CN105651899A - 一种高灵敏检测黄曲霉毒素的方法及其应用 - Google Patents

一种高灵敏检测黄曲霉毒素的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测食品中黄曲霉毒素的新方法，主要将现行黄曲霉毒素的柱前衍生技术与柱后衍生技术结合，柱前衍生反应在紫外光线照射下进行，使衍生反应进行的完全且产生的荧光强，衍生产物荧光稳定性好，同时又提高了检测灵敏度。与现有标准中黄曲霉毒素测定方法相比，该法具有检测灵敏度高，不需要柱后光衍生设备，重现性好、准确等特点。

Description

一种高灵敏检测黄曲霉毒素的方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种高灵敏检测黄曲霉毒素的方法及其应用。属于检测技术领域。
背景技术
黄曲霉毒素(aflatoxin,AFT)是一类由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的一类含有二氢呋喃环结构次级代谢物，是迄今发现的毒性最强的一类真菌毒素，目前已发现的有20多种，在食品中较常见的包括黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1等，它们毒性大小的排列顺序为AFTB1＞AFTM1＞AFTG1＞AFTB2＞AFTG2。黄曲霉毒素对动物及人体的危害主要是肝脏损害，可引发肝炎、肝硬化、肝部坏死、肝癌等疾病，是诱发恶性肿瘤原发性肝细胞癌的主要因素之一。黄曲霉毒素常存在于玉米、谷物、花生及其他坚果中。
黄曲霉毒素检测过程中，由于B1和G1的荧光检测灵敏度低，通常需要衍生增强荧光，以提高检测器对目的物的响应。目前衍生的方法主要有柱前三氟乙酸衍生法和柱后碘衍生法及光化学衍生法。光化学柱后衍生是目前检测黄曲霉毒素的最常用方法，柱后光化学衍生反应原理是利用环状化合物在紫外光照射下能产生荧光这一特性，通过紫外光使流动相中光解出光子，与AFB1和AFG1分子上的活性双键发生反应，产生了荧光特性更强且更稳定的物质，解决了AFB1和AFG1在水溶液中的荧光淬灭现象。
国家标准GB/T18979-2003食品中黄曲霉毒素测定，采用高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生测定黄曲霉毒素的含量，总量检出限为1μg/kg；国家标准GB/T5009.23-2006食品中黄曲霉毒素测定，采用高效液相色谱仪柱前衍生测定黄曲霉毒素的含量，AFB1和AFG1检出限为0.2μg/kg。
目前的HPLC测定黄曲霉毒素或者是用柱前衍生或者是柱后衍生结合荧光测定。但也存在柱前衍生后荧光不稳定及附加柱后衍生设备的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单，灵敏度高，检测时间短的黄曲霉毒素的测定方法。
一种高灵敏检测黄曲霉毒素的方法及其应用，包括以下步骤：
(1)工作曲线的制作：分别配制黄曲霉毒素B10.5～200ng/mL、黄曲霉毒素G10.5～100ng/mL的标准溶液，加入一定量的衍生试剂，在紫外灯下照射一定时间进行衍生反应，在选定色谱条件下进高效液相色谱进行测定，得到黄曲霉毒素回归方程、相关系数、相对标准偏差、回收率。
(2)样品提取：
①对于大米、玉米、小麦、花生、核桃、杏仁及其制品及中药提取方法为：准确称取粉碎均质后的样品2～5g，精确至0.0001g，加入体积分数为70～80％的乙腈水溶液20～50mL，剧烈振荡1min，50±2℃水浴超声提取20～30min，以3500～5000r/min离心5～10min，取出上层溶液，重复提取2～3次，合并上清液，待用；或者
②对于酱油、食醋、植物油脂提取方法为：准确称取5.00～10.00g样品，加入2～5gNaCl和体积分数为70～80％的乙腈水溶液20～50mL，涡旋混合1～3min，定量滤纸过滤，准确吸取5.00mL滤液，加入10mL超纯水稀释，混匀，待用。
(3)样品测定
取步骤(2)中的提取液，按照步骤(1)进行荧光衍生，在与步骤(1)相同色谱条件进行HPLC分析，并对照步骤(1)所得的线性回归方程，计算样品中黄曲霉毒素的含量。
所述的食品样品中待测黄曲霉毒素包括：黄曲霉毒素B1、G1。
所述的衍生试剂包括三氟乙酸、硝酸、硫酸、盐酸中之一种，体积百分比浓度为15～25％。
所述的紫外灯下照射时间为5～20min。
所述的设定的液相色谱条件为：C18色谱柱(4.6mm×250mm，5.0μm)，流动相甲醇-水(45∶55)，流速1.0mL/min，进样量50μL，柱温箱30℃。检测器为荧光检测器，激发波长360nm，发射波长440nm；高效液相色谱仪(配备荧光检测器)。
