CN112229929A - 一种在线gpc-gc-ms/ms非靶向快速筛查茶叶中农药残留的方法 - Google Patents

一种在线gpc-gc-ms/ms非靶向快速筛查茶叶中农药残留的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及农药检测领域，公开了一种在线GPC‑GC‑MS/MS非靶向快速筛查茶叶中农药残留的方法，包括以下步骤：1）样品前处理；2）非靶向农药残留快速筛查方法（Smart MRM方法）的创建；3）非靶向农药残留快速筛查方法的验证：向空白茶叶基质中加入40种农药混合标准溶液，采用改进的QuEChERS方法提取和净化茶叶样品，利用已创造Smart MRM方法对其进行筛查，其结果为40种加标农药均筛查呈阳性；4）对茶叶中筛查呈阳性农药再进行靶向定量分析。本发明具有快速、简便、无需标准物质定性等优势，能同时高通量地筛查大量农药，从而避免了茶叶农药残留分析漏检、盲检现象的发生，为茶叶中农药残留的快速筛查和质量控制提供重要方法依据。

Description

一种在线GPC-GC-MS/MS非靶向快速筛查茶叶中农药残留的 方法
技术领域
本发明涉及农药检测领域，公开了一种在线GPC-GC-MS/MS非靶向快速筛查茶叶中农药残留的方法。
背景技术
茶作为一种天然的绿色保健饮料，居世界三大饮料(茶、咖啡、可可)之一，深受人们喜爱，为提高茶叶产量茶农在茶叶生长过程中利用农药防治各类危害茶叶生产的病、虫、草害，从而确保了茶叶的稳产、高产，满足了人类对茶叶的需求，因而其质量安全特别是农药残留问题引起了广泛的关注。人类直接或间接食用含有农药的食品能够导致农药在人体内蓄积，从而引发多种疾病的发生。为保障消费者能够喝到安全优质的茶饮料，建立一种快速、高效、精准的多农药残留分析检测方法，为茶叶质量安全提供技术保障。
目前农药残留分析方法主要有拉曼光谱法、免疫分析法、气相色谱法、液相色谱-质谱法(LC-MS/MS)和气相色谱-质谱法(GC-MS/MS)，其中LC-MS/MS和GC-MS/MS技术应用最广。国内外对茶叶中农药残留分析研究通常是在有标准品情况下进行靶向分析，非靶向筛查的方法鲜见报道，由于标准品价格昂贵，农药种类繁多，因此采用靶向定量分析研究成本较高，所需工作量也十分巨大，实验室通常并不具备长期储存几百种甚至近千种农药标准品的能力，从而无法满足所有农药残留的靶向分析，由此容易造成茶叶安全检测漏洞。基于现有技术缺陷，在不购买标准品情况下对茶叶中农药残留进行高通量、高精准地快速筛查分析，根据筛查到阳性农药再进行标准物质准确定量分析逐渐成为新的研究趋势。因此，食品安全和国际贸易都呼唤高通量快速农药残留检测技术，这对于广大农药残留分析工作者来说无疑是一次机遇与挑战。在现有农药残留分析检测技术中，色谱质谱联用技术是实现农药高通量、高精准地快速筛查检测分析的最佳手段。
茶叶基质复杂，所含的有机酸、色素、咖啡碱、多酚类等成分会给农药残留检测带来严重的基质效应，不仅会干扰目标物(农药化合物)的分析，而且会对色谱柱和质谱造成致命的损害，故如何有效提取目标物并净化去除茶叶中的干扰杂质成为亟需解决的一个难题。
发明内容
为解决上述问题，本发明建立了一种在线GPC-GC-MS/MS非靶向快速筛查茶叶中农药残留的方法，它是采用在线凝胶色谱净化结合三重四极杆气质联用仪对茶叶中农药残留进行非靶向快速筛查，大大降低了茶叶中干扰物质对农药残留检测分析的影响，能够有效去除茶叶中干扰物质，降低茶叶农药残留分析检测时严重的基质效应。
本发明的技术方案：
一种在线GPC-GC-MS/MS非靶向快速筛查茶叶中农药残留的方法，包括如下步骤：
1)正构烷烃混合标准溶液的制备：取C9～C33正构烷烃混合标准溶液，用正己烷定容稀释，即得；
2)内标溶液的制备：取环氧七氯标准溶液，用正己烷定容稀释，即得；
3)茶叶样品提取溶液的制备：称取茶叶样品粉末，加入饱和食盐水旋涡混匀，静止30min，加入10mL乙腈溶液，旋涡振动提取20min，再加入无水硫酸镁与无水乙酸钠，继续旋涡振动提取10min，以8000r/min离心10min，取上清液加入1g无水CaCl2，旋涡振动5min，再次以8000r/min离心10min，将上清液转入装有无水硫酸镁、乙二胺-N-丙基硅烷(primarysecondary amine，PSA)、石墨化碳黑(graphitized carbon black，GCB)、十八烷基硅烷键合硅胶(C18)的10mL离心管，涡旋振动5min，以8000r/min离心10min，取5mL上清液在40℃氮吹至近干，加入其质量浓度为10μg/mL环氧七氯内标液0.1mL，乙酸乙酯定容至1mL，过0.22μm滤膜，供GPC-GC-MS/MS测定；
