CN106950300A - 维生素b12 的液相色谱‑电感耦合等离子体质谱联用检测方法 - Google Patents

维生素b12 的液相色谱‑电感耦合等离子体质谱联用检测方法 Download PDF

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范志勇
张莉
彭青枝
文红
王会霞
周陶鸿
朱晓玲
龚蕾
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Abstract

本发明公开了一种维生素B12的液相色谱‑电感耦合等离子体质谱联用检测方法，通过将高效液相色谱与电感耦合等离子体质谱联用，得到了一种稳定可靠、抗基质干扰强、检出限低、操作简便、快速的维生素B12检测方法，特别适合于食品中维生素B12的测定，为食品中维生素B12的检测分析提供了新的借鉴和参考。

Description

维生素B12的液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用检测方法
技术领域
本发明涉及成分检测技术领域，具体地指一种维生素B12的液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用检测方法。
背景技术
维生素B12又称钴胺素或氰钴素，是一种由含钴的卟啉类化合物组成的B族维生素。维生素B12的检测至今是国际上食品分析的难题之一，首先是动物食品中的维生素B12有氰钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺和甲基钴胺等多种结构形式，传统的分析方法很难反映其实际含量；其次维生素B12在食品中的含量低，为10-9级，通常食品含量在0.4～3μg/100g；另外，维生素B12主要以维生素B12-内因子复合物的形式存在，充分提取和分离难度很大，样品中其他色谱行为与维生素B12相近的水溶性维生素也会对它的分离检测造成很大干扰。
目前，维生素B12的测定标准方法涉及微生物法(GB5413.14-2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定)、高效液相色谱法(GB/T 5009.217-2008保健食品中微生物B12的测定)、液相色谱法-串联质谱法(SN/T 4258-2015出口食品中水溶性维生素的测定方法第二部分)，尚无HPLC-ICP/MS的方法。以往的研究表明，分光光度法成本低、灵敏度也低；微生物法检出限低，但步骤繁琐、费时费力、易受污染且准确度不高；原子吸收光谱法适用于测定总钴；HPLC方法检出限较高，只适用于维生素B12含量较高的保健品的测定；高效毛细管电泳法灵敏性低，但可以测定不同形态，目前主要应用于基础和理论研究之中；LC-MS/MS灵敏度高，准确性好，检出限低，但是基质干扰较为严重。
综上所述，由于食品中维生素B12含量难以检测，而使用其他方法存在提取不充分和准确度不高等问题。由此可见，目前尚未有一种试样处理简单又快速准确测定食品中维生素B12含量的方法产生。
发明内容
本发明的目的就是要克服现有技术灵敏度不高、检出限高、基质干扰严重的缺陷，提供一种灵敏度高、检出限低、准确性好且操作便捷的维生素B12的液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用检测方法。
为实现上述目的，本发明所设计的维生素B12的液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用检测方法，其步骤如下：
(1)将含有维生素B12的原料经过前处理后溶解定容，或将原料中的钴胺素经过预处理得到性质稳定的氰钴胺后溶解定容，得到待净化液；
(2)将待净化液通过已活化的固相萃取柱，以低浓度的乙腈溶液洗去干扰物质，再以高浓度的乙腈溶液将维生素B12洗脱，收集全部洗脱液，根据含量稀释洗脱液，微孔滤膜后，得到待测液，待检测分析；
(3)进行维生素B12的HPLC-ICP/MS检测，所述液相色谱中选用的色谱柱为C18色谱柱。
优选地，上述方法中，所述原料的取用量精确至0.01g。
优选地，上述方法中，所述步骤(2)中低浓度的乙腈溶液的浓度为5～10％v/v；高浓度的乙腈溶液的浓度为20～40％v/v。
优选地，上述方法中，所述C18色谱柱，液相条件：流动相为A：5～10mmol乙酸铵：B甲醇＝81:19，等度洗脱，0.4mL/min；柱温24℃；进样量20μL。
优选地，上述方法中，电感耦合等离子体质谱仪的使用参数为：冷却气流速：14.0L/min；辅助气流速：0.8L/min；雾化器流速：1.05L/min；碰撞气流速：4.8mL/min；采样锥孔径：1.1mm；截取锥孔径：0.5mm；雾室温度：2℃；功率：1550W。
本方法具有较低检测下限，可以达到0.02μg/kg，如果MS的测量条件由KED模式改为STD模式，该方法的检测下限还可以提高3～5倍。而HPLC-MS/MS法的检出限为0.5μg/kg。
本发明的有益效果：本发明通过将高效液相色谱与电感耦合等离子体质谱联用，得到了一种稳定可靠、抗基质干扰强、检出限低、操作简便、快速的维生素B12检测方法，特别适合于食品中维生素B12的测定，为食品中维生素B12的检测分析提供了新的借鉴和参考。
附图说明
图1为采用本发明方法测定的标准溶液色谱图。
图2为采用本发明方法测定的标准溶液得出的标准曲线。
图3为本发明方法中采用不同甲醇比例下维生素B12的色谱图。
图4为本发明方法中流动相引入8mmol乙酸铵后对维生素B12分离的影响效果图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
以下本发明实施例采用的实验设备：
DIONEX UltiMate 3000液相色谱仪(美国赛默飞世尔仪器公司)；
C18色谱柱(美国赛默飞世尔仪器公司)；
iCAP Q电感耦合等离子体质谱仪及其工作站(美国赛默飞世尔仪器公司)；