本发明将现行的柱前衍生技术与柱后衍生技术结合，柱前衍生反应在紫外光线照射下进行，使衍生反应进行的完全且产生的荧光强，衍生产物荧光稳定性好，同时又提高了检测灵敏度的优势。
本发明的优点在于：
1.本发明将黄曲霉毒素测定的柱前衍生技术与柱后衍生技术结合，柱前衍生反应在紫外光线照射下进行，使衍生反应进行的完全且产生的荧光强，衍生产物荧光稳定性好，同时又提高了检测灵敏度。
2.本发明黄曲霉毒素测定的衍生技术操作简单，时间短，效果好。
3.经本衍生后的黄曲霉毒素B1及G1检测限可达0.1μg/kg。
4.结合高效液相色谱-柱前衍生-荧光检测器检测食品中黄曲霉毒素，检测限低，灵敏度高，加标回收率高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1利用本发明检测花生中黄曲霉毒素的含量，步骤为：
1、取适量黄曲霉毒素对照品储备液，用乙腈稀释得浓度分别为0.5、10、50、100、150、200ng/mL的黄曲霉毒素B1及G1对照品溶液，加入20％的三氟乙酸和在紫外灯下照射5min后，过0.45m有机滤膜，C18色谱柱(4.6mm×250mm，5.0μm)，流动相甲醇-水(45∶55；v/v)，流速1.0mL/min，进样量50μL，柱温箱30℃。检测器为荧光检测器，激发波长360nm，发射波长440nm；Agilent1200高效液相色谱仪(四元泵，自动进样器，配备荧光检测器)。以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，相关系数、相对标准偏差、线性范围等见表1，样品中加标回收率见表2。
表1黄曲霉毒素的线性方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围
表2空白样品中黄曲霉毒素的加标回收率
3、样品测定：准确称取粉碎均质后的花生样品2g，精确至0.0001g，加入体积分数为70％的乙腈水溶液20mL，剧烈振荡1min，50±2℃水浴超声提取20min，以3500r/min离心10min，取出上层溶液，重复提取2次，合并上清液；衍生条件及色谱条件与步骤1相同条件下进样检测，得出黄曲霉毒素B1含量为5.41μg/kg，黄曲霉毒素G1含量为1.49μg/kg。
实施例2利用本发明检测玉米中黄曲霉毒素的含量，步骤为：
样品测定：准确称取粉碎均质后的玉米样品3g，精确至0.0001g，加入体积分数为75％的乙腈水溶液30mL，剧烈振荡1min，50±2℃水浴超声提取25min，以4000r/min离心8min，取出上层溶液，重复提取3次，合并上清液；衍生条件及色谱条件与实施例1步骤1相同条件下进样检测，得出黄曲霉毒素B1含量为5.41μg/kg，黄曲霉毒素G1含量为1.49μg/kg。
实施例3利用本发明检测枸杞中黄曲霉毒素的含量，步骤为：
样品测定：准确称取粉碎均质后的枸杞样品5g，精确至0.0001g，加入体积分数为80％的乙腈水溶液50mL，剧烈振荡1min，50±2℃水浴超声提取25min，以5000r/min离心5min，取出上层溶液，重复提取2次，合并上清液；衍生条件及色谱条件与实施例1步骤1相同条件下进样检测，得出黄曲霉毒素B1含量为5.41μg/kg，黄曲霉毒素G1含量为1.49μg/kg。
实施例4利用本发明检测酱油中黄曲霉毒素的含量，步骤为：
样品测定：准确称取酱油样品5g，精确至0.0001g，加入2gNaCl和体积分数为70％的乙腈水溶液50mL，涡旋混合1min，定量滤纸过滤，准确吸取5.00mL滤液，加入10mL超纯水稀释，混匀；衍生条件及色谱条件与实施例1步骤1相同条件下进样检测，得出黄曲霉毒素B1含量为5.41μg/kg，黄曲霉毒素G1含量为1.49μg/kg。
实施例5利用本发明检测花生油中黄曲霉毒素的含量，步骤为：
样品测定：准确称取花生油样品10g，精确至0.0001g，加入5gNaCl和体积分数为80％的乙腈水溶液20mL，涡旋混合1min，定量滤纸过滤，准确吸取5.00mL滤液，加入10mL超纯水稀释，混匀；衍生条件及色谱条件与实施例1步骤1相同条件下进样检测，得出黄曲霉毒素B1含量为5.41μg/kg，黄曲霉毒素G1含量为1.49μg/kg。
以上实施例与GB/T18979-2003食品中黄曲霉毒素测定比较，结果见表3。
表3测定结果比较(μg/kg)
表中“-”代表未检出
由表3结果可知：用本发明微萃取分离净化方法结合高效液相色谱-在线柱后光化学衍生-荧光检测器检测食品中黄曲霉毒素与GB/T18979-2003测定方法相比，结果一致，但因处理步骤少，所用时间短，处理成本低，有机溶剂用量少更具优势。

