CN104614479A - 一种食品中维生素的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种食品中生物素的检测方法，特别是利用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪检测食品中生物素含量的方法。它包括样品前处理方法，超高效液相色谱检测、串联质谱检测步骤，方法：采用HSS T3液相色谱柱分离，以10mmol/L乙酸铵缓冲液(含0.1％甲酸)和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾-正离子电离源多反应监测模式进行定性和定量分析。结果：生物素(VB7)的方法定量限为0.6μg/100g，回收率为81.3％，相对标准偏差为5.5％，线性范围为0.2-10ng/mL。结论：该方法分析操作简单、快速、灵敏度高、重复性好，适用于奶粉中生物素的定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及食品维生素含量检测分析领域，特别是涉及超高效液相色谱-串联质谱法检测食品中维生素含量的方法。
背景技术
维生素是生命维持生理功能所必需的有机化合物，在食物的天然成分中含量极少，尽管微量但是对基体的正常生理功能至关重要，如果缺少或不足将引起特殊的缺失综合征。目前已有13种物质或物质群被普遍认为是维生素，根据溶解度，可将其分为脂溶性维生素和水溶性维生素。水溶性维生素的测定方法有微生物法、液相色谱法、高效液相色谱-质谱法等。其中传统微生物法灵敏度高，应用较广泛，但是其耗时长、操作繁琐，而且难以大多数菌种都不是专一性的，会产生较大检测误差；分光光度法和荧光分析法由于测定基质干扰大、灵敏度低，应用受到限制；高效液相色谱-质谱法可获得满意的结果，但现有技术多为单一维生素的检测方法，使其检测成本偏高。
生物素(Biotin，VB7)，是一种水溶性B族维生素。生物素是构成羧化酶的重要辅酶，参与人体内脂肪、糖类和氨基酸的代谢，对于维持机体正常生理功能有重要的作用。其长期的摄入不足会导致免疫，代谢，基因表达方面的疾病。配方奶粉是婴幼儿除母乳外主要的营养来源，因此对其中生物素的检测监督是十分必要的。
目前，国内外关于生物素的检测方法都比较复杂，常见的有微生物法、高效液相法、酶联免疫法和液质联用法。高效液相法的检测下限过高，酶联免疫法的检测结果不够稳定，经典的微生物法虽然检测结果准确，检出限低，但检测周期长，重复性差，费时费力，对实验操作环境有比较严格的要求。
超高效液相色谱-串联质谱检测方法与上述方法相比，具有分离能力强、定性分析结果可靠、检出限低、分析时间快、自动化程度高等优点。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力与质谱具有高选择性、高灵敏性及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来。
发明内容
本发明提供一种超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS-MS)检测食品(如奶粉)中生物素的方法，特别地能够实现食品(如奶粉)中生物素、泛酸(Pantothenicacid，VB5)、氰钴胺素(Cyanocobalamin，VB12)的同时测定，是一种简单、快速、准确的分析方法。
本发明方法分离能力强，自动化程度高，检测快速准确，检出限低，可达到0.6μg/100g，样品前处理时间缩短为30min，分析快速，单个样品检测时间缩短为5min以内。
本发明提供一种超高效液相色谱-串联质谱法检测食品(如奶粉)中生物素含量的方法，包括以下步骤：
1)制备供试样品
称取样品，加入水溶解或者乙酸铵缓冲液(5-10mmol/L)溶解，涡旋振荡后超声提取1-3次；提取液加入高氯酸或三氯甲烷涡旋振荡后，离心；上清液用超纯水稀释，经微滤膜过滤后即为供试样品；
例如，称取样品0.1-1.0g于50mL离心管中，按照1:5-1:20(优选1:10)的比例(样品重量与水或乙酸铵缓冲液体积之比)加入水或5-10mmol/L乙酸铵缓冲液(优选10mmol/L)溶解，涡旋振荡1-3min(优选1min)，超声5-20min(优选10min)；提取液按照1:5-20(优选1:10)的体积比加入高氯酸或三氯甲烷，涡旋振荡1-3min(优选1min)，离心(10000r/min离心10min)；上清液用超纯水适当稀释，经0.22μm GHP(亲水性聚丙烯)滤膜过滤后即为供试样品；
2)超高效液相色谱测定
将步骤1)的供试样品进行超高效液相色谱串联质谱测定，色谱条件为：
色谱柱：Waters Acquity HSS T3柱(1.0mm×100mm,1.8μm)或BEH C18柱(100mm×2.1mm,1.7μm)；
流速：0.2-0.4mL/min；
柱温：30-40℃；(优选40℃)；
样品温度：10-15℃(优选15℃)；
进样量：10μL；
流动相A：5-10mmol/L乙酸铵缓冲液(含0.1％甲酸)；(优选10mmol/L)；
流动相B：乙腈；
梯度洗脱；
流动相梯度洗脱条件
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 99 | 1 |
| 1.0 | 99 | 1 |
| 3.0 | 63 | 37 |
| 3.1 | 1 | 99 |
| 4.0 | 99 | 1 |
| 5.0 | 99 | 1 |
3)质谱测定
离子源：电喷雾离子源正离子模式(ESI+)；
监测方式：多反应检测(MRM)；
毛细管电压：1.5-2.3kv；(优选1.5kv)
离子源温度：150℃；
脱溶剂气温度：500℃；
锥孔气流量(氮气)：50L/h；
脱溶剂气流量(氮气)：700-1000L/h；优选1000L/h；
碰撞气流速(氩气)：0.17mL/min；
母离子m/z＝245.1，子离子m/z＝227和97，锥孔电压20-30v(优选22v)，碰撞能量分别为10-20ev(优选14ev)和30-40ev(优选30ev)；
4)计算结果
通过调整y轴截距(X＝x+b/a)，由线性方程y＝ax+b得到校正方程y＝aX，y代表峰面积，X代表样品中分析物的浓度；取样品经样品前处理后上机测试，得到峰面积，并根据校正方程和稀释倍数计算出样品中分析物的浓度，平行测定6次(n＝6)，可以得到测定结果。
本发明方法还包括标准工作液的配制：即精确称取生物素标准品适量(精确至0.01mg)用水溶解，配制成100μg/mL的储备液，冷藏避光保存；临用时，用水稀释成标准系列浓度溶液，经微滤膜(如0.22μm GHP滤膜)过滤，进行UPLC-MS-MS分析检测。