ME204电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；
MS3digital涡旋仪(德国IKA公司)；
Centrifuge 5810离心机(艾本德中国有限公司)
实施例中所用试剂：维生素B12(氰钴胺，美国Sigma-Aldrich公司)；乙酸铵、乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯，盐酸、三氯乙酸均为分析纯；果汁饮料、谷物制品、含乳饮料、保健品为市售；所有用水均为超纯水(自制)
实施例1
维生素B12的液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用检测方法，步骤如下：
(1)样品处理：
样品一：果汁样品
称取果汁样品10g(精确至0.01g)于25mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度，得到待净化液1；
样品二：谷物制品
称取谷物制品5g(精确至0.01g)于50mL离心管中，加入25mL0.01mol/L盐酸溶液，涡旋混匀1min，超声15min，以3900r/min离心15min，收集上清液于50mL棕色容量瓶中，固体残留物用20mL0.01mol/L盐酸溶液再提取一次，合并提取上清液，并用水定容至刻度，得到待净化液2；
样品三：含乳饮料
称取含乳饮料10g(精确至0.01g)于50mL离心管中，加入10mL 40g/L三氯乙酸溶液，涡旋混匀1min，超声15min，以3900r/min离心15min，收集上清液于50mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度，得到待净化液3；
样品四：保健品
称取保健品0.5g(精确至0.01g)于50mL离心管中，加入25mL0.01mol/L盐酸溶液，涡旋混匀1min，超声15min，以3900r/min离心15min，收集上清液置于50mL棕色容量瓶中，残留物用20mL0.01mol/L盐酸溶液再提取一次，合并提取上清液，并用水定容至刻度，得到待净化液4。
需要说明的是，牛奶、鸡蛋、肉类等食品中含有天然维生素B12，其维生素B12的形态主要为甲钴胺及腺苷钴胺两种。尤其是动物内脏中含量较高，早期维生素B12就是从动物内脏提炼获得的，要想准确测定该类食品维生素B12的含量，首先必须用氰化钾将羟钴胺素、甲钴胺素和5-脫氧腺苷钴胺素等转化为较稳定的氰钴胺素再进行测定。对于这类产品在前处理过程中要加入氰化这一步骤：在150mL锥形瓶中准确称取待测样5～10g(准确到0.01g)，依次加入50mL乙酸钠缓冲液、2g胃蛋白酶、0.5g Taka-淀粉酶，充分混合使样品充分溶解，在37℃水浴30min后加入2mL氰化钾(或氰化钠)溶液，转入100℃水浴中，保持60min，冷却至室温。
(2)分别准确移取上述待净化液1～4各10mL，通过已活化的固相萃取柱，用5mL7％v/v乙腈溶液将干扰物质从固相萃取柱上淋洗下来，最后用3.0mL 25％v/v乙腈溶液将维生素B12洗脱，收集全部洗脱液，根据含量稀释洗脱液，过0.22μm微孔滤膜后，得到待测液，待检测分析。
(3)分别准确移取维生素B12的标准工作液5μL、10μL、25μL、50μL、100μL、125μL、250μL，用pH5.0的水溶液定容至10mL。其浓度分别为：0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL，此标准系列溶液使用前配制。
(4)进行维生素B12的HPLC-ICP/MS检测
液相条件
色谱柱：Thermo Fisher Hypersil GOLD(100mm×2.1mm，3μm)；流动相：A水(含8mM乙酸铵)：B甲醇＝81:19(V:V)，等度洗脱，0.4mL/min；柱温24℃；进样量20μL。
电感耦合等离子体质谱仪的参数设置
冷却气流速：14.0L/min、辅助气流速：0.8L/min、雾化器流速：1.05L/min、碰撞气流速：4.8mL/min、采样锥孔径：1.1mm、截取锥孔径：0.5mm、雾室温度：2℃、功率：1550W。
建立分析方法，按顺序依次测定空白溶液、标准溶液和待测液，以时间为横坐标，强度值为纵坐标拟合线性曲线，计算实际样品中维生素B12的含量，多次测定之后取平均值。样品一至四的检测结果见表1。
表1不同样品中测定的维生素B12含量结果
结果显示维生素B12在0.1～500μg/L范围内呈现出良好的线性关系，回归方程为y＝14431x-416，相关系数r＝0.9999。以信噪比S/N＝3计算方法检出限为0.02μg/kg，以S/N＝10计算定量限为0.06μg/kg。标准溶液色谱图见图1，标准曲线见图2。
实施例2
维生素B12的液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用检测方法，步骤如下：
(1)样品处理：
采用实施例1中的样品一(果汁样品)，处理所得的待净化液1；
(2)准确移取10mL上述待净化液1，通过已活化的固相萃取柱，用6mL 5％v/v乙腈溶液将干扰物质从固相萃取柱上淋洗下来，最后用4mL 20％v/v乙腈溶液将维生素B12洗脱，收集全部洗脱液，根据含量稀释洗脱液，过0.22μm微孔滤膜后，得到待测液，待检测分析。
(3)分别准确移取维生素B12的标准工作液5μL、10μL、25μL、50μL、100μL、125μL、250μL，用pH5.0的水溶液定容至10mL。其浓度分别为：0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL，此标准系列溶液使用前配制。
(4)进行维生素B12的HPLC-ICP/MS检测
液相条件
色谱柱：Thermo Fisher Hypersil GOLD(100mm×2.1mm，3μm)；流动相：A水(含10mM乙酸铵)：B甲醇＝81:19(V:V)，等度洗脱，0.4mL/min；柱温24℃；进样量20μL。