4)分别吸取正构烷烃混合标准溶液和茶叶样品提取溶液注入色谱仪，其GPC-GC-MS/MS条件分别是：
GPC条件：色谱柱：Shodex CLNpak EV-200(2.1mm×150mm)；流动相：丙酮-环己烷混合溶液(3:7，V/V)；流速：0.1mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；
色谱条件：惰性石英管(保护柱)：5m×0.53mm；富集柱(预柱)：VF-1701MS(5m×0.25mm×0.25μm)；分析柱：VF-1701MS(25m×0.25mm×0.25μm)；柱温程序：初始温度40℃，保持7min，以20℃/min升温至125℃，再以10℃/min升温至300℃，保持10min；进样方式：分流进样；分流比：20；PTV进样口温度程序：初始温度65℃，保持1min，以150℃/min升温至250℃，保持10min；柱流量：1.75mL/min；
质谱条件：正构烷烃混合标准溶液扫描方式：全扫描(SCAN)；离子化方式：EI；电离电压：70eV；接口温度：300℃；离子源温度：230℃；扫描质量数范围(m/z)：50～500；溶剂延迟时间：5min；扫描时间：5.50～38.00；茶叶样品提取溶液采集方式：多反应监测(multiplereaction monitoring，MRM)；离子化方式：EI；电离电压：70eV；接口温度：300℃；离子源温度：230℃；溶剂延迟时间：5min；扫描时间：5.50～38.00；检测器电压：调谐电压+0.5kV。
所述步骤4)正构烷烃SCAN数据C9～C33各组分烷烃的保留时间，将C9～C33正构烷烃SCAN数据导入Smart Pesticides Database数据库中，数据库中各组分农药的预保留时间按照保留指数进行计算，创建非靶向农药残留快速筛查方法(Smart MRM方法)；该SmartMRM方法可利用Smart Pesticides Database数据库中各组分农药的预保留时间及相应农药目标物的MRM特征离子进行匹配，实现多组分农药的快速定性筛查，如果在保留时间范围内有特征离子峰，且被识别，则可以判断茶叶样品中有该农药筛查呈阳性。购买筛查呈阳性农药标准品进行准确定量分析。
进一步地，所述步骤1)C9～C33正构烷烃混合标准溶液(100μg/mL，1.2mL)移取0.5mL于10mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，即得，质量浓度为5μg/mL正构烷烃混合液。
进一步地，所述步骤2)内标溶液为环氧七氯标准溶液(100μg/mL，1.2mL)移取1mL于10mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，即得，质量浓度为10μg/mL环氧七氯标准溶液。
进一步地，所述步骤3)茶叶样品、饱和食盐水、乙腈、无水硫酸镁、无水乙酸钠的质量体积比为2g：5mL：10mL：6g：1.5g；所述上清液与无水CaCl2的质量体积比为9mL：1000mg；所述上清液与无水硫酸镁、PSA、GCB、C18的质量体积比为8mL：1200mg：400mg：200mg：400mg。
进一步地，本发明还提供了一种非靶向农药残留快速筛查方法(Smart MRM方法)的验证及茶叶加标提取液中筛查到农药定量分析，它包括如下步骤：