本发明通过对样品前处理方法和UPLC-MS-MS条件优化，建立了一种测定生物素的方法。本方法利用水溶超声波提取，采用三氯甲烷除蛋白，操作简单分析周期短，得到了较好提取效果。通过电喷雾-正离子电离源多反应监测模式进行定性和定量分析，样品回收率满足要求。本方法结果准确，操作简单，分析周期短，可应用于食品中生物素的检测。
本发明提供还一种超高效液相色谱-串联质谱法同时检测食品(如奶粉)中生物素、泛酸、氰钴胺素含量的方法，包括以下步骤：
1)制备供试样品
称取样品，加入水溶解或者乙酸铵缓冲液液(2-15mmol/L)溶解，涡旋振荡后超声提取1-3次；提取液(上清液)加入高氯酸或三氯甲烷涡旋振荡后，离心；上清液用超纯水稀释，经微滤膜过滤后即为供试样品；
例如，称取样品0.1-1.0g于50mL离心管中，按照1:5-20(优选1:10)的比例(样品重量与水或乙酸铵缓冲液体积之比)加入水或5-10mmol/L乙酸铵缓冲液(优选10mmol/L)溶解，涡旋振荡1-3min(优选1min)，超声5-20min(优选10min)；提取液(上清液)按照1:5-15(优选1:10)的体积比加入高氯酸或三氯甲烷，涡旋振荡1-3min(优选1min)，离心(10000r/min离心10min)；上清液用超纯水适当稀释，经0.22μm GHP(亲水性聚丙烯)滤膜过滤后即为供试样品；
2)超高效液相色谱测定
将步骤1)的供试样品进行超高效液相色谱串联质谱测定，色谱条件为：
色谱柱：Waters Acquity HSS T3柱(1.0mm×100mm,1.8μm)或BEH C18柱(100mm×2.1mm,1.7μm)；
流速：0.2-0.4mL/min；
柱温：30-40℃；(优选40℃)；
样品温度：10-15℃(优选15℃)；
进样量：10μL；
流动相A：5-10mmol/L乙酸铵缓冲液(含0.1％甲酸)；(优选10mmol/L)；
流动相B：乙腈；
梯度洗脱：
流动相梯度洗脱条件
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 99 | 1 |
| 1.0 | 99 | 1 |
| 3.5 | 45 | 55 |
| 4.0 | 99 | 1 |
| 5.0 | 99 | 1 |
3)质谱测定
离子源：电喷雾离子源正离子模式(ESI+)；
监测方式：多反应检测(MRM)；
毛细管电压：1.5-2.3kv；(优选1.5kv)
离子源温度：150℃；
脱溶剂气温度：500℃；
锥孔气流量(氮气)：50L/h；
脱溶剂气流量(氮气)：700-1000L/h；优选1000L/h；
碰撞气流速(氩气)：0.17mL/min；
3种维生素的定量和定性离子对、锥孔电压、碰撞能量等参数见下表：
3种维生素的定性和定量离子对、锥孔电压和碰撞能量
*定量离子对；
4)计算结果
通过调整y轴截距(X＝x+b/a)，由线性方程y＝ax+b得到校正方程y＝aX，y代表峰面积，X代表样品中分析物的浓度；取样品按照经样品前处理后上机测试，得到峰面积，并根据校正方程和稀释倍数计算出样品中分析物的浓度，平行测定6次(n＝6)，可以得到测定结果。
本发明方法还包括混合标准工作液的配制：即精确称取生物素、泛酸钙、氰钴胺素标准品适量(精确至0.01mg)用水溶解，配制成100μg/mL的储备液，冷藏避光保存；临用时，用水稀释成标准系列浓度溶液，经微滤膜(如0.22μm GHP滤膜)过滤，进行UPLC-MS-MS分析检测。
本发明通过对样品前处理方法和UPLC-MS-MS条件优化，建立了一种测定生物素的方法。本方法利用水溶超声波提取，采用三氯甲烷除蛋白，操作简单分析周期短，得到了较好提取效果。通过电喷雾-正离子电离源多反应监测模式进行定性和定量分析，样品回收率满足要求。本方法结果准确，操作简单，分析周期短，可应用于食品中生物素的检测，或应用于食品中生物素、泛酸、氰钴胺素的检测。
本发明另提供一种超高效液相色谱-同位素稀释质谱法测定食品(如配方奶粉)中的生物素含量的方法，采用可以抵消样品处理过程中损失的同位素稀释质谱法，同时结合超高效液相色谱-串联质谱良好的分离能力及高选择性，对食品(如配方奶粉)中的生物素进行了定性和定量分析，是一种结果准确、分析速度快、重复性好、灵敏度高、样品处理简单的检测方法。
一种超高效液相色谱-同位素稀释质谱法测定食品(如配方奶粉)中的生物素含量的方法，包括以下步骤：
1)制备供试样品
称取样品，加入0.5mol/L硫酸或1.0mol/L盐酸溶解后在121℃，1MPa条件下水解30min；或加入水溶解后超声10min；提取液加入高氯酸或三氯甲烷后涡旋振荡，离心；
上清液用超纯水稀释，经微滤膜过滤后即为供试样品；
例如，称取样品5g(精确至0.0001g)于50mL锥形瓶中，加入与样品中生物素含量相近的生物素-D2标准储备液；瓶中加入30mL温水振摇溶解后，超声提取10min。冷却至室温，提取液用5mol/L硫酸溶液或1.0mol/L盐酸溶液调pH值到1.7，再用10mol/L氢氧化钠溶液调pH值到4.6，溶液转移到100mL容量瓶中，用水冲洗3次，合并溶液于容量瓶中，定容混匀后过滤，滤液过0.2μm GHP滤膜，待上机分析。
2)超高效液相色谱测定
将步骤1)的供试样品进行超高效液相色谱测定，色谱条件为：
色谱柱：BEH C18柱(100mm×2.1mm，1.7μm)或优选Waters Acquity＠ HSS T3柱(2.1mm×100mm，1.8μm)；
流速：0.2-0.4mL/min；
柱温：30-40℃；(优选40℃)；
样品温度：10-15℃(优选15℃)；
进样量：10μL；
流动相A：5-10mmol/L乙酸铵缓冲液(含0.1％甲酸)；(优选10mmol/L)；
流动相B：乙腈；
梯度洗脱，洗脱条件见下表
流动相梯度洗脱条件
| 时间/min | 流动相A/％ | 流动相B/％ |
| 0.0 | 99 | 1 |
| 1.0 | 99 | 1 |
| 3.0 | 85 | 15 |
| 4.5 | 85 | 15 |
| 5.0 | 1 | 99 |
| 6.0 | 1 | 99 |
| 6.1 | 99 | 1 |
| 7.0 | 99 | 1 |
3)质谱测定
离子源：电喷雾离子源正离子模式(ESI+)；
监测方式：多反应检测(MRM)；
毛细管电压：1.5-3.0kv；(优选3.0kv)
离子源温度：150℃；
脱溶剂气温度：500℃；
锥孔气流量(氮气)：50L/h；
脱溶剂气流量(氮气)：700-1000L/h；优选1000L/h；
碰撞气流速(氩气)：0.18mL/min；
生物素定性和定量离子对分别为m/z 245.1＞97.0和m/z 245.1＞227.0，生物素-D2的定性和定量离子对分别为m/z 247.1＞99.0和m/z 247.1＞229.0；生物素及其同位素的母离子、定量定性离子、锥孔电压、碰撞能量等参数见下表；
生物素及其同位素内标的质谱参数
