CN110726783A - 一种利用QuEChERs技术快速检测坚果中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种利用QuEChERs技术快速检测坚果中黄曲霉毒素的方法，包括以下步骤：(1)样品制备，采样后将样品粉碎；(2)样品提取与净化，采用QuEChERs技术对样品进行前处理，得到提取后的净化样品上清液；(3)高效液相色谱条件确认；(4)检测方法确认；(5)样品测定，对提取后的净化样品上清液进行定量测定。本发明将QuEChERs技术应用在黄曲霉毒素前处理过程中，利用液相色谱法定量分析，该方法快速、简单、准确、能有效检测坚果中黄曲霉毒素。

Description

一种利用QuEChERs技术快速检测坚果中黄曲霉毒素B1、B2、G1、 G2的方法

技术领域

一种利用QuEChERs技术快速检测坚果中黄曲霉毒素的方法，属于分析化学技术领域。

背景技术

黄曲霉毒素AFT是黄曲霉和寄生曲霉等某些菌株产生的双呋喃环类毒素，其衍生物有约 20种，分别命名为B₁、B₂、G₁、G₂等，其中以B₁的毒性最大，致癌性最强，可引起细胞错误地修复DNA，导致严重的DNA诱变，还可抑制DNA和RNA的合成，从而抑制蛋白质的合成，黄曲霉毒素有很强的急性毒性，也有显著的慢性毒性。人摄入大剂量的黄曲霉毒素后可出现肝实质细胞坏死、胆管上皮细胞增生、肝脂肪浸润及肝出血等急性病变；动物食用黄曲霉毒素污染的饲料后，在肝、肾、肌肉、血、奶及蛋中可测出极微量的毒素。黄曲霉毒素及其产生菌在自然界中分布广泛，主要污染粮油及其制品，各种植物性与动物性食品也能被污染。根据国家标准GB 2761-2017中规定，花生及其制品中黄曲霉毒素B₁的限值为5.0 μg/kg，其他坚果中黄曲霉毒素B₁的限值为20μg/kg。

QuEChERs技术即Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe六个单词的首字母，是一种用于高湿度食品中多农药残留分析的样品制备与净化技术，是近年来国际上最新发展起来的一种用于农产品检测的快速样品前处理技术，QuEChERs方法有以下优势：(1)回收率高，对大量极性及挥发性的农药品种的回收率大于85％；(2)精确度和准确度高，可用内标法进行校正；(3)分析速度快，能在30min内完成6个样品的处理；(4)溶剂使用量少，污染小，价格低廉且不使用含氯化物溶剂；(5)操作简便，无需良好训练和较高技能便可很好地完成；(6)样品制备过程中使用很少的玻璃器皿，装置简单。

目前，黄曲霉毒素的检测方法主要有液相色谱法HPLC、液相色谱质谱联用法HPLC-MS/MS、酶联免疫法ELISA、薄层色谱法TLC等等。而酶联免疫法、薄层色谱法的定性定量结果不准确，液相色谱法虽然准确，但前处理复杂，且需要过免疫亲和柱，造价较高。因此，将QuEChERs技术应用在黄曲霉毒素前处理过程中，利用液相色谱法定量分析，提供一种快速、准确的方法。

发明内容

针对现有技术的不足和缺陷，本发明提供了一种利用QuEChERs技术快速检测坚果中黄曲霉毒素的方法，前处理操作简单，可快速、简单、准确的测定坚果中黄曲霉毒素的含量。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种利用QuEChERs技术快速检测坚果中黄曲霉毒素的方法，包括以下步骤：

(1)样品制备，采样后将样品粉碎；(2)样品提取与净化，采用QuEChERs技术对样品进行前处理，得到提取后的净化样品上清液；(3)高效液相色谱条件确认；(4)检测方法确认；(5)样品测定，对提取后的净化样品上清液进行定量测定。

为了更好的实现本发明，进一步的，步骤(1)中样品采样量大于1kg，采样后样品使用高速粉碎机进行粉碎，过筛，全部通过10目筛。

为了更好的实现本发明，进一步的，步骤(2)中采用QuEChERs技术对样品前处理过程步骤如下：

准确称取5.00g样品于含有净化剂包QuEChERs试管中，加入4mL一级水，10mL色谱纯甲醇，和QuEChERs提取剂，最后加入振子，放入QuEChERs处理仪器，样品处理条件为立体震荡10min，4000r/min高速离心10min，再立体震荡10min，4000r/min高速离心10 min后，离心后取3mL上清液，过0.45nm尼龙微孔滤膜，得到净化后的样品上清液，备用。