电感耦合等离子体质谱仪的参数设置
冷却气流速：14.0L/min、辅助气流速：0.8L/min、雾化器流速：1.05L/min、碰撞气流速：4.8mL/min、采样锥孔径：1.1mm、截取锥孔径：0.5mm、雾室温度：2℃、功率：1550W。
建立分析方法，按顺序依次测定空白溶液、标准溶液和待测液，以时间为横坐标，强度值为纵坐标拟合线性曲线，计算实际样品中维生素B12的含量，多次测定之后取平均值，结果见表2。
实施例3
维生素B12的液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用检测方法，步骤如下：
(1)样品处理：
采用实施例1中的样品一(果汁样品)，处理所得的待净化液1；
(2)准确移取10mL上述待净化液1，通过已活化的固相萃取柱，用5mL 10％v/v乙腈溶液将干扰物质从固相萃取柱上淋洗下来，最后用3.0mL 40％v/v乙腈溶液将维生素B12洗脱，收集全部洗脱液，根据含量稀释洗脱液，过0.22μm微孔滤膜后，待检测分析。
(3)分别准确移取维生素B12的标准工作液5μL、10μL、25μL、50μL、100μL、125μL、250μL，用pH5.0的水溶液定容至10mL。其浓度分别为：0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL，此标准系列溶液使用前配制。
(4)进行维生素B12的HPLC-ICP/MS检测
液相条件
色谱柱：Thermo Fisher Hypersil GOLD(100mm×2.1mm，3μm)；流动相：A水(含5mM乙酸铵)：B甲醇＝81:19(V:V)，等度洗脱，0.4mL/min；柱温24℃；进样量20μL。
电感耦合等离子体质谱仪的参数设置
冷却气流速：14.0L/min、辅助气流速：0.8L/min、雾化器流速：1.05L/min、碰撞气流速：4.8mL/min、采样锥孔径：1.1mm、截取锥孔径：0.5mm、雾室温度：2℃、功率：1550W。
建立分析方法，按顺序依次测定空白溶液、标准溶液和待测液，以时间为横坐标，强度值为纵坐标拟合线性曲线，计算实际样品中维生素B12的含量，多次测定之后取平均值，结果见表2。
上述实施例2、3及与实施例1的结果比较表如下。
表2不同洗脱条件及液相情况下测定结果
从结果上看实施例1、2、3均能准确的测定样品一中维生素B12的值，只不过，相对于实施例2、3，实施例1的方法能够用时较少或试剂用量少或出峰的峰型更佳，综合效果较好。
试验例1
精密度、重复性和稳定性：同一标准品溶液由同一操作者在同一实验室中的同一设备上应用本发明方法单独测试，连续进样6次，结果见表3，相对标准偏差RSD<0.10％。平行制备同一浓度混合标准品6份，由同一操作者在同一实验室中的同一设备上应用同一方法单独测试，结果见表4，相对标准偏差RSD<1.5％。同一标准品溶液由同一操作者在同一实验室中的同一设备上应用同一方法单独测试，分别在0、1、2、4、8、12、24、36、48h进样，结果见表5，相对标准偏差RSD<1.0％。
表3精密度实验
精密度 峰面积/cps 保留时间/s
1 354,727.68 274.3
2 354,047.99 273.9
3 354,090.94 272.8
4 354,596.03 272.7
5 354,630.12 272.7
6 354,158.45 272.9
RSD 0.09 0.26
表4重复性实验
重复性 峰面积/cps 保留时间/s
1 364,727.68 273.1
2 354,047.99 272.9
3 354,090.94 272.8
4 354,796.03 274.1
5 354,630.12 272.9
6 358,158.45 273.9
RSD 1.18 0.20
表5稳定性实验
试验例2：回收率
以实施例1～4做加标回收试验，结果见表6。
表6回收率实验(n＝6)
试验结果：维生素B12在0.1～500μg/L范围内线性良好，回归系数r＞0.999，回收率为81.3％～103.6％，RSD为0.4％～4.6％(n＝6)，精密度、重复性和稳定性RSD均小于3％。方法检出限为0.02μg/kg，使得该方法能应用于某些食品或强化食品中维生素B12的检测。
试验例3：流动相的影响
1)甲醇在流动相中不同占比对结果的影响
本实验选用C18色谱柱进行样品分离，样品为前述实施例1中的样品一，采用本发明方法测定，其中允许选择甲醇、乙腈等有机溶剂作为流动相，但ICP-MS的联用约束了含大量碳元素溶剂的使用。如乙腈溶剂，虽然有相关实验表明，外加氧气可以带走碳，但同时会导致灵敏度下降。因此，本试验采用甲醇作为流动相。通过比较不同比例的甲醇：8mmol/L乙酸铵水溶液(19:81、15:85、23：77)(V:V)，结果图见图3。
甲醇比例为19％时，维生素B12在300s内完全基线分离，峰型对称且尖锐。当甲醇比例调整为15％时，维生素B12在色谱柱里有较强保留。增加甲醇比例至23％时，维生素B12在150s完全基线分离，峰型保持对称尖锐，且仪器的灵敏性没有降低，碳滞留问题没有出现。但是高甲醇含量可能会引起碳滞留，以及提高成本，因此综合考虑，本实验选择19％的甲醇作为流动相。
2)流动相中乙酸铵的引入对结果的影响
本实验选用C18色谱柱进行样品分离，样品为前述实施例1中的样品一，采用本发明方法测定，通过比较甲醇流动相及引入8mmol/L乙酸铵(甲醇：8mmol/L乙酸铵水溶液＝19:81)的效果如图4所示。
一方面，添加乙酸铵后维生素B12的峰型稍有改善；另一方面，乙酸铵的一个重要功能是保持流动相pH值为6.2。有研究报导，维生素B12在pH值4.5～5.0弱酸条件下最稳定，流动相pH值变维生素B12的色谱行为。但本实验发现，将流动相pH值调至5.0时，维生素B12的响应和峰型几乎没有变化，通过48h实验，稳定性也几乎相同，而添加8mmol/L的乙酸铵是一个比较合适的浓度。