*定量离子；
4)计算结果
通过调整y轴截距(X＝x+b/a)，由线性方程y＝ax+b得到校正方程y＝aX(y代表峰面积，X代表样品中分析物的浓度)；取样品经样品前处理后上机测试，得到峰面积，并根据校正方程和稀释倍数计算出样品中分析物的浓度，平行测定6次(n＝6)，可以得到测定结果。
所述的超高效液相色谱-同位素稀释质谱法测定食品中的生物素含量的方法还包括标准储备液配制；生物素标准储备溶液(100μg/mL)：精确称取生物素1.0mg，用50％甲醇水溶液溶解至10mL，摇匀，密封、避光保存；生物素-D2标准储备溶液(100μg/mL)：称取生物素-D21.0mg，用50％甲醇水溶液溶解至10mL，摇匀，密封、避光保存；临用前根据需要用水稀释成不同浓度的标准溶液。
超高效液相色谱-同位素稀释质谱技术是一种新型的仪器分析手段，它将色谱的良好的分离能力与质谱的高选择性结合起来，具有灵敏性高、选择性好、分析速度快并且分析结果准确等优点，近年来在食品分析中得到了广泛的应用。而同位素稀释技术通过加入稳定同位素标记物，可有效消除基质效应及处理过程带来的较大偏差，尽可能保证了分析结果的准确性。
本发明所述食品包括但不限于为块状或粉状或流质类食品，如奶粉、配方奶粉(牛奶粉、羊奶粉)、米粉、配方米粉、面条、营养面条、果泥，保健食品等。
附图说明
图1为本发明实施例1的生物素的色谱图；
图2为本发明实施例1的生物素的质谱图；
图3为本发明实施例1的生物素在T3柱上的色谱图；
图4为本发明实施例1的生物素的标准曲线图；
图5为本发明实施例3的3种维生素的定量离子色谱图；
图6为本发明实施例3的泛酸的校正曲线图；
图7为本发明实施例3的生物素的校正曲线图；
图8为本发明实施例3的氰钴胺素的校正曲线图；
图9为本发明实施例8的生物素在C18柱上的色谱图；
图10为本发明实施例8的生物素及生物素-D2的色谱图；
图11为本发明实施例8的生物素的子离子扫描图；
图12为本发明实施例8的生物素-D2的子离子扫描图。
具体实施方式
实施例1
超高效液相色谱-串联质谱法测定食品中生物素
一、实验仪器与试剂如下
1)仪器：Acquity＠ UPLC-XevoTQ型超高效液相色谱-串联质谱联用仪(美国Waters公司)；色谱柱：Acquity＠ HSS T3柱(美国Waters公司)；高速冷冻离心机(日本HITACHI公司)；漩涡振荡器(美国Scientific Industries公司)；分析天平(德国Sartorius公司)，0.22μmGHP滤膜(美国pall公司)。
2)试剂：生物素(VB7)标准品(美国Iso Sciences公司)，甲酸、乙酸铵(美国sigma公司)；乙醇、乙腈、三氯甲烷(美国Fisher公司)；超纯水。
二、实验设计如下：
1)在本实施例中，用生物素标准品确定最佳的色谱条件和质谱条件。
2)在本实施例中，确定最佳的样品前处理方法。
3)用已经确定的方法测定待测样品，确定其中是否含有生物素。
4)往待测样品中添加生物素标准品，测定方法的回收率、精密度、以及最低检出限。
三、试验方法如下：
1)样品中生物素的提取
称取婴幼儿营养米粉样品2.0g于50mL离心管中，加入20mL水。溶解后涡旋振荡1min，超声10min。取2mL上清液加入20mL三氯甲烷，涡旋振荡1min，10000r/min离心10min。上清液用超纯水适当稀释，经0.22μm GHP(亲水性聚丙烯)滤膜过滤后上机测定。
2)色谱与质谱条件
所用仪器为Acquity＠ UPLC-XevoTQ型超高效液相色谱-串联质谱联用仪。
液相条件：
色谱柱：Waters Acquity HSS T3柱(1.0mm×100mm，1.8μm)；
流速：0.2mL/min；
柱温：40℃；
样品温度：15℃；
进样量：10μL；
流动相A：10mmol/L乙酸铵缓冲液(含0.1％甲酸)；流动相B：乙腈。
流动相梯度：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 99 | 1 |
| 1.0 | 99 | 1 |
| 3.0 | 63 | 37 |
| 3.1 | 1 | 99 |
| 4.0 | 99 | 1 |
| 5.0 | 99 | 1 |
质谱条件：正离子方式，电喷雾源(ESI)；多反应监测模式(MRM)；毛细管电压：1.5kv；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：500℃；锥孔气流量(氮气)：50L/h；脱溶剂气流量(氮气)：1000L/h；碰撞气流速(氩气)：0.17mL/min。母离子m/z＝245.1，子离子m/z＝227和97，锥孔电压22v，碰撞能量分别为14ev和30ev。
四、实验结果
1)标准曲线绘制
线性范围、灵敏度可通过标准添加法进行评测。标准添加法的优势是可避免基质效应，消除离子抑制(或增强)的影响。取制备好的上清液1mL至10mL容量瓶中，添加标准储备溶液，加水定容，配制成标准使用液。添加浓度分别为0.2ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、8ng/mL、10ng/mL。在上述色谱和质谱条件下测定，记录峰面积、绘制峰面积-能读标准曲线，见图1、图2和图3。
根据其保留时间对应的子离子峰面积与其浓度进行回归分析，得到线性方程y＝952.51x+1996.2，R2＝0.9993，生物素在0.2-10ng/mL范围类线性良好，见图4。
2)检测结果
| 样品名称 | 生物素含量(μg/100g) |
| 婴幼儿营养米粉 | 2.6 |
| 配方米粉 | 3.1 |
| 营养米粉 | 2.3 |
3)方法的回收率和精密度
提取前加标处理：称取样品2.0g于50mL离心管中，加入1.0μg/mL的100μL生物素标准溶液，然后加入20mL水溶解。涡旋振荡1min，超声10min。加入20mL三氯甲烷，涡旋振荡1min，10000r/min离心10min。上清液用超纯水适当稀释，经0.22μmGHP滤膜过滤后上机测定。加标量为1ng/mL。
提取后加标处理：制备好的上清液1mL于10mL容量瓶中，加入1.0μg/mL的100μL生物素标准溶液，加水定容至刻度。加标量为1ng/mL。
通过比较提取前加标样品峰面积(A前)和提取后加标样品峰面积(A后)得到回收率(扣除了基质效应)。
根据测定结果计算回收率和精密度，结果如下表所示
| 化合物 | 加标量(ng/mL) | 回收率(％) | 相对标准偏差(％) |
| 生物素 | 1.0 | 81.3 | 5.5 |
4)方法的检出限和定量限
根据各定量离子3和10倍信噪比(S/N)对应样品中的浓度得到方法检出限和定量限。结果见下表
| 化合物 | 检出限LOD | 定量限LOQ |
| 生物素 | 2μg/100g | 0.6μg/100g |