a、对照品溶液的制备：甲胺磷、敌敌畏、甲基内吸磷、灭线磷、久效磷、甲拌磷、马拉硫磷、毒死蜱、对硫磷、三唑酮、二甲戊灵、氰戊菊酯、二嗪磷、六六六、滴滴涕、甲基乙拌磷、五氯硝基苯、乙拌磷、除线磷、甲基立枯磷、水胺硫磷、腐霉利、狄氏剂、联苯菊酯、溴氰菊酯、三唑磷、艾氏剂、异狄氏剂、甲氰菊酯、甲基对硫磷、苯硫磷、保棉磷、甲基毒死蜱、地虫硫磷、丙溴磷、杀螟硫磷、特丁硫磷、治螟磷、溴硫磷、伏杀硫磷(纯度≥98.0％，Dr.Ehrenstorfer公司)；分别取10.00mg的上述40种农药标准品于10mL容量瓶中用丙酮定制刻度，制得1000μg/mL的40种农药混合标准液Ⅰ，2～8℃保存；移取0.1mL的40种农药混合标准液Ⅰ于10mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，制得10μg/mL的40种农药混合标准液Ⅱ，2～8℃保存；移取2mL的40种农药混合标准液Ⅱ于10mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，制得2μg/mL的40种农药混合标准液Ⅲ，2～8℃保存。移取1mL的40种农药混合标准液Ⅱ于10mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，制得1μg/mL的40种农药混合标准液Ⅳ，2～8℃保存。
b、非靶向农药残留快速筛查方法(Smart MRM方法)验证：为验证Smart MRM筛查方法的可靠性，在空白茶叶样品中添加浓度为5μg/kg的40种农药标准品对照溶液，根据步骤1)—4)处理茶叶样品后进行GPC-GC-MS/MS筛查分析，利用Smart Pesticides Database数据库中各组分农药的预保留时间及相应农药目标物的MRM特征离子进行匹配，可实现多组分农药的快速定性筛查，如果在保留时间范围内有特征离子峰，且被识别，则可以判断茶叶样品中有该农药筛查呈阳性。空白茶叶样品中添加浓度为5μg/kg的40种农药均被筛查出阳性。
c、空白茶叶基质混合对照品溶液的制备：选取空白茶叶样品，根据步骤3)提取茶叶样品过程中不加环氧七氯内标液，即得空白茶叶样品提取液；取不同体积的a对照品溶液(40种农药混合标准液Ⅲ)，用空白茶叶样品提取液定容配制成含有环氧七氯内标溶液的5点工作曲线标准溶液。
所述步骤c的5点工作曲线标准液分别是0.05、0.10、0.20、0.50和1.00μg/mL；其分别含有1.00μg/mL环氧七氯内标液。
本发明方法的线性关系及方法检出限与定量限：40种农药的质量浓度与内标物环氧七氯质量浓度的比值和对应目标物峰面积与内标物环氧七氯峰面积的比值呈良好的线性关系，峰面积比为Y轴，浓度比为X轴；同时，以3倍信噪比和10倍信噪比为依据，确定方法的检测限与定量限。
本发明方法的回收率和精密度：通过空白茶叶样品进行40种农药加标实验，考察方法的准确性和重现性，加标浓度水平分别为25、50和100μg/kg。根据所述步骤1)—4)处理茶叶样品后进行GPC-GC-MS/MS分析，经Smart MRM方法筛查后，对筛查出农药进行准确定量分析，每个水平做6平行，得回收率与精密度。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明针对茶叶基质的复杂性，通过改进QuEChERS前处理方法，引入无水氯化钙，利用钙离子促进茶叶中有机酸、茶色素、茶多酚之间结合会诱导形成沉淀物，配合无水硫酸镁、PSA、GCB、C18进行分散固相净化，达到初步净化的效果；茶叶样品提取液再次通过在线凝胶渗透色谱技术(gel permeation chromatography，GPC)对其进行分离净化，凝胶渗透色谱主要依靠凝胶孔径大小的不同对不同分子大小的化合物进行分离，适用于各种样品提取液的净化，对高脂肪含量的样品净化效果最佳。GPC对茶叶中的脂肪、磷酯、甘油脂、糖酯和硫酯等化合物能达到很好净化效果。通过改进的QuEChERS方法与在线GPC-GC-MS/MS联用，实现GPC净化与GC-MS/MS分析检测合二为一，从而大大降低了茶叶中干扰物质对农药残留检测分析的影响，能够有效去除茶叶中干扰物质，降低茶叶农药残留分析检测时严重的基质效应。
根据正构烷烃C9～C33各组分烷烃的保留时间，将其导入Smart PesticidesDatabase数据库中，数据库中各组分农药的预保留时间按照保留指数进行计算，创建非靶向农药残留快速筛查方法(Smart MRM方法)；该Smart MRM方法可利用Smart PesticidesDatabase数据库中各组分农药的预保留时间及相应农药目标物的MRM特征离子进行匹配，可实现多组分农药的快速定性筛查，如果在保留时间范围内有特征离子峰，且被识别，则可以判断茶叶样品中有该农药筛查呈阳性。购买筛查呈阳性农药标准品对茶叶进行靶向定量分析。该方法具有快速、简便、无需标准物质定性等优势，能同时高通量地筛查大量农药，为农药残留快速筛查和质量控制提供了重要的方法依据，从而避免了茶叶农药残留分析漏检、盲检等现象的发生，为茶叶出口打破“国际绿色贸易壁垒”提供技术支撑。