为了更好的实现本发明，进一步的，步骤(3)高效液相色谱条件确认的步骤如下：

流动相：甲醇：水溶液＝40:60，v/v；

等梯度洗脱条件：A，65％；B，35％；

色谱柱：C18柱，柱长150mm，内径4.6mm，填料粒径5μm；

流速：1.0mL/min；

柱温：40℃；

进样量：10μl；

光化学柱后衍生器；

激发波长：360nm；

发射波长：440nm。

为了更好的实现本发明，进一步的，步骤(4)检测方法确认的步骤如下：

将黄曲霉毒素系列标准混合溶液2、5、10、20、50、100ng/mL依次测定，以标准物的峰面积为纵坐标，以质量浓度为横坐标，绘制标准曲线拟合线性方程，结果表明，各组分在线性范围内线性关系良好，线性相关系数均大于0.99；以空白样品加标实验测定的化合物信噪比3:1时为浓度最低检出限、信噪比为10:1时为浓度最低定量限；得到检测方法的确认。

为了更好的实现本发明，进一步的，所述QuEChERs试管中含有净化剂包配方为0.6g 硫酸镁，0.1g PSA；所述QuEChERs提取剂配方为0.4g硫酸镁，0.1g氯化钠，0.1g柠檬酸钠， 0.05g柠檬酸二钠。

有益效果

本发明的有益效果：

(1)与现有技术相比，本发明利用QuEChERs前处理检测技术，可快速处理样品，并得到提取后的净化上清，可直接进行高效液相色谱法进行检测，不需要常规的免疫亲和柱净化，减少了提取净化步骤，提高了检测效率，节约了检测费用；

(2)本发明采用QuEChERs前处理检测技术，回收率高，对大量极性及挥发性的农药品种的回收率大于85％；(2)精确度和准确度高，可用内标法进行校正；(3)分析速度快，能在30min内完成6个样品的处理；(4)溶剂使用量少，污染小，价格低廉且不使用含氯化物溶剂；(5)操作简便，无需良好训练和较高技能便可很好地完成；(6)样品制备过程中使用很少的玻璃器皿，装置简单。

(3)本发明将QuEChERs前处理检测技术创造性的应用于黄曲霉毒素的检测方法中，结合高效液相色谱法进行检测，可简单、快速、准确的检测坚果中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂，为今后的监管提供了方便。

附图说明

图1黄曲霉毒素混合标准溶液高效液相色谱图

图2黄曲霉毒素混合标准溶液标准曲线

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例

标准溶液配制

(1)黄曲霉毒素混合标准储备溶液AFB₁、AFG₁ 2.0μg/mL，AFB₂、AFG₂ 2.5μg/mL，购于Romer公司，在-20℃下避光保存，备用；

(2)黄曲霉毒素混合标准工作液AFB₁、AFG₁ 100.0ng/mL，AFB₂、AFG₂ 25.0ng/mL：准确移取混合标准储备溶液0.50mL至100mL容量瓶中，乙腈定容；此溶液密封后避光-20℃下保存，三个月有效；

(3)标准系列工作溶液：准确移取混合标准工作液AFB₁、AFG₁ 100.0ng/mL，AFB₂、AFG₂ 25.0ng/mL 200μL、500μL、1000μL、2000μL、5000μL至10mL容量瓶中，用初始流动相定容至刻度，配制浓度点为AFB₁、AFG₁ 2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0ng/mL和 AFB₂、AFG₂0.50、1.25、2.5、5.0、12.5、25.0ng/mL的系列标准溶液。

将黄曲霉毒素系列标准混合溶液依次测定，其混合溶液为黄曲霉毒素B₁：2、5、10、20、 50、100ng/mL；黄曲霉毒素B₂：0.5、1.25、2.5、5、10、25ng/mL；黄曲霉毒素G₁：2、5、 10、20、50、100ng/mL；黄曲霉毒素G₂：0.5、1.25、2.5、5、10、25ng/mL

以标准物的峰面积为纵坐标，以质量浓度为横坐标，绘制标准曲线拟合线性方程。结果表明，各组分在线性范围内线性关系良好，线性相关系数均大于0.999；以空白样品加标实验测定的化合物信噪比3:1时为浓度最低检出限、信噪比为10:1时为浓度最低定量限。