实施例2
超高效液相色谱-串联质谱法测定食品中生物素
一、实验仪器与试剂如下：
1)仪器同实施例一
2)试剂同实施例一
二、实验设计如下：
1)在本实施例中，用生物素标准品确定最佳的色谱条件和质谱条件。
2)在本实施例中，确定最佳的样品前处理方法。
3)用已经确定的方法测定待测样品，确定其中是否含有生物素。
4)往待测样品中添加生物素标准品，测定方法的回收率、精密度、以及最低检出限。
三、试验方法如下：
1)样品中生物素的提取
称取婴幼儿配方牛奶粉样品0.5g于10mL离心管中，加入5mL水。涡旋振荡3min，超声20min。取0.5mL上清液加加入5mL三氯甲烷，涡旋振荡3min，10000r/min离心10min。上清液用超纯水适当稀释，经0.22μm GHP滤膜过滤后上机测定。
2)色谱与质谱条件
所用仪器为Acquity＠ UPLC-XevoTQ型超高效液相色谱-串联质谱联用仪。
液相条件：
色谱柱：Waters Acquity HSS T3柱(1.0mm×100mm，1.8μm)；
流速：0.3mL/min；
柱温：40℃；
样品温度：15℃；
进样量：10μL；
流动相A：10mmol/L乙酸铵缓冲液(含0.1％甲酸)；流动相B：乙腈。
流动相梯度：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 99 | 1 |
| 1.0 | 99 | 1 |
| 3.0 | 63 | 37 |
| 3.1 | 1 | 99 |
| 4.0 | 99 | 1 |
| 5.0 | 99 | 1 |
质谱条件：正离子方式，电喷雾源(ESI)；多反应监测模式(MRM)；毛细管电压：2.3kv；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：500℃；锥孔气流量(氮气)：50L/h；脱溶剂气流量(氮气)：800L/h；碰撞气流速(氩气)：0.17mL/min。母离子m/z＝245.1，子离子m/z＝227和97，锥孔电压22v，碰撞能量分别为10ev和30ev。
四、实验结果
1)标准曲线绘制
线性范围、灵敏度可通过标准添加法进行评测。标准添加法的优势是可避免基质效应，消除离子抑制(或增强)的影响。取制备好的上清液1mL至10mL容量瓶中，添加标准储备溶液，加水定容，配制成标准使用液。添加浓度分别为0.2ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、8ng/mL、10ng/mL。在上述色谱和质谱条件下测定，记录峰面积、绘制峰面积-能读标准曲线，见图1、图2和图3。
根据其保留时间对应的子离子峰面积与其浓度进行回归分析，得到线性方程y＝952.51x+1996.2，R2＝0.9993，生物素在0.2-10ng/mL范围类线性良好，图4。
2)检测结果
| 样品名称 | 生物素含量(μg/100g) |
| 雅培-妈妈喜康素配方奶粉 | 19.45 |
| 多美滋-婴幼儿配方奶粉 | 13.93 |
| 贝因美-婴幼儿配方奶粉 | 12.56 |
3)方法的回收率和精密度
提取前加标处理：称取样品0.5g于10mL离心管中，加入1.0μg/mL的100μL生物素标准溶液，然后加入5mL水溶解。涡旋振荡1min，超声10min。加入5mL三氯甲烷，涡旋振荡1min，10000r/min离心10min。上清液用超纯水适当稀释，经0.22μmGHP滤膜过滤后上机测定。加标量为1ng/mL。
提取后加标处理：制备好的上清液1mL于10mL容量瓶中，加入1.0μg/mL的100μL生物素标准溶液，加水定容至刻度。加标量为1ng/mL。
通过比较提取前加标样品峰面积(A前)和提取后加标样品峰面积(A后)得到回收率(扣
除了基质效应)。
根据测定结果计算回收率和精密度，结果如下表所示
| 化合物 | 加标量(ng/mL) | 回收率(％) | 相对标准偏差(％) |
| 生物素 | 1.0 | 82.6 | 4.6 |
4)方法的检出限和定量限
根据各定量离子3和10倍信噪比(S/N)对应样品中的浓度得到方法检出限和定量限。结果见下表
| 化合物 | 检出限LOD | 定量限LOQ |
| 生物素 | 2μg/100g | 0.6μg/100g |
实施例3
超高效液相色谱-串联质谱法同时测定食品中生物素、泛酸和氰钴胺素
一、实验仪器与试剂如下
1)仪器
Acquity＠ UPLC-Xevo TQ型超高效液相色谱-串联质谱联用仪，美国Waters公司；Acquity＠ HSS T3柱，美国Waters公司；高速冷冻离心机，日本HITACHI公司；漩涡振荡器，美国Scientific Industries公司；分析天平，德国Sartorius公司；0.22μm GHP滤膜(美国pall公司)。
2)试剂
奶粉(市售配方奶粉)；泛酸(VB5)、生物素(VB7)、氰钴胺素(VB12)纯度均大于99.5％，美国IsoSciences公司；甲酸、乙酸铵(均为色谱纯)，美国sigma公司；乙醇、乙腈、三氯甲烷(均为色谱纯)，美国Fisher公司；实验用水为超纯水。
二、实验设计如下：
1)在本实施例中，用生物素、泛酸、氰钴胺素标准品摸索并确定最佳的色谱条件和质谱条件。
2)在本实施例中，摸索并确定最佳的样品前处理方法。
3)用已经确定的方法测定待测样品，确定其中是否含有生物素、泛酸、氰钴胺素。
4)往待测样品中添加生物素标准品，测定方法的回收率、精密度、以及最低检出限。
三、试验方法如下：
1)溶液配制
混合标准工作液：精确称取生物素、泛酸钙、氰钴胺素标准品适量(精确至0.01mg)用水溶解，配制成100μg/mL的混合储备液，冷藏避光保存。临用时，用水稀释成标准系列浓度溶液，经0.22μm GHP滤膜过滤，进行UPLC-MS-MS分析。
2)样品提取
称取样品1.0g于50mL离心管中，加入10mL水。涡旋振荡1min，超声10min。取1mL上清液加入10mL三氯甲烷，涡旋振荡1min，10000r/min离心10min。上清液用超纯水适当稀释，经0.22μm GHP滤膜过滤后上机测定。
3)色谱条件
色谱柱的选择
色谱柱：Waters Acquity HSS T3柱(1.0mm×100mm，1.8μm)
试验了BEH C18柱(100mm*2.1mm，1.7μm)、BEH Amide柱(100mm*2.1mm，1.7μm)和HSS T3柱(100mm*2.1mm，1.8μm)的分离效果。因为目标物属于极性较强的化合物，它在C18柱和Amide柱上的保留较差，得到的峰型也较差。而在对极性化合物有特殊保留能力的T3柱上得到了较好的分离效果，且峰型好，响应高，因此选择T3柱。