附图说明
图1是本发明的流程示意图；
图2显示C9～C33正构烷烃混合标准液总离子流图；
图3显示典型茶叶加标提取液筛查到阳性农药的选择离子监测GC-MS/MS图；
图4显示典型茶叶加标提取液筛查到部分农药的质量色谱图。
具体实施方式
实施例1、一种非靶向农药残留快速筛查方法(Smart MRM方法)创建：
1)正构烷烃混合标准溶液的制备：C9～C33正构烷烃混合标准溶液(100μg/mL，1.2mL)移取0.5mL于10mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，即得，质量浓度为5μg/mL正构烷烃混合液。
2)吸取正构烷烃混合标准溶液液注入色谱仪，其GPC-GC-MS/MS条件分别是：
GPC条件：色谱柱：Shodex CLNpak EV-200(2.1mm×150mm)；流动相：丙酮-环己烷混合溶液(3:7，V/V)；流速：0.1mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL。
色谱条件：惰性石英管(保护柱)：5m×0.53mm；富集柱(预柱)：VF-1701MS(5m×0.25mm×0.25μm)；分析柱：VF-1701MS(25m×0.25mm×0.25μm)；柱温程序：初始温度40℃，保持7min，以20℃/min升温至125℃，再以10℃/min升温至300℃，保持10min；进样方式：分流进样；分流比：20；PTV进样口温度程序：初始温度65℃，保持1min，以150℃/min升温至250℃，保持10min；柱流量：1.75mL/min。
质谱条件：正构烷烃混合标准溶液扫描方式：全扫描(SCAN)；离子化方式：EI；电离电压：70eV；接口温度：300℃；离子源温度：230℃；扫描质量数范围(m/z)：50～500；溶剂延迟时间：5min；扫描时间：5.50～38.00min。
3)正构烷烃SCAN数据C9～C33各组分烷烃的保留时间，将C9～C33正构烷烃SCAN数据导入Smart Pesticides Database数据库中，数据库中各组分农药的预保留时间按照保留指数进行计算，创建非靶向农药残留快速筛查方法(Smart MRM方法)；该Smart MRM方法可利用Smart Pesticides Database数据库中各组分农药的预保留时间及相应农药目标物的MRM特征离子进行匹配，可实现多组分农药的快速定性筛查，如果在保留时间范围内有特征离子峰，且被识别，则可以判断茶叶样品中有该农药筛查呈阳性。购买筛查呈阳性农药标准品进行准确定量分析。
实施例2、一种非靶向农药残留快速筛查方法(Smart MRM方法)的验证：
1)40种农药标准溶液的制备：甲胺磷、敌敌畏、甲基内吸磷、灭线磷、久效磷、甲拌磷、马拉硫磷、毒死蜱、对硫磷、三唑酮、二甲戊灵、氰戊菊酯、二嗪磷、六六六、滴滴涕、甲基乙拌磷、五氯硝基苯、乙拌磷、除线磷、甲基立枯磷、水胺硫磷、腐霉利、狄氏剂、联苯菊酯、溴氰菊酯、三唑磷、艾氏剂、异狄氏剂、甲氰菊酯、甲基对硫磷、苯硫磷、保棉磷、甲基毒死蜱、地虫硫磷、丙溴磷、杀螟硫磷、特丁硫磷、治螟磷、溴硫磷、伏杀硫磷(纯度≥98.0％，Dr.Ehrenstorfer公司)；分别取10.00mg的上述40种农药标准品于10mL容量瓶中用丙酮定制刻度，制得1000μg/mL的40种农药混合标准液Ⅰ，2～8℃保存；移取0.1mL的40种农药混合标准液Ⅰ于10mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，制得10μg/mL的40种农药混合标准液Ⅱ，2～8℃保存；移取2mL的40种农药混合标准液Ⅱ于10mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，制得2μg/mL的40种农药混合标准液Ⅲ，2～8℃保存。移取1mL的40种农药混合标准液Ⅱ于10mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，制得1μg/mL的40种农药混合标准液Ⅳ，2～8℃保存。
