CN116124930B - 一种测定高脂肪样品基质中的黄曲霉毒素预警指示物Averantin的方法 - Google Patents

一种测定高脂肪样品基质中的黄曲霉毒素预警指示物Averantin的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于有害污染物风险预警检测技术领域，具体涉及一种测定高脂肪样品基质中的黄曲霉毒素预警指示物Averantin的方法。包括：取粉碎后的待检测样品，加入提取剂甲基叔丁基醚，振荡后离心，取上清液加入作为萃取剂的离子液体，形成均匀溶液；在水和氮吹辅助下，使离子液体萃取相分离；抽取沉积在下端的离子液体萃取相进入高效液相色谱仪‑紫外检测器分析。本发明采用简单的新型均相液液微萃取技术及常规的高效液相色谱仪‑紫外检测器就能实现高脂肪样品基质中黄曲霉毒素预警指示物的准确、高灵敏测定，有助于黄曲霉毒素的早期预警，保障全民食品质量安全。

Description

一种测定高脂肪样品基质中的黄曲霉毒素预警指示物 Averantin的方法
技术领域
本发明属于有害污染物风险预警检测技术领域，具体涉及一种测定高脂肪样品基质中的黄曲霉毒素预警指示物Averantin的方法。
背景技术
黄曲霉毒素(AFs)作为黄曲霉和寄生曲霉的次生代谢产物，具有致癌性和神经毒性。不仅对人类健康产生巨大的威胁，还在世界范围内造成重大的经济损失。目前，粮食中AFs污染问题已成为世界各国高度关注的食品安全热点问题。AFs生物合成途径共涉及多个酶促反应和至少15个稳定的前体。对AFs生成的时间过程变化研究发现，部分前体与AFs一起产生，先于AFs达到峰值，前体含量和积累速度与随后检测到的AFs水平呈正相关，与间隔时间呈负相关。根据前体与AFs产生之间的时间过程关系，可将前体作为预警指示物，在一定时间范围内预测AFs的发生，从而能提前采取有效措施防止AFs污染产生和降低经济损失。Averantin(AVN)是AFs合成路径中紧随Norsolorinic acid(NOR)之后的第二个稳定前体，处于AFs生物合成中的上游，它的含量峰值出现时间早于Versicolorin B(Ver B)等已报道的前体(Xie H,Wang X,Zhang L,et al.Monitoring metabolite production ofaflatoxin biosynthesis by Orbitrap Fusion mass spectrometry and D-optimalmixture design method[J].Analytical Chemistry,2018,90(24):14331-14338)，有望更早预警AFs的发生。对AVN的准确、灵敏测定是建立AVN与AFs间的时间过程关系的关键，也是保证前体预警技术有效性的前提。
Wang等采用液相色谱高分辨质谱联用仪对AVN进行测定(Wang X,Zhao Y,Qi X,etal.Quantitative analysis of metabolites in the aflatoxin biosynthesis pathwayfor early warning of aflatoxin contamination by UHPLC-HRMS combined with QAMS[J].Journal of Hazardous Materials,2022,431,128531)，不过该方法所用仪器设备昂贵且需要经验丰富的操作员，另外，该方法测定的是脂肪含量低的黄曲霉菌菌丝样品基质中的AVN。而AFs污染广泛存在于花生、玉米、棉花、芝麻和坚果等易感作物中。按照脂肪含量超过20％即为高脂肪样品的分类原则，大部分易被AFs污染的样品均为高脂肪基质(如：花生44％～54％，芝麻46％～57％，葵花籽40％～68％)。对于高脂肪基质样品，在用有机溶剂提取目标物时，脂肪等样品基体被共同提取，且很多亲脂性污染物也会在脂肪中富集，影响方法的回收率、重复性和灵敏度。凝胶渗透色谱(GPC)或固相萃取(SPE)被报道用于高脂肪含量样品目标物的萃取，但往往需消耗大量有机试剂、耗费时间长且通常需要额外的净化步骤，使检测的重复性偏低和检测时间偏长，也对操作人员的身体健康和环境造成危害。