝基呋喃类物质洗脱分离时的流动相。
提取条件的选择
常用的用于硝基呋喃类药物提取的溶剂多为乙腈,但鉴于呋喃西林在乙腈中存在不完全溶解的现象,因此,本研究考察了以下七种溶剂(I)甲醇;(II)乙腈;(III)乙腈+甲醇(90+10);(IV)乙腈+甲醇(80+20);(V)乙腈+甲醇(70+30);(VI)乙腈+甲醇(60+40);(VII)乙腈+甲醇(50+50)对化妆品基质类型中的硝基呋喃类药物的超声提取30min时的效果,结果见图5。实验结果表明,甲醇对硝基呋喃类药物的提取效果相对较差,回收率在67.4%~77.2%之间,乙腈对目标物质的提取效果也不及乙腈和甲醇的比例混合溶液,回收率在68.8%~78.8%之间,不同比例的乙腈和甲醇混合溶液对硝基呋喃类药物的提取效果相对较好,通过比较,发现体积比为乙腈+甲醇(70+30)溶剂对目标物质的提取效果最好,回收率在71.6%~86.4%之间,因此,本实验选择体积比为乙腈+甲醇(70+30)比例混合溶剂作为化妆品中四种硝基呋喃类抗生素的提取溶剂。
方法的线性相关性及灵敏度
取系列标准工作溶液进行高效液相色谱测定,实验结果表明,在浓度0.1~50μg/mL范围内四种硝基呋喃类抗生素的色谱峰面积(Y)与浓度(X)均呈线性相关,线性相关系数均不小于0.9999(表5)。
向空白化妆品中添加不同浓度的4种硝基呋喃类药物进行处理后进样分析测定,以3倍信噪比(S/N=3)所对应的样品中目标物质的浓度确定为本方法的检出限,以10倍信噪比(S/N=10)所对应的样品中目标物质的浓度确定为本方法的定量限,关于四种硝基呋喃类抗生素的检出限及定量限见表5。
表5.四种硝基呋喃类抗生素的线性回归方程及检出限、定量限
方法的特异性
为考察本方法的特异性,先后进样分析1μg/mL混合标准溶液及添加浓度为20mg/kg的空白加标样品,色谱图见图6和图7。然后称取0.5g空白化妆品样品(水剂类和膏霜类各5份),严格按照本实验建立的分析方法进行测定,色谱图见图8和图9(图中分别为空白水剂类样品和膏霜类样品各取1例的色谱图)。由色谱图可见,在目标物质的出峰时间范围内,空白样品中的基质无干扰峰出现,表明目标物质出峰时间合理,可以有效避免基质干扰现象。
方法的回收率与精密度
称取经测定不含四种硝基呋喃类抗生素的空白化妆品样品0.5g(精确至0.01g),分别添加低、中、高三个浓度的混合标准溶液,涡旋振荡混匀,严格按照本实验确立的方法进行分析测定,每种类型样品的每个添加浓度水平下平行测定6份,以随行的标准曲线进行定量,并且计算相对标准偏差(RSD),实验结果见表6。由表可看出,四种硝基呋喃类抗生素的平均回收率范围在85.0%~99.6%之间,相对标准偏差(RSD)在2.1%~9.5%之间,回收率实验结果满意,可以满足化妆品中4种硝基呋喃类抗生素的测定要求。
表6.化妆品中4种硝基呋喃类抗生素的回收率及精密度(n=6)
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (4)
1.一种化妆品中硝基呋喃类抗生素的测定方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)样品的预处理:将样品置于体积比为70:30的乙腈和甲醇的混合溶液中,混匀后超声提取,离心,取上清液氮吹至近干,采用体积比为85:15的15mmol/L乙酸铵溶液和乙腈的混合溶液溶解残渣,过0.22μm微孔滤膜,滤液备用;
(2)对所述滤液进行高效液相色谱分离,流动相采用梯度洗脱程序进行洗脱,外标法定量,色谱分离条件:色谱柱:WatersXTerraMSC18,5μm,4.6mm×250mm;流动相:乙酸铵和乙腈的混合溶液;柱温:30℃;进样量:10μL;检测器:二极管阵列检测器,检测波长:365nm;
(3)经过步骤(2)得到的检出阳性样品采用高效液相色谱-质谱/质谱法进行确证,所述高效液相色谱-质谱/质谱法确证条件为:
色谱柱:WatersSunfireC18,3.5μm,2.1mm×150mm;流动相:乙腈和0.1%甲酸-水的混合溶液,梯度洗脱;柱温:30℃;流速:0.2mL/min;进样量:5μL;毛细管电压:3.2kV;脱溶剂气温度:400℃;脱溶剂气流速:800L/h;锥孔气体流速:50L/h;离子源温度:150℃;萃取电压:3.00V;射频透镜电压:0.10V;碰撞气体:氩气;数据采集模式:多反应监测;
所述方法同时完成呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮和呋喃西林四种硝基呋喃类抗生素的测定;
步骤(2)中所述乙酸铵溶液的浓度为15mmol/L,由1.1g乙酸铵溶于1000mL水中制备而成,所述梯度洗脱程序见表1,其中,A为乙酸铵溶液,B为乙腈;
表1.高效液相色谱梯度洗脱程序
。
2.根据权利要求1所述的化妆品中硝基呋喃类抗生素的测定方法,其特征在于:步骤(3)中所述梯度洗脱程序见表2,其中,A为乙腈,B为0.1%甲酸水溶液,四种硝基呋喃类抗生素的质谱分析参数见表3;
表2.高效液相色谱-质谱/质谱确证条件中高效液相色谱梯度洗脱程序
表3.四种硝基呋喃类抗生素的质谱分析参数
*定量离子。
3.根据权利要求1所述的化妆品中硝基呋喃类抗生素的测定方法,其特征在于:步骤(1)具体包括如下步骤:称取0.5g化妆品于25mL比色管中,加入体积比为70:30的乙腈和甲醇的混合溶液,定容至10mL刻度,涡旋振荡混匀,于超声波水浴中超声提取30min后,5000rpm高速离心10min,取2mL上清液氮吹至近干,加入1mL体积比为85:15的15mmol/L乙酸铵溶液和乙腈的混合溶液溶解残渣,过0.22μm微孔滤膜,滤液供高效液相色谱分析测定及高效液相色谱-质谱/质谱确证。
4.根据权利要求1所述的化妆品中硝基呋喃类抗生素的测定方法,其特征在于:取样0.5g时,呋喃妥因、呋喃唑酮及呋喃西林的检出限为2mg/kg,定量限为5mg/kg,呋喃它酮的检出限为2.5mg/kg,定量限为7.5mg/kg。
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