2)称取2g空白茶叶试样(精确至0.01g)于50mL离心管中，向其加入10μL质量浓度为1μg/mL的40种农药混合标准液Ⅳ，加入5mL饱和食盐水旋涡混匀，静止30min，加入10mL乙腈溶液，旋涡振动提取20min，再加入6g无水硫酸镁与1.5g无水乙酸钠，继续旋涡振动提取10min，以8000r/min离心10min，取上清液加入1g无水CaCl2，旋涡振动5min，再次以8000r/min离心10min，取8mL上清液转入装有1200mg无水硫酸镁、400mgPSA、200mgGCB、400mgC18的10mL离心管，涡旋振动5min，以8000r/min离心10min，取5mL上清液在40℃氮吹至近干，加入其质量浓度为10μg/mL环氧七氯内标液0.1mL，乙酸乙酯定容至1mL，过0.22μm滤膜，供GPC-GC-MS/MS测定。
3)GPC-GC-MS/MS条件分别是：
GPC条件：色谱柱：Shodex CLNpak EV-200(2.1mm×150mm)；流动相：丙酮-环己烷混合溶液(3:7，V/V)；流速：0.1mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL。
色谱条件：惰性石英管(保护柱)：5m×0.53mm；富集柱(预柱)：VF-1701MS(5m×0.25mm×0.25μm)；分析柱：VF-1701MS(25m×0.25mm×0.25μm)；柱温程序：初始温度40℃，保持7min，以20℃/min升温至125℃，再以10℃/min升温至300℃，保持10min；进样方式：分流进样；分流比：20；PTV进样口温度程序：初始温度65℃，保持1min，以150℃/min升温至250℃，保持10min；柱流量：1.75mL/min。
质谱条件：多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)；离子化方式：EI；电离电压：70eV；接口温度：300℃；离子源温度：230℃；溶剂延迟时间：5min；扫描时间：5.50～38.00；检测器电压:调谐电压+0.5kV。
4)空白茶叶样品加标提取液经非靶向农药残留快速筛查方法(Smart MRM方法)的筛查结果：向空白茶叶样品中添加浓度为5μg/kg混合农药标准液作为筛查样品，对其方法的灵敏度进行考察，添加的40种农药均被检出，筛查到40种农药选择离子监测GC-MS/MS图如图3所示，质量色谱图如图4所示，表1给出了各化合物的峰面积与信噪比。
表1、基质加标溶液中筛查出40种农药的峰面积和信噪比
Figure BDA0002718137580000051
Figure BDA0002718137580000061
5)在无需标准品情况下，采用岛津(SHIMADZU)公司的GPC-GC-MS/MS-TQ8050建立茶叶中一种非靶向农药残留快速筛查方法(Smart MRM方法)，在空白茶叶基质中加入40种农药作为筛查目标，经Smart MRM方法筛查后40种农药的目标组分均能被检出，且各组分响应信号高，使用该系统建立的非靶向农药残留快速筛查方法可以有效降低基质对目标物质的干扰；同时采用PTV进样口大体积进样，可提高检测灵敏度，有利于样品中痕量物质的筛查。
实施例3、茶叶样品添加40种农药作为筛查目标经Smart MRM方法筛查后的定量分析：
1)称取3管分别为2g空白茶叶试样(精确至0.01g)于50mL离心管中，加标浓度水平分别为25、50和100μg/kg，加入5mL饱和食盐水旋涡混匀，静止30min，加入10mL乙腈溶液，旋涡振动提取20min，再加入6g无水硫酸镁与1.5g无水乙酸钠，继续旋涡振动提取10min，以8000r/min离心10min，取上清液加入1g无水CaCl2，旋涡振动5min，再次以8000r/min离心10min，取8mL上清液转入装有1200mg无水硫酸镁、400mgPSA、200mgGCB、400mgC18的10mL离心管，涡旋振动5min，以8000r/min离心10min，取5mL上清液在40℃氮吹至近干，加入其质量浓度为10μg/mL环氧七氯内标液0.1mL，乙酸乙酯定容至1mL，过0.22μm滤膜，每个水平重复6次，应用GPC-GC-MS/MS-TQ8050建立的非靶向农药残留快速筛查方法(Smart MRM方法)进行定性筛查。
2)对定性筛查呈阳性农药进行准确定量分析：GPC-GC-MS/MS条件分别是：