液液萃取和冷冻技术操作虽相对简单，但也同样存在上述问题。QuEChERS法是一种常被用于高脂肪含量样品的样品前处理技术，Garcia-Vara结合QuEChERS和LC-MS/MS，测定了代表性高脂肪基质如橄榄和葵花籽中42种农残(Garcia-Vara,M,Postigo,C,Palma,P,etal.QuEChERS-based analytical methods developed for LC-MS/MS multiresiduedetermination of pesticides in representative crop fatty matrices:Olives andsunflower seeds[J].Food Chemistry,2022,386,132558)，但该方法的整个过程仍存在多次转移步骤，且所用试剂种类多，影响方法的准确度和简便性。
综上，由于AFs易感作物如花生、玉米、芝麻和坚果样品脂肪含量高，而AFs预警指示物AVN含量往往极低，故需发展准确、灵敏的适用于高脂肪含量样品基质中黄曲毒素预警指示物AVN的测定方法，为建立AVN与AFs之间的准确时间过程关系提供方法基础。
发明内容
针对高脂肪基质中亲脂性污染物等共提取物的存在，影响黄曲毒素预警指示物AVN检测方法的加标回收率、灵敏度和重复性，以及样品前处理过程中消除或降低共提取物时操作繁琐复杂、耗时的问题，本发明采用简单、快速的能高效萃取AVN的新型均相液液微萃取技术，与常规高效液相色谱仪-紫外检测器联用，建立了一种简单、准确、高灵敏测定高脂肪基质样品中黄曲毒素预警指示物AVN的新方法，该方法具体是先通过离子液体与样品溶液形成均相溶液，离子液体能与目标物之间产生强的相互作用从而与共提取物有力竞争目标物，接着，在水和氮吹的辅助下，使离子液体萃取相分离。
本发明具体采用以下技术方案：
一种测定高脂肪样品基质中的黄曲霉毒素预警指示物Averantin的方法，包括以下步骤：
将待检测样品粉碎，称取样品，加入提取剂甲基叔丁基醚，涡旋10～120s后，离心5～10min，透明的上清液为制备出的非水样品溶液。取非水样品溶液至锥形底离心管中，加入作为萃取剂的离子液体，形成均相溶液；在水和氮吹辅助下，使离子液体萃取相分离；抽取一定体积的沉积在下端的离子液体萃取相进入高效液相色谱仪-紫外检测器分析。其中，待检测样品、提取剂、萃取剂、水的用量比为：0.1～0.5g:1～5mL:20～45μL:1～5mL。
离子液体能充分溶解于样品提取液中形成均相溶液，离子液体与AVN的接触面积无限大，实现两者的高效传质，且在萃取过程中AVN在离子液体相和对应共提取物相进行分配，离子液体能通过强的π-π和氢键作用将AVN从高脂肪基质提取液中高效萃取出来。接着，在水和氮吹的辅助下，使离子液体相和共提取物相分离，消除亲脂性污染物等共萃取物的干扰。整个萃取过程采用仅微升级的离子液体，实现微萃取。
其中，高效液相色谱条件为：色谱柱为C18(4.6×250mm，5μm)，进样量10μL，柱温30℃，流速1mL/min；流动相为甲醇/乙腈/水(35:35:30，v/v/v)；紫外检测波长330nm。
上述步骤中，氮吹的温度为40～60℃，氮吹至至离子液体萃取相从提取液中分离并沉积到下部。
上述步骤中，所述的水与萃取剂不互溶。所述的萃取剂离子液体需与样品溶液互溶，形成均相溶液，具体的，所用的离子液体为1-己基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺([HMIM][Tf2N])。
本发明的有益效果为：
1.本发明构建了一种简单、快速的能高效萃取高脂肪含量谷物样品中痕量污染物的新型均相液液微萃取技术，进而提出了一种能简单、准确、高灵敏测定高脂肪基质谷物样品中黄曲霉毒素预警指示物AVN的新方法。
2.本发明采用实验室常规高效液相色谱仪-紫外检测器就能实现黄曲霉毒素预警指示物的准确、高灵敏测定，有助于AFs早期预警，保障全民食品质量安全。
3.本发明建立的均相液液微萃取-高效液相色谱-紫外检测方法为进一步研究AFs的预警技术提供了一种新的分析策略。
附图说明
图1为萃取剂种类对萃取效率的影响。