液相系统：Acquity UPLC系统；；流速：0.2mL/min；柱温：40℃；样品温度：15℃；进样量：10μL；流动相A：10mmol/L乙酸铵缓冲液(含0.1％甲酸)；流动相B：乙腈。
流动相梯度洗脱条件
| 时间/min | 流动相A/％ | 流动相B/％ |
| 0 | 99 | 1 |
| 1.0 | 99 | 1 |
| 3.5 | 45 | 55 |
| 4.0 | 99 | 1 |
| 5.0 | 99 | 1 |
4)质谱条件
质谱系统：Xevo TQ MS；离子化：ESI；监测方式：多反应检测(MRM)；毛细管电压：1.5kv；
离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：500℃；锥孔气流量(氮气)：50L/h；脱溶剂气流量(氮气)：1000L/h；碰撞气流速(氩气)：0.17mL/min。3种维生素的定量和定性离子对、锥孔电压、碰撞能量等参数见下表，结果见图5。
3种维生素的定性和定量离子对、锥孔电压和碰撞能量
*定量离子对。
四、实验结果
1)标准曲线绘制
线性范围、灵敏度可通过标准添加法进行评测。标准添加法的优势是可避免基质效应，消除离子抑制(或增强)的影响。
取制备好的上清液1mL至10mL容量瓶中，添加100μL含3种分析物的已知浓度标准溶液，加水定容，进样分析。得到相关系数≥0.9985的较好线性关系，泛酸的线性范围0.5-1000ng/mL，见图6；生物素为0.2-10ng/mL，见图7；氰钴胺素为0.02-10ng/mL，见图8。
2)检测结果
3)方法回收率和精密度
提取前加标处理：称取样品1.0g于50mL离心管中，加入100μL三种分析物标准溶液(VB5100μg/mL；VB71.0μg/mL；VB121.0μg/mL)，然后加入10mL水溶解。取1mL上清液加入10mL三氯甲烷，涡旋振荡1min，10000r/min离心10min。上清液用超纯水适当稀释，经0.22μm GHP滤膜过滤后上机测定。加标量见下表所示。见表所示。
3种维生素添加回收实验结果(n＝6)
| 维生素 | 加标量(ng/mL) | 回收率(％) | 相对标准偏差(％) |
| 泛酸 | 100 | 79.1 | 2.8 |
| 生物素 | 1.0 | 81.3 | 5.5 |
| 氰钴胺素 | 1.0 | 89.5 | 3.9 |
提取后加标处理：取制备好的上清液1mL于10mL容量瓶中，加入100μL三种分析物标准溶液(VB5100μg/mL；VB71.0μg/mL；VB121.0μg/mL)，加水定容至刻度。加标量
通过比较提取前加标样品峰面积(A前)和提取后加标样品峰面积(A后)得到回收率(扣除了基质效应)。
4)方法的检出限和定量限
根据各定量离子3和10倍信噪比(S/N)对应样品中的浓度得到方法检出限和定量限。结果见下表
检出限和定量限
| 化合物 | 检出限LOD | 定量限LOQ |
| 泛酸 | 0.005mg/100g | 0.002mg/100g |
| 生物素 | 2μg/100g | 0.6μg/100g |
| 氰钴胺素 | 0.2μg/100g | 0.06μg/100g |
实施例4
超高效液相色谱-串联质谱法同时测定食品中生物素、泛酸和氰钴胺素
一、实验仪器、设备与试剂同实施例3；试验材料奶粉。
二、实验设计如下：
1)在本实施例中，用生物素、泛酸、氰钴胺素标准品确定最佳的色谱条件和质谱条件。
2)在本实施例中，并确定最佳的样品前处理方法。
3)用已经确定的方法测定待测样品，确定其中是否含有生物素、泛酸、氰钴胺素三种维生素。
4)往待测样品中添加生物素、泛酸、氰钴胺素标准品，测定方法的回收率、精密度、以及最低检出限。
三、试验方法如下：
1)奶粉样品中生物素、泛酸、氰钴胺素的提取
称取样品2.0g于50mL离心管中，加入20mL乙酸铵缓冲溶液。涡旋振荡1min，超声10min。取1mL上清液加入10mL三氯甲烷，涡旋振荡1min，10000r/min离心10min。上清液用超纯水适当稀释，经0.22μm GHP(亲水性聚丙烯)滤膜过滤后上机测定。
2)色谱与质谱条件
所用仪器为Acquity＠ UPLC-Xevo TQ型超高效液相色谱-串联质谱联用仪。
液相条件：
色谱柱：Waters Acquity HSS T3柱(1.0mm×100mm，1.8μm)；流速：0.2mL/min；柱温：40℃；样品温度：15℃；进样量：10μL；流动相A：10mmol/L乙酸铵缓冲液(含0.1％甲酸)；流动相B：乙腈。
质谱条件：正离子方式，电喷雾源(ESI)；多反应监测模式(MRM)；毛细管电压：1.5kv；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：500℃；锥孔气流量(氮气)：50L/h；脱溶剂气流量(氮气)：1000L/h；碰撞气流速(氩气)：0.17mL/min。
3种维生素的定量和定性离子对、锥孔电压、碰撞能量等参数见下表，结果见图5。
3种维生素的定性和定量离子对、锥孔电压和碰撞能量
*定量离子对。
四、实验结果
1)标准曲线绘制
线性范围、灵敏度可通过标准添加法进行评测。标准添加法的优势是可避免基质效应，消除离子抑制(或增强)的影响。
取制备好的上清液1mL至10mL容量瓶中，添加10μL含3种分析物的已知浓度标准溶液，加水定容，配制成标准使用液。泛酸(VB5)的线性范围0.5-1000ng/mL，见图6；生物素(VB7)为0.2-10ng/mL，见图7；氰钴胺素(VB12)为0.02-10ng/mL，见图8。
在上述色谱和质谱条件下测定，记录峰面积、绘制峰面积-能读标准曲线。
根据其保留时间对应的子离子峰面积与其浓度进行回归分析，得到线性方程y＝952.51x+1996.2，R2＝0.9993，生物素在0.2-10ng/mL范围类线性良好。
2)检测结果
| 样品名称 | 生物素含量(μg/100g) | 泛酸(μg/100g) | 氰钴胺素(μg/100g) |
| 奶粉 | 12.7 | 1800 | 2.8 |
3)方法的回收率和精密度
提取前加标处理：
称取样品1.0g于50mL离心管中，添加100μL含3种分析物的已知浓度标准溶液(VB5100μg/mL；VB71.0μg/mL；VB121.0μg/mL)，加入10mL水。进行样品前处理(标准溶液中分析物稀释100倍，加标浓度VB5100ng/mL；VB71.0ng/mL；VB121.0ng/mL)。
提取后加标处理：
取上述“样品中生物素、泛酸、氰钴胺素的提取”步骤中的上清液100μL至进样瓶，添加10μL含3种分析物的已知浓度标准溶液(VB510μg/mL；VB70.1μg/mL；VB120.1μg/mL)，加水至1mL(标准溶液中分析物稀释10倍，加标浓度VB5100ng/mL；VB71.0ng/mL；VB121.0ng/mL)。