GPC条件：色谱柱：Shodex CLNpak EV-200(2.1mm×150mm)；流动相：丙酮-环己烷混合溶液(3:7，V/V)；流速：0.1mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL。
色谱条件：惰性石英管(保护柱)：5m×0.53mm；富集柱(预柱)：VF-1701MS(5m×0.25mm×0.25μm)；分析柱：VF-1701MS(25m×0.25mm×0.25μm)；柱温程序：初始温度80℃，保持1min，以10℃/min升温至200℃，再以15℃/min升温至290℃，保持10min；进样方式：分流进样；分流比：20；PTV进样口温度程序：初始温度70℃，保持1min，以120℃/min升温至250℃，保持10min；柱流量：1.75mL/min。
质谱条件：离子化方式：EI；电离电压：70eV；接口温度：300℃；离子源温度：230℃；溶剂延迟时间：5min；检测器电压:调谐电压+0.5kV；质谱多反应监测(multiple reactionmonitoring，MRM)(MRM参数见表2)。
表2、40种农药及环氧七氯内标的MRM参数
Figure BDA0002718137580000062
Figure BDA0002718137580000071
3)空白茶叶基质提取液配制标准曲线和检出限：
a、称取2g空白茶叶试样(精确至0.01g)于50mL离心管中，加入5mL饱和食盐水旋涡混匀，静止30min，加入10mL乙腈溶液，旋涡振动提取20min，再加入6g无水硫酸镁与1.5g无水乙酸钠，继续旋涡振动提取10min，以8000r/min离心10min，取上清液加入1g无水CaCl2，旋涡振动5min，再次以8000r/min离心10min，取8mL上清液转入装有1200mg无水硫酸镁、400mgPSA、200mgGCB、400mgC18的10mL离心管，涡旋振动5min，以8000r/min离心10min，取上清液即得空白茶叶基质提取液，待用。
b、分别移取25μL、50μL、100μL、250μL、500μL的40种农药混合标准液Ⅲ(2μg/mL)于1mL容量瓶中，再分别加入质量浓度为10μg/mL环氧七氯内标溶液0.1mL，用空白茶叶基质提取液定容至刻度，即得均含环氧七氯内标1μg/mL标准曲线工作液：0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL。
c、40种农药的质量浓度与内标物环氧七氯质量浓度的比值和对应目标物峰面积与内标物环氧七氯峰面积的比值呈良好的线性关系，峰面积比为Y轴，浓度比为X轴；同时，以3倍信噪比和10倍信噪比为依据，确定方法的检测限与定量限。结果表明，在0.05～1.00μg/mL范围内线性关系良好，相关系数(R2)均大于0.995，检测限为0.012～0.095μg/kg，定量限为0.124～0.895μg/kg。相关参数见表3。
表3、农药的校准曲线、检测限与定量限
Figure BDA0002718137580000081
Figure BDA0002718137580000091
4)选取茶叶空白样品，分别添加浓度为25、50和100μg/kg的三水平加标量，并按上述方法进行前处理和GPC-GC-MS/MS分析，每个水平重复测定6次，回收率和精密度测定结果见表4。由表4可知，该方法的平均回收率、精密度分别在74.02％～99.35％和1.02％～10.01％；符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》相应参数要求，表明该检测方法科学可行。
表4、茶叶中40种农药的回收率和精密度试验(n＝6)
Figure BDA0002718137580000092
Figure BDA0002718137580000101
本发明茶叶加标提取液筛查到农药准确定量分析方法的回收率和精密度均满足GB/T27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》参数要求，表明对筛查呈阳性农药准确定量分析方法科学可行。