图2为[HMIM][Tf2N]与AVN的电势图；图中(a)AVN，(b)[HMIM]+，(c)[Tf2N]-。
图3为[HMIM][Tf2N]的体积对萃取效率的影响。
图4为水的体积对萃取效率的影响。
图5为空白花生样品加标前后的色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。
实施例中所述的空白花生样品是指该花生样品中未检测出AVN，检测步骤如下：
将花生样品粉碎后，称取0.2g花生样品，加入2mL甲基叔丁基醚，涡旋提取30s，以4000rpm离心5min。取1mL上清液，加入35μL[HMIM][Tf2N]和4mL水。60℃下氮吹约5min至离子液体萃取相从提取液中分离并沉积到下部，抽取沉积到下端的离子液体10μL，进高效液相色谱仪-紫外检测器分析。
实施例1：不同种类萃取剂试验研究
本实施例主要研究不同种类离子液体对萃取效率的影响。所选用的离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺([BMIM][Tf2N])、1-己基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺([HMIM][Tf2N])、1-辛基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺([OMIM][Tf2N])、1-癸基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺([DeMIM][Tf2N])、1,3-二己基咪唑双三氟甲磺酰亚胺([HHIM][Tf2N])和1-乙烯基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺([VHIM][Tf2N])，分别将其作为萃取剂对花生样品中的黄曲霉毒素预警指示物AVN进行萃取。具体操作步骤如下：
(1)将空白花生样品粉碎，称取样品0.2g，加入提取剂甲基叔丁基醚2mL，涡旋30s后，以4000rpm离心5min，透明的上清液为空白花生样品提取液。
(2)分别取1mL空白花生样品提取液至锥形底离心管中，添加50ng/mL的AVN，分别加入40μL以上6种不同的离子液体和4mL水。60℃下氮吹约5min至离子液体萃取相从提取液中分离并沉积到下部，抽取离子液体10μL，进高效液相色谱仪-紫外检测器分析。
将得到的萃取回收率进行对比，结果如图1所示。
从图1中可以看到，在考察的离子液体中，[HMIM][Tf2N]为萃取剂时萃取回收率最好。这一方面是由于[HMIM][Tf2N]能充分溶解于样品提取液中形成均相溶液；另一方面，通过密度泛函理论计算，[HMIM][Tf2N]能通过强的π-π和氢键作用(图2)将AVN从高脂肪基质提取液中高效萃取出来。
实施例2：不同体积萃取剂的试验研究
本实施例主要研究不同体积的萃取剂对萃取效率的影响。萃取剂采用[HMIM][Tf2N]，[HMIM][Tf2N]体积分别为20μL、25μL、30μL、35μL、40μL、45μL。本实施例具体操作步骤如下：
(1)将空白花生样品粉碎，称取样品0.2g，加入提取剂甲基叔丁基醚2mL，涡旋30s后，以4000rpm离心5min，透明的上清液为空白花生样品提取液。
(2)分别取1mL空白花生样品提取液至锥形底离心管中，添加50ng/mL的AVN，分别加入以上6种不同体积的[HMIM][Tf2N]和4mL水。60℃下氮吹约5min至离子液体萃取相从提取液中分离并沉积到下部，抽取离子液体10μL，进高效液相色谱仪-紫外检测器分析。
将得到的萃取回收率进行对比，结果如图3所示。
从图3中可以看到，随着[HMIM][Tf2N]体积从20μL增加到45μL，AVN的萃取回收率明显增加；进一步增加[HMIM][Tf2N]的体积并没有改善萃取回收率，反而稀释了[HMIM][Tf2N]中的AVN含量，使AVN的萃取回收率略微下降。当[HMIM][Tf2N]萃取剂体积为35、40、45μL时，AVN的萃取回收率较高；当[HMIM][Tf2N]体积为35μL时，AVN的萃取回收率最高。
实施例3：不同体积水的试验研究