线性范围、线性相关系数、检出限、定量限见表1。

表1线性范围、相关系数、检出限、定量限

样品制备

用高速粉碎机将其粉碎，过筛，使其粒径通过小于2mm孔径试验筛，混合均匀后缩分至 100g，储存于样品瓶中，密封保存，供检测用。

分别取5.0g花生、瓜子、松子、核桃、杏仁样品于含有净化剂包0.6g硫酸镁，0.1gPSA 的QuEChERs试管中，加入4mL一级水，加入10mL甲醇(色谱纯)，加入振子，加入QuEChERs提取剂0.4g硫酸镁+0.1g氯化钠+0.1g柠檬酸钠+0.05g柠檬酸二钠；放入QuEChERs处理仪器，运行样品处理条件为立体震荡10min，4000r/min高速离心10min，再立体震荡10min，4000 r/min高速离心10min后，取3mL上清液，过0.45nm尼龙微孔滤膜，进行高效液相色谱检测，检测条件为流动相：甲醇：水溶液＝40:60，v/v；等梯度洗脱条件：A，65％；B，35％；色谱柱：C18柱，柱长150mm，内径4.6mm，填料粒径5μm；流速：1.0mL/min；柱温： 40℃；进样量：10μL；光化学柱后衍生器；激发波长：360nm；发射波长：440nm。

为了保证测定结果的准确性，选择低、中、高3个不同加标水平的回收率实验，在花生样品中加标，3个加标量分别为5、10、20μg/kg。每个加标量平行测定3次，计算加标回收率及相对标准偏差，结果见表2。

表2加标回收率及标准偏差

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种利用QuEChERs技术快速检测坚果中黄曲霉毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤，(1)样品制备，采样后将样品粉碎；(2)样品提取与净化，采用QuEChERs技术对样品进行前处理，得到提取后的净化样品上清液；(3)高效液相色谱条件确认；(4)检测方法确认；(5)样品测定，对提取后的净化样品上清液进行定量测定。

2.根据权利要求1所述的一种利用QuEChERs技术快速检测坚果中黄曲霉毒素的方法，其特征在于，步骤(1)中样品采样量大于1kg，采样后样品使用高速粉碎机进行粉碎，过筛，全部通过10目筛。

3.根据权利要求1所述的一种利用QuEChERs技术快速检测坚果中黄曲霉毒素的方法，其特征在于，步骤(2)中采用QuEChERs技术对样品前处理过程步骤如下：

准确称取5.00g样品于含有净化剂包QuEChERs试管中，加入4mL一级水，10mL色谱纯甲醇，和QuEChERs提取剂，最后加入振子，放入QuEChERs处理仪器，样品处理条件为立体震荡10min，4000r/min高速离心10min，再立体震荡10min，4000r/min高速离心10min后，离心后取3ml上清液，过0.45nm尼龙微孔滤膜，得到净化后的样品上清液，备用。

4.根据权利要求1所述的一种利用QuEChERs技术快速检测坚果中黄曲霉毒素的方法，其特征在于，步骤(3)高效液相色谱条件确认的步骤如下：

流动相：甲醇：水溶液＝40:60，v/v；

等梯度洗脱条件：A，65％；B，35％；

色谱柱：C18柱，柱长150mm，内径4.6mm，填料粒径5μm；

流速：1.0mL/min；

柱温：40℃；

进样量：10μl；

光化学柱后衍生器；

激发波长：360nm；

发射波长：440nm。

5.根据权利要求1所述的一种利用QuEChERs技术快速检测坚果中黄曲霉毒素的方法，其特征在于，步骤(4)检测方法确认的步骤如下：

将黄曲霉毒素系列标准混合溶液2、5、10、20、50、100ng/ml依次测定，以标准物的峰面积为纵坐标，以质量浓度为横坐标，绘制标准曲线拟合线性方程，结果表明，各组分在线性范围内线性关系良好，线性相关系数均大于0.99；以空白样品加标实验测定的化合物信噪比3:1时为浓度最低检出限、信噪比为10:1时为浓度最低定量限；得到检测方法的确认。

6.根据权利要求3所述的一种利用QuEChERs技术快速检测坚果中黄曲霉毒素的方法，其特征在于，所述QuEChERs试管中含有净化剂包配方为0.6g硫酸镁，0.1g PSA；所述QuEChERs提取剂配方为0.4g硫酸镁，0.1g氯化钠，0.1g柠檬酸钠，0.05g柠檬酸二钠。

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