通过比较提取前加标样品峰面积(A前)和提取后加标样品峰面积(A后)得到回收率(扣除了基质效应)。
4)方法的检出限和定量限
根据各定量离子3和10倍信噪比(S/N)对应样品中的浓度得到方法检出限和定量限。结果见下表
| 维生素 | 检出限LOD | 定量限LOQ |
| 泛酸 | 0.005mg/100g | 0.002mg/100g |
| 生物素 | 2μg/100g | 0.6μg/100g |
| 氰钴胺素 | 0.2μg/100g | 0.06μg/100g |
实施例5
超高效液相色谱-串联质谱法同时测定食品中生物素、泛酸和氰钴胺素
一、实验仪器、设备与试剂同实施例3；试验材料配方羊奶粉。
二、实验设计如下：
1)在本实施例中，用生物素、泛酸、氰钴胺素标准品确定最佳的色谱条件和质谱条件。
2)在本实施例中，并确定最佳的样品前处理方法。
3)用已经确定的方法测定待测样品，确定其中是否含有生物素、泛酸、氰钴胺素三种维生素。
4)往待测样品中添加生物素、泛酸、氰钴胺素标准品，测定方法的回收率、精密度、以及最低检出限。
三、试验方法如下：
1)奶粉样品中生物素、泛酸、氰钴胺素的提取
称取样品1.0g于50mL离心管中，加入10mL乙酸铵缓冲溶液。涡旋振荡1min，超声10min。取1mL上清液加入10mL三氯甲烷，涡旋振荡1min，10000r/min离心10min。上清液用超纯水适当稀释，经0.22μmGHP(亲水性聚丙烯)滤膜过滤后上机测定。
2)色谱与质谱条件
所用仪器为Acquity＠ UPLC-Xevo TQ型超高效液相色谱-串联质谱联用仪。
液相条件：
色谱柱：Waters Acquity HSS T3柱(1.0mm×100mm，1.8μm)；流速：0.2mL/min；柱温：40℃；样品温度：15℃；进样量：10μL；流动相A：10mmol/L乙酸铵缓冲液(含0.1％甲酸)；流动相B：乙腈。
质谱条件：正离子方式，电喷雾源(ESI)；多反应监测模式(MRM)；毛细管电压：1.5kv；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：500℃；锥孔气流量(氮气)：50L/h；脱溶剂气流量(氮气)：1000L/h；碰撞气流速(氩气)：0.17mL/min。
3种维生素的定量和定性离子对、锥孔电压、碰撞能量等参数见下表，结果见图5。
3种维生素的定性和定量离子对、锥孔电压和碰撞能量
*定量离子对。
四、实验结果
1)标准曲线绘制
线性范围、灵敏度可通过标准添加法进行评测。标准添加法的优势是可避免基质效应，消除离子抑制(或增强)的影响。
取制备好的上清液1mL至10mL容量瓶中，添加10μL含3种分析物的已知浓度标准溶液，加水定容，配制成标准使用液。泛酸(VB5)的线性范围0.5-1000ng/mL，见图6；生物素(VB7)为0.2-10ng/mL，见图7；氰钴胺素(VB12)为0.02-10ng/mL，见图8。
在上述色谱和质谱条件下测定，记录峰面积、绘制峰面积-能读标准曲线。
根据其保留时间对应的子离子峰面积与其浓度进行回归分析，得到线性方程y＝952.51x+1996.2，R2＝0.9993，生物素在0.2-10ng/mL范围类线性良好。
2)检测结果
| 样品名称 | 生物素含量(μg/100g) | 泛酸(μg/100g) | 氰钴胺素(μg/100g) |
| 配方羊奶粉 | 9.0 | 1850 | 1.2 |
3)方法的回收率和精密度
提取前加标处理：
称取样品1.0g于50mL离心管中，添加100μL含3种分析物的已知浓度标准溶液(VB5100μg/mL；VB71.0μg/mL；VB121.0μg/mL)，加入10mL水。进行样品前处理(标准溶液中分析物稀释100倍，加标浓度VB5100ng/mL；VB71.0ng/mL；VB121.0ng/mL)。
提取后加标处理：
取制备好的上清液100μL至进样瓶，添加10μL含3种分析物的已知浓度标准溶液(VB510μg/mL；VB70.1μg/mL；VB120.1μg/mL)，加水至1mL(标准溶液中分析物稀释10倍，加标浓度VB5100ng/mL；VB71.0ng/mL；VB121.0ng/mL)。
通过比较提取前加标样品峰面积(A前)和提取后加标样品峰面积(A后)得到回收率(扣除了基质效应)。
4)方法的检出限和定量限
根据各定量离子3和10倍信噪比(S/N)对应样品中的浓度得到方法检出限和定量限。结果见下表
| 维生素 | 检出限LOD | 定量限LOQ |
| 泛酸 | 0.005mg/100g | 0.002mg/100g |
| 生物素 | 2μg/100g | 0.6μg/100g |
| 氰钴胺素 | 0.2μg/100g | 0.06μg/100g |
实施例6
超高效液相色谱-串联质谱法同时测定食品中生物素、泛酸和氰钴胺素
一、实验仪器、设备与试剂同实施例3；试验材料婴幼儿配方米粉(市售婴幼儿配方米粉)。
二、实验设计如下：
1)在本实施例中，用生物素、泛酸、氰钴胺素标准品确定最佳的色谱条件和质谱条件。
2)在本实施例中，并确定最佳的样品前处理方法。
3)用已经确定的方法测定待测样品，确定其中是否含有生物素、泛酸、氰钴胺素三种维生素。
4)往待测样品中添加生物素、泛酸、氰钴胺素标准品，测定方法的回收率、精密度、以及最低检出限。
三、试验方法如下：
1)配方米粉样品中生物素、泛酸、氰钴胺素的提取
称取样品1.0g于50mL离心管中，加入10mL乙酸铵缓冲溶液。涡旋振荡1min，超声10min。取1mL上清液加入10mL三氯甲烷，涡旋振荡1min，10000r/min离心10min。上清液用超纯水适当稀释，经0.22μmGHP(亲水性聚丙烯)滤膜过滤后上机测定。
2)色谱与质谱条件
所用仪器为Acquity＠ UPLC-Xevo TQ型超高效液相色谱-串联质谱联用仪。
液相条件：
色谱柱：Waters Acquity HSS T3柱(1.0mm×100mm，1.8μm)；流速：0.2mL/min；柱温：40℃；样品温度：15℃；进样量：10μL；流动相A：10mmol/L乙酸铵缓冲液(含0.1％甲酸)；流动相B：乙腈。
质谱条件：正离子方式，电喷雾源(ESI)；多反应监测模式(MRM)；毛细管电压：1.5kv；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：500℃；锥孔气流量(氮气)：50L/h；脱溶剂气流量(氮气)：1000L/h；碰撞气流速(氩气)：0.17mL/min。
3种维生素的定量和定性离子对、锥孔电压、碰撞能量等参数见下表，结果见图5。
3种维生素的定性和定量离子对、锥孔电压和碰撞能量
*定量离子对。
四、实验结果
1)标准曲线绘制
线性范围、灵敏度可通过标准添加法进行评测。标准添加法的优势是可避免基质效应，消除离子抑制(或增强)的影响。