本实施例主要研究不同体积的水对萃取效率的影响。萃取剂均采用35μL的[HMIM][Tf2N]，水体积分别为1mL、2mL、3mL、4mL、5mL。本实施例具体操作步骤如下：
(1)将空白花生样品粉碎，称取样品0.2g，加入提取剂甲基叔丁基醚2mL，涡旋30s后，以4000rpm离心5min，透明的上清液为空白花生样品提取液。
(2)分别取1mL空白花生样品提取液至锥形底离心管中，添加50ng/mL的AVN，分别加入35μL的[HMIM][Tf2N]和以上5种不同体积的水。60℃下氮吹约5min至离子液体萃取相从提取液中分离并沉积到下部，抽取离子液体10μL，进高效液相色谱仪-紫外检测器分析。
将测定得到的萃取回收率进行对比，结果如图4所示。
从图4中可以看到，当水体积为4、5mL时，AVN的萃取回收率较高。经分析，原因可能为：水会影响[HMIM][Tf2N]相与共提取物相的分离效果，当水的体积从1mL逐步增加到4mL时，分离界面更明显，说明[HMIM][Tf2N]相与共提取物相的分离效果越好，萃取效率也增加；当水体积继续增加至5mL时，[HMIM][Tf2N]相与共提取物相的分离效果无明显变化，萃取效率也无明显变化。
实施例4：方法性能评价
本实施例主要是研究建立的均相液液微萃取-高效液相色谱-紫外检测法的方法性能。
1、标准曲线的建立以及检测限和定量限的计算
(1)将空白花生样品粉碎，分别称取样品0.2g，添加不同浓度(2、5、10、20、50、100、300、500、1000ng/g)的AVN到空白花生样品中；分别加入2mL甲基叔丁基醚，涡旋提取30s，以4000rpm离心5min。
(2)分别取1mL上清液至锥形底离心管中，加入35μL[HMIM][Tf2N]和4mL水。60℃下氮吹约5min至离子液体萃取相从提取液中分离并沉积到下部，抽取离子液体10μL，进高效液相色谱仪-紫外检测器分析。
通过绘制峰面积Y与AVN浓度X的关系建立标准曲线，并测定AVN的校准曲线方程和相关系数(r2)。分别以3倍信噪比和10倍信噪比计算本发明方法的检测限和定量限。结果如表1所示。
2、日内和日间精密度的计算
(1)将空白花生样品粉碎，分别添加四个浓度水平(5、20、50和250ng/g)的AVN溶液到0.2g的空白花生样品中，分别加入2mL甲基叔丁基醚，涡旋提取30s，以4000rpm离心5min。
(2)分别取1mL上清液至锥形底离心管中，加入35μL[HMIM][Tf2N]和4mL水。60℃下氮吹约5min至离子液体萃取相从提取液中分离并沉积到下部，抽取离子液体10μL，进高效液相色谱仪-紫外检测器分析。
将加标样品在同一天测定5次，连续测定5天，获得日内和日间精密度。结果如表1所示。
表1AVN的线性方程、相关系数、检出限、定量限和精密度
该方法在2～1000ng/g范围内有良好的线性(r2＝0.9997)。AVN的LOD和LOQ分别为0.5ng/g和1.5ng/g，灵敏度高。日内和日间精密度分别为1.5％～4.7％和1.6％～4.7％，均小于5％，表明本发明分析方法的重复性好。
实施例5：花生中AVN的检测(一)
花生购自河南省农业科学院(中国郑州)。
将花生粉碎，称取花生0.2g，加标AVN的量分别为0、5、20、50、250ng/g，分别加入2mL甲基叔丁基醚，涡旋提取30s，以4000rpm离心5min。分取1mL上清液，加入35μL[HMIM][Tf2N]和4mL水。60℃下氮吹约5min至离子液体萃取相从提取液中分离并沉积到下部，抽取离子液体10μL，进高效液相色谱仪-紫外检测器分析。
每个加标含量的样品做3次平行测量，取平均值，根据实际加入量和实测结果，计算该样品的加标回收率，结果见表2。空白花生样品和加标样品的色谱图如图5所示。
结果显示，在AVN的加标量为0ng/g下，花生样品中未检测出AVN。另外，样品的加标回收率在86.0％～107.8％，RSD为1.3％～6.2％(n＝3)。实验结果表明建立的分析方法具有令人满意的准确度和重复性，能用于测定高脂肪含量(44％～54％)的花生样品中的AVN。
表2花生基质加标回收率和精密度
表2中，花生1：大白沙；花生2：豫花23；花生3：远杂6；ND：未检出；SD：标准差；RSD：相对标准偏差。