Claims (5)

1.一种维生素B12的液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用检测方法，其步骤如下：
(1)将含有维生素B12的原料经过前处理后溶解定容，或将原料中的钴胺素经过预处理得到性质稳定的氰钴胺后溶解定容，得到待净化液；
(2)将待净化液通过已活化的固相萃取柱，以低浓度的乙腈溶液洗去干扰物质，再以高浓度的乙腈溶液将维生素B12洗脱，收集全部洗脱液，根据含量稀释洗脱液，微孔滤膜后，得到待测液，待检测分析；
(3)进行维生素B12的HPLC-ICP/MS检测，所述液相色谱中选用的色谱柱为C18色谱柱。
2.根据权利要求1所述维生素B12的液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用检测方法，其特征在于：所述原料的取用量精确至0.01g。
3.根据权利要求1所述维生素B12的液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中低浓度的乙腈溶液的浓度为5～10％v/v；高浓度的乙腈溶液的浓度为20～40％v/v。
4.根据权利要求1所述维生素B12的液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用检测方法，其特征在于：所述C18色谱柱，液相条件：流动相为A：5～10mmol乙酸铵：B甲醇＝81:19，等度洗脱，0.4mL/min；柱温24℃；进样量20μL。
5.根据权利要求1所述维生素B12的液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用检测方法，其特征在于：电感耦合等离子体质谱仪的使用参数为：冷却气流速：14.0L/min；辅助气流速：0.8L/min；雾化器流速：1.05L/min；碰撞气流速：4.8mL/min；采样锥孔径：1.1mm；截取锥孔径：0.5mm；雾室温度：2℃；功率：1550W。
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