Claims (5)

1.一种高灵敏检测黄曲霉毒素的方法及其应用，其特征在于该方法包括以下步骤：(1)工作曲线的制作：
配制黄曲霉毒素B1及黄曲霉毒素G1混合标准溶液0.5～200ng/mL，加入一定量的衍生试剂，在紫外灯下照射一定时间进行衍生反应，在选定色谱条件下进高效液相色谱进行测定，得到黄曲霉毒素回归方程、相关系数、相对标准偏差、回收率。
(2)样品提取
①对于大米、玉米、小麦、花生、核桃、杏仁及其制品及中药提取方法为：准确称取粉碎均质后的样品2～5g，精确至0.0001g，加入体积分数为70～80％的乙腈水溶液20～50mL，剧烈振荡1min，50±2℃水浴超声提取20～30min，以3500～5000r/min离心5～10min，取出上层溶液，重复提取2～3次，合并上清液，待用；
②对于酱油、食醋、植物油脂提取方法为：准确称取5.00～10.00g样品，加入2～5gNaCl和体积分数为70～80％的乙腈水溶液20～50mL，涡旋混合1～3min，定量滤纸过滤，准确吸取5.00mL滤液，加入10mL超纯水稀释，混匀，待用。
(3)样品测定
取步骤(2)中的提取液，按照步骤(1)进行荧光衍生，在与步骤(1)相同色谱条件进行HPLC分析，并对照步骤(1)所得的线性回归方程，计算样品中黄曲霉毒素的含量。
2.根据权利要求1所述的一种高灵敏检测黄曲霉毒素的方法及其应用，其特征在于所述食品样品中待测黄曲霉毒素包括：黄曲霉毒素B1、G1。
3.根据权利要求1所述的一种高灵敏检测黄曲霉毒素的方法及其应用，其特征在于步骤(1)所述的衍生试剂包括三氟乙酸、硝酸、硫酸、盐酸中之一种，体积百分比浓度为15～25％。
4.根据权利要求1所述的一种高灵敏检测黄曲霉毒素的方法及其应用，其特征在于所述的紫外灯下照射时间为5～20min。
5.根据权利要求1所述的一种高灵敏检测黄曲霉毒素的方法及其应用,其特征在于所述的设定的液相色谱条件为：C18色谱柱(4.6mm×250mm，5.0μm)，流动相甲醇-水(45∶55)，流速1.0mL/min，进样量50μL，柱温箱30℃。检测器为荧光检测器，激发波长360nm，发射波长440nm；高效液相色谱仪(配备荧光检测器)。
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