取制备好的上清液1mL至10mL容量瓶中，添加10μL含3种分析物的已知浓度标准溶液，加水定容，配制成标准使用液。泛酸(VB5)的线性范围0.5-1000ng/mL，见图6；生物素(VB7)为0.2-10ng/mL，见图7；氰钴胺素(VB12)为0.02-10ng/mL，见图8。
在上述色谱和质谱条件下测定，记录峰面积、绘制峰面积-能读标准曲线。
根据其保留时间对应的子离子峰面积与其浓度进行回归分析，得到线性方程y＝952.51x+1996.2，R2＝0.9993，生物素在0.2-10ng/mL范围类线性良好。
2)检测结果
| 样品名称 | 生物素含量(μg/100g) | 泛酸(μg/100g) | 氰钴胺素(μg/100g) |
| 婴幼儿配方米粉 | 3.0 | 850 | 0.4 |
3)方法的回收率和精密度
提取前加标处理：
称取样品1.0g于50mL离心管中，添加100μL含3种分析物的已知浓度标准溶液(VB5100μg/mL；VB71.0μg/mL；VB121.0μg/mL)，加入10mL水。进行样品前处理(标准溶液中分析物稀释100倍，加标浓度VB5100ng/mL；VB71.0ng/mL；VB121.0ng/mL)。
提取后加标处理：
取上述“配方米粉样品中生物素、泛酸、氰钴胺素的提取”步骤中的上清液100μL至进样瓶，添加10μL含3种分析物的已知浓度标准溶液(VB510μg/mL；VB70.1μg/mL；VB120.1μg/mL)，加水至1mL(标准溶液中分析物稀释10倍，加标浓度VB5100ng/mL；VB71.0ng/mL；VB121.0ng/mL)。
通过比较提取前加标样品峰面积(A前)和提取后加标样品峰面积(A后)得到回收率(扣除了基质效应)。
4)方法的检出限和定量限
根据各定量离子3和10倍信噪比(S/N)对应样品中的浓度得到方法检出限和定量限。结果见下表
| 维生素 | 检出限LOD | 定量限LOQ |
| 泛酸 | 0.005mg/100g | 0.002mg/100g |
| 生物素 | 2μg/100g | 0.6μg/100g |
| 氰钴胺素 | 0.2μg/100g | 0.06μg/100g |
实施例7
超高效液相色谱-串联质谱法同时测定奶粉中生物素、泛酸和氰钴胺素
一、实验仪器、设备与试剂同实施例3；试验材料婴幼儿营养面条。
二、实验设计如下：
1)在本实施例中，用生物素、泛酸、氰钴胺素标准品确定最佳的色谱条件和质谱条件。
2)在本实施例中，并确定最佳的样品前处理方法。
3)用已经确定的方法测定待测样品，确定其中是否含有生物素、泛酸、氰钴胺素三种维生素。
4)往待测样品中添加生物素、泛酸、氰钴胺素标准品，测定方法的回收率、精密度、以及最低检出限。
三、试验方法如下：
1)婴幼儿营养面条样品中生物素、泛酸、氰钴胺素的提取
称取样品2.0g于50mL离心管中，加入20mL乙酸铵缓冲溶液。涡旋振荡1min，超声10min。取1mL上清液加入10mL三氯甲烷，涡旋振荡1min，10000r/min离心10min。上清液用超纯水适当稀释，经0.22μmGHP(亲水性聚丙烯)滤膜过滤后上机测定。
2)色谱与质谱条件
所用仪器为Acquity＠ UPLC-Xevo TQ型超高效液相色谱-串联质谱联用仪。
液相条件：
色谱柱：Waters Acquity HSS T3柱(1.0mm×100mm，1.8μm)；流速：0.2mL/min；柱温：40℃；样品温度：15℃；进样量：10μL；流动相A：10mmol/L乙酸铵缓冲液(含0.1％甲酸)；流动相B：乙腈。
质谱条件：正离子方式，电喷雾源(ESI)；多反应监测模式(MRM)；毛细管电压：1.5kv；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：500℃；锥孔气流量(氮气)：50L/h；脱溶剂气流量(氮气)：1000L/h；碰撞气流速(氩气)：0.17mL/min。
3种维生素的定量和定性离子对、锥孔电压、碰撞能量等参数见下表，结果见图5。
3种维生素的定性和定量离子对、锥孔电压和碰撞能量
*定量离子对。
四、实验结果
1)标准曲线绘制
线性范围、灵敏度可通过标准添加法进行评测。标准添加法的优势是可避免基质效应，消除离子抑制(或增强)的影响。
取制备好的上清液1mL至10mL容量瓶中，添加10μL含3种分析物的已知浓度标准溶液，加水定容，配制成标准使用液。泛酸(VB5)的线性范围0.5-1000ng/mL，见图6；生物素(VB7)为0.2-10ng/mL，见图7；氰钴胺素(VB12)为0.02-10ng/mL，见图8。
在上述色谱和质谱条件下测定，记录峰面积、绘制峰面积-能读标准曲线。
根据其保留时间对应的子离子峰面积与其浓度进行回归分析，得到线性方程y＝952.51x+1996.2，R2＝0.9993，生物素在0.2-10ng/mL范围类线性良好。
2)检测结果
| 样品名称 | 生物素含量(μg/100g) | 泛酸(μg/100g) | 氰钴胺素(μg/100g) |
| 婴幼儿营养面条 | 2.4 | 360 | 0.38 |
3)方法的回收率和精密度
提取前加标处理：
称取样品1.0g于50mL离心管中，添加100μL含3种分析物的已知浓度标准溶液(VB5100μg/mL；VB71.0μg/mL；VB121.0μg/mL)，加入10mL水。进行样品前处理(标准溶液中分析物稀释100倍，加标浓度VB5100ng/mL；VB71.0ng/mL；VB121.0ng/mL)。
提取后加标处理：
取上述“婴幼儿营养面条中生物素、泛酸、氰钴胺素的提取”步骤中的上清液100μL至进样瓶，添加10μL含3种分析物的已知浓度标准溶液(VB510μg/mL；VB70.1μg/mL；VB120.1μg/mL)，加水至1mL(标准溶液中分析物稀释10倍，加标浓度VB5100ng/mL；VB71.0ng/mL；VB121.0ng/mL)。
通过比较提取前加标样品峰面积(A前)和提取后加标样品峰面积(A后)得到回收率(扣除了基质效应)。
4)方法的检出限和定量限
根据各定量离子3和10倍信噪比(S/N)对应样品中的浓度得到方法检出限和定量限。结果见下表
| 维生素 | 检出限LOD | 定量限LOQ |
| 泛酸 | 0.005mg/100g | 0.002mg/100g |
| 生物素 | 2μg/100g | 0.6μg/100g |
| 氰钴胺素 | 0.2μg/100g | 0.06μg/100g |
实施例8
超高效液相色谱-同位素稀释质谱法(UPLC-IDMS)测定配方奶粉中的生物素含量
1材料与方法
1.1仪器与试剂
配方奶粉样品(样品A～E、a～e)，购自当地超市。