综上，本发明采用改进的QuEChERS方法提取和净化茶叶样品，通过引入无水氯化钙，利用钙离子促进茶叶中有机酸、茶多酚、色素之间的结合形成沉淀，配合无水硫酸镁、PSA、GCB、C18进行分散固相净化从而达到初步净化效果；改进的QuEChERS方法与在线GPC-GC-MS/MS联用，实现GPC净化与GC-MS/MS分析检测合二为一，从而大大降低了茶叶中干扰物质对农药残留检测分析的影响。同时，利用C9～C33正构烷烃校准Smart PesticidesDatabase数据库中各组分农药的预保留时间，创建非靶向农药残留快速筛查方法(SmartMRM方法)，该方法无需使用农药标准品就能够实现茶叶中多组分农药残留的快速定性筛查，通过筛查呈阳性农药再进行靶向定量分析，大大降低检测成本，提高了检测效率，防止了茶叶中农药残留漏检、盲检现象的发生，为茶叶出口打破“国际绿色贸易壁垒”提供技术支撑。本发明方法快速、准确、分析通量高，为茶叶中农药的快速筛查和质量控制提供重要方法依据。

Claims (5)

1.一种在线GPC-GC-MS/MS非靶向快速筛查茶叶中农药残留的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）正构烷烃混合标准溶液的制备：取C9~C33正构烷烃混合标准溶液，用正己烷定容稀释，即得；
（2）内标溶液的制备：取环氧七氯标准溶液，用正己烷定容稀释，即得；
（3）茶叶样品提取溶液的的制备：称取茶叶样品粉末，加入饱和食盐水旋涡混匀，静止30min，加入10mL乙腈溶液，旋涡振动提取20min，再加入无水硫酸镁与无水乙酸钠，继续旋涡振动提取10min，以8000r/min离心10min，取上清液加入1g无水CaCl2，旋涡振动5min，再次以8000r/min离心10min，将上清液转入装有无水硫酸镁、乙二胺-N-丙基硅烷PSA、石墨化碳黑GCB、十八烷基硅烷键合硅胶C18的10 mL离心管，涡旋振动5min，以8000r/min离心10min，取5mL上清液在40℃氮吹至近干，加入其质量浓度为10μg/mL环氧七氯内标液0.1mL，乙酸乙酯定容至1mL，过0.22μm滤膜，供GPC-GC-MS/MS测定；
（4）分别吸取正构烷烃混合标准溶液和茶叶样品提取溶液注入色谱仪，其GPC-GC-MS/MS条件分别是：
GPC条件：色谱柱：Shodex CLNpak EV-200为2.1mm×150mm；流动相：丙酮-环己烷混合溶液体积比V/V 为3:7，V/V；流速：0.1mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；
色谱条件：惰性石英管保护柱：5m×0.53mm；富集柱预柱：VF-1701MS为5m×0.25mm×0.25μm；分析柱：VF-1701MS为25m×0.25mm×0.25μm；柱温程序：初始温度40℃，保持7min，以20℃/min升温至125℃，再以10℃/min升温至300℃，保持10min；进样方式：分流进样；分流比：20；PTV进样口温度程序：初始温度65℃，保持1min，以150℃/min升温至250℃，保持10min；柱流量：1.75mL/min；
质谱条件：正构烷烃混合标准溶液扫描方式：SCAN全扫描；离子化方式：EI；电离电压：70eV；接口温度：300℃；离子源温度：230℃；扫描质量数范围m/z：50~500；溶剂延迟时间：5min；扫描时间：5.50~38.00；茶叶样品提取溶液采集方式：MRM多反应监测；离子化方式：EI；电离电压：70eV；接口温度：300℃；离子源温度：230℃；溶剂延迟时间：5min；扫描时间：5.50~38.00；检测器电压：调谐电压+0.5 kV；
所述步骤4）正构烷烃SCAN数据C9~C33各组分烷烃的保留时间，将C9~C33正构烷烃SCAN数据导入Smart Pesticides Database 数据库中，数据库中各组分农药的预保留时间按照保留指数进行计算，创建非靶向农药残留快速筛查方法，即Smart MRM方法；该Smart MRM方法利用Smart Pesticides Database 数据库中各组分农药的预保留时间及相应农药目标物的MRM特征离子进行匹配，实现多组分农药的快速定性筛查，如果在保留时间范围内有特征离子峰，且被识别，则可以判断茶叶样品中有该农药筛查呈阳性，购买筛查呈阳性农药标准品进行靶向定量分析。
2.根据权利要求1所述的一种在线GPC-GC-MS/MS非靶向快速筛查茶叶中农药残留的方法，其特征在于：所述步骤（1）C9~C33正构烷烃混合标准溶液质量浓度为100μg/mL，1.2mL，移取0.5mL于10mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，即得，质量浓度为5μg/mL正构烷烃混合液。