实施例6：花生中AVN的检测(二)
本实施例所用的花生与实施例5相同。
将花生粉碎，称取花生0.2g，AVN的加标量为250ng/g，加入2mL甲基叔丁基醚，涡旋提取30s，以4000rpm离心5min。将上清液全部转移至锥形底离心管中，加入35μL[HMIM][Tf2N]和4mL水。60℃下氮吹约5min至离子液体萃取相从提取液中分离并沉积到下部，抽取离子液体10μL，进高效液相色谱仪-紫外检测器分析。加标含量的样品做3次平行测量取平均值。
检测结果：按照实施例5的方法计算得到本实施的加标回收率为75.8％～78.2％。而在实施例5的前处理过程中分取1mL上清液进行萃取，在加标量为250ng/g时，回收率为97.8％～99.8％，准确度明显高于实施例6。
实施例7：白芝麻中AVN的检测
白芝麻购自郑州高新区农贸市场。
将白芝麻粉碎后，称取0.2g白芝麻，并在该白芝麻样品中进行AVN加标试验(加标量分别为0、5、20、50、250ng/g)，分别加入2mL甲基叔丁基醚，涡旋提取30s，以4000rpm离心5min。取1mL上清液，加入35μL[HMIM][Tf2N]和5mL水。60℃下氮吹约5min至离子液体萃取相从提取液中分离并沉积到下部，抽取离子液体10μL，进高效液相色谱仪-紫外检测器分析。
检测结果：在AVN加标量为0ng/g时，白芝麻样品中检测出20.9ng/g AVN。另外，加标回收率为86.7％～104.9％，RSD为1.5％～4.2％，表明所建立分析方法具有令人满意的准确度和重复性，能够用于测定高脂肪含量(46％～57％)的白芝麻中的AVN。
实施例8：油菜籽中AVN的检测
油菜籽购自郑州高新区农贸市场。
将油菜籽粉碎后，称取0.2g油菜籽，并在该油菜籽样品中进行AVN加标试验(加标量分别为0、5、20、50、250ng/g)，分别加入2mL甲基叔丁基醚，涡旋提取30s，以4000rpm离心5min。取1mL上清液，加入35μL[VHIM][Tf2N]和4mL水。60℃下氮吹约5min至离子液体萃取相从提取液中分离并沉积到下部，抽取离子液体10μL，进高效液相色谱仪-紫外检测器分析。
检测结果：在AVN加标量为0ng/g时，油菜籽样品中未检出AVN。另外，加标回收率为92.2％～105.0％，RSD为2.1％～5.3％。
上述结果表明所建立分析方法具有令人满意的准确性和重复性，能够用于测定高脂肪含量(28％～48％)的油菜籽中AVN。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims (6)

1.一种测定高脂肪样品基质中的黄曲霉毒素预警指示物Averantin的方法，其特征在于，包括以下步骤：
取粉碎后的待检测样品，加入提取剂甲基叔丁基醚，振荡后离心，取上清液加入作为萃取剂的离子液体，形成均匀溶液；在水和氮吹辅助下，使离子液体萃取相分离；抽取沉积在下端的离子液体萃取相进入高效液相色谱仪-紫外检测器分析；
所述的水与萃取剂不互溶；
待检测样品、提取剂、上清液、萃取剂、水的用量比为：0.2 g: 2 mL: 1mL: 35 µL: 4～5 mL；
所述样品为脂肪含量超过20%的高脂肪含量谷物样品，
所述离子液体为1-己基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺。
2.根据权利要求1所述的一种方法，其特征在于，所述振荡采用涡旋方式进行，涡旋时间为10～120 s。
3.根据权利要求1所述的一种方法，其特征在于，振荡后离心时间为5～10 min。
4.根据权利要求1所述的一种方法，其特征在于，氮吹的温度为40～60 ℃。
5.根据权利要求1所述的一种方法，其特征在于，氮吹至离子液体萃取相从提取液中分离并沉积到下部。
6.根据权利要求1所述的一种方法，其特征在于，所述高效液相色谱条件为：色谱柱为C18，进样量10 µL，柱温30 ℃，流速1 mL/min；流动相为甲醇/乙腈/水，甲醇、乙腈和水的体积比为35:35:30；紫外检测波长330 nm。
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