3.根据权利要求1所述的一种在线GPC-GC-MS/MS非靶向快速筛查茶叶中农药残留的方法，其特征在于：所述步骤（2）内标溶液为环氧七氯标准溶液质量浓度为100μg/mL，1.2mL，移取1mL于10mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，即得，质量浓度为10μg/mL环氧七氯标准溶液。
4.根据权利要求1-3之一所述的一种在线GPC-GC-MS/MS非靶向快速筛查茶叶中农药残留的方法，其特征在于：所述步骤（3）茶叶样品、饱和食盐水、乙腈、无水硫酸镁、无水乙酸钠的质量体积比为2g：5mL：10mL：6g：1.5g；所述上清液与无水CaCl2的质量体积比为9 mL：1000mg；所述上清液与无水硫酸镁、PSA、GCB、C18的质量体积比为8mL：1200mg：400mg：200mg：400 mg。
5.根据权利要求4所述的一种在线GPC-GC-MS/MS非靶向快速筛查茶叶中农药残留的方法，其特征在于：步骤4）之后Smart MRM方法的验证及茶叶加标提取液中筛查到农药的定量分析，包括如下步骤：
a、对照品溶液的制备：甲胺磷、敌敌畏、甲基内吸磷、灭线磷、久效磷、甲拌磷、马拉硫磷、毒死蜱、对硫磷、三唑酮、二甲戊灵、氰戊菊酯、二嗪磷、六六六、滴滴涕、甲基乙拌磷、五氯硝基苯、乙拌磷、除线磷、甲基立枯磷、水胺硫磷、腐霉利、狄氏剂、联苯菊酯、溴氰菊酯、三唑磷、艾氏剂、异狄氏剂、甲氰菊酯、甲基对硫磷、苯硫磷、保棉磷、甲基毒死蜱、地虫硫磷、丙溴磷、杀螟硫磷、特丁硫磷、治螟磷、溴硫磷、伏杀硫磷；40种农药标准品均购于Dr.Ehrenstorfer公司，纯度≥98.0%；分别取10.00mg的上述40种农药标准品于10mL容量瓶中用丙酮定制刻度，制得1000 μg/mL的40种农药混合标准液Ⅰ，2~8℃保存；移取0.1mL的40种农药混合标准液Ⅰ于10mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，制得10 μg/mL的40种农药混合标准液Ⅱ，2~8℃保存；移取2mL的40种农药混合标准液Ⅱ于10mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，制得2μg/mL的40种农药混合标准液Ⅲ，2~8℃保存；移取1mL的40种农药混合标准液Ⅱ于10mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，制得1μg/mL的40种农药混合标准液Ⅳ，2~8℃保存；
b、非靶向农药残留快速筛查方法验证：为验证Smart MRM筛查方法的可靠性，在空白茶叶样品中添加浓度为5μg/kg的40种农药标准品对照溶液，根据处理茶叶样品后进行GPC-GC-MS/MS筛查分析，利用Smart Pesticides Database 数据库中各组分农药的预保留时间及相应农药目标物的MRM特征离子进行匹配，实现多组分农药残留的快速定性筛查，如果在保留时间范围内有特征离子峰，且被识别，则可以判断茶叶样品中有该农药筛查呈阳性；空白茶叶样品中添加浓度为5μg/kg的40种农药均被筛查出阳性；
c、空白茶叶基质混合对照品溶液的制备：选取空白茶叶样品，所述步骤3）提取茶叶样品过程中不加环氧七氯内标液，即得空白茶叶样品提取液；取不同体积的a对照品溶液：40种农药混合标准液Ⅲ，用空白茶叶样品提取液定容配制成含有环氧七氯内标溶液的5点工作曲线标准溶液；步骤c的5点工作曲线标准液分别是0.05、0.10、0.20、0.50和1.00μg/mL；其分别含有1.00μg/mL环氧七氯内标液；
d、40种农药的质量浓度与内标物环氧七氯质量浓度的比值和对应目标物峰面积与内标物环氧七氯峰面积的比值呈良好的线性关系，峰面积比为Y轴，浓度比为X轴，同时，以3倍信噪比和10 倍信噪比为依据，确定方法的检测限与定量限；
e、通过空白茶叶样品进行40种农药加标实验，考察方法的准确性和重现性，加标浓度水平分别为25、50和100μg/kg，根据处理茶叶样品后进行GPC-GC-MS/MS分析，应用创建非靶向农药残留快速筛查方法进行定性筛查，每个水平做6平行，得回收率与精密度。
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