生物素标准品(Biotin，纯度≥98.0％)，美国Supelco公司；生物素-D2标准品(Biotin-D2，纯度≥99.5％)，美国IsoSciences公司；乙酸铵、甲酸(均为色谱纯)，美国Sigma公司；乙腈(色谱纯)，美国Fisher公司；硫酸、盐酸(均为分析纯)，北京化学试剂厂；实验用水为超纯水。
Acquity＠ UPLC-Xevo TQ型超高效液相色谱-串联质谱联用仪，美国Waters公司；分析天平，德国Sartorius公司。
1.2标准储备液配制
生物素标准储备溶液(100μg/mL)：精确称取生物素1.0mg，用50％甲醇水溶液溶解至10mL，摇匀，密封、避光保存。
生物素-D2标准储备溶液(100μg/mL)：称取生物素-D21.0mg，用50％甲醇水溶液溶解至10mL，摇匀，密封、避光保存。
临用前根据需要用水稀释成不同浓度的标准溶液。
1.3样品处理条件的优化
选取奶粉样品分别经0.5mol/L硫酸、1.0mol/L盐酸溶解后在121℃，1MPa条件下水解30min；以及奶粉样品水溶解后超声10min作为样品提取方法，考察不同提取方法的提取效果。并通过实验比较三氯甲烷、调pH、乙腈和高氯酸去除蛋白质的效果。
确定样品处理方法后称取奶粉样品7g(精确至0.0001g)于50mL锥形瓶中，加入与样品中生物素含量相近的生物素-D2标准储备液；瓶中加入30mL温水振摇溶解后，超声提取10min。冷却至室温，用5mol/L硫酸溶液调pH值到1.7，再用10mol/L氢氧化钠溶液调pH值到4.6，溶液转移到100mL容量瓶中，用水冲洗3次，合并溶液于容量瓶中，定容混匀后过滤，滤液过0.2μm GHP滤膜，待上机分析。
1.4仪器条件
1.4.1色谱条件优化
色谱柱：实验比较BEH C18柱(100mm×2.1mm，1.7μm)和Waters Acquity＠ HSS T3柱(2.1mm×100mm，1.8μm)分离效果的差异；流速：0.4mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；流动相A：含0.1％甲酸的10mmol/L乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈。梯度洗脱，洗脱条件见表8-1。
表8-1 流动相梯度洗脱条件
| 时间/min | 流动相A/％ | 流动相B/％ |
| 0.0 | 99 | 1 |
| 1.0 | 99 | 1 |
| 3.0 | 85 | 15 |
| 4.5 | 85 | 15 |
| 5.0 | 1 | 99 |
| 6.0 | 1 | 99 |
| 6.1 | 99 | 1 |
| 7.0 | 99 | 1 |
1.4.2质谱条件优化
离子源：电喷雾离子源正离子模式(ESI+)；扫描方式：多反应检测(MRM)；毛细管电压：3000V；离子源温度：150℃；去溶剂气温度：500℃；去溶剂气流速(氮气)：1000L/h；碰撞气流速(氩气)：0.18mL/min。
在电喷雾源正离子检测(ESI+)方式下，生物素的准分子离子峰为[M+H]+峰。配制0.5μg/mL的生物素标准溶液，调节各个参数得到响应较强的[M+H]+母离子峰。然后对母离子进行子离子扫描，调节碰撞能量，选择响应较高的两个子离子作为定性定量离子。两个离子中响应高的作为定量离子，另一个作为定性离子。优化确定适合本实验条件的质谱条件。
1.5方法学实验
1.5.1线性范围
准确吸取生物素标准储备溶液，添加与试样中生物素含量相近的生物素同位素内标溶液，用水配制成质量浓度为1、5、10、20、30、40、50ng/mL的生物素标准溶液进行进样分析，确定生物素的线性范围。
1.5.2检出限与定量限
选择木薯淀粉作为空白样品(经测定不含生物素)，对其进行不同水平的加标实验，按1.3节优化好的处理方法对样品进行前处理后，以R(S/N)≥3和R(S/N)≥10作为生物素的检出限和定量限。
1.5.3精密度与回收率
向已知生物素含量的奶粉样品中分别添加三个不同质量浓度的标准溶液进行回收率试验，各个添加水平平行测定6次，计算加标回收率和相对标准偏差，考察方法的精密度与回收率。
1.5.4与微生物方法比对
选取5种市购的配方奶粉(样品A～E)，每种样品平均分成两份，一份采用微生物法测定其中的生物素含量，另一份采用UPLC-IDMS测定其中的生物素含量，每份平行测定6次，计算奶粉中生物素含量，通过两种方法结果的比较验证UPLC-IDMS方法的可行性与准确性。
2结果与分析
2.1样品前处理条件优化
不同提取方法的提取效果见表8-2。结果显示，3种方法最终测定值并无显著差异，都可以获得较好的结果。但用水超声提取处理样品后，仪器峰面积响应值要比另外2种方法高出很多，这可能是由于酸对生物素及其内标的离子抑制作用而导致了仪器响应值的显著降低。考虑到分析的准确性，优选使用水超声处理作为样品的提取方法。
表8-2 不同前处理方法结果
| 前处理方法 | 生物素含量(μg/100g) | 仪器峰面积响应值 |
| 0.5mol/L硫酸水解提取生物素 | 14.1 | 1493 |
| 1.0mol/L盐酸水解提取生物素 | 13.9 | 1358 |
| 水超声提取生物素 | 14.4 | 3944 |
配方奶粉中含有大量的蛋白质存在降低生物素的离子化效率风险，从而影响分析的准确性，并缩短色谱柱的使用寿命。实验通过比较三氯甲烷、调pH、乙腈和高氯酸去除蛋白质的效果，结果发现三氯甲烷、调pH以及高氯酸法沉淀蛋白效果较好，可以获得较为澄清的溶液，回收率均为90％以上。但考虑到色谱柱适合的pH范围以及不同样品在水中的pH差异会影响生物素在色谱柱上的保留时间，因此优选调pH法作为去除蛋白质的方法。
2.2色谱条件优化
C18柱的保留时间比T3柱提前，见图9；两种柱子对生物素都有良好的分离效果，但T3柱的响应值(6.28×106)要好于C18柱(3.24×106)的响应值，因此优选T3柱。
2.3质谱条件优化
质谱条件优化后确定的生物素定性和定量离子对分别为m/z 245.1＞97.0和m/z 245.1＞227.0，生物素-D2的定性和定量离子对分别为m/z 247.1＞99.0和m/z 247.1＞229.0。生物素及其同位素的母离子、定量定性离子、锥孔电压、碰撞能量等参数见表8-3。生物素及其同位素-D2的MRM色谱图见图10，子离子扫描图见图11和图12。
表8-3 生物素及其同位素内标的质谱参数
*定量离子。
2.4方法学验证
2.4.1线性范围
以生物素与生物素内标峰面积比(A生物素/A生物素-D2)和同位素质量浓度的乘积为纵坐标，生物素浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果如图4所示。生物素在1-50ng/mL范围内，线性回归方程为Y＝1.82697X+0.0490756，相关系数r大于0.9998，线性关系良好，十分适合做定量分析。
2.4.2检出限与定量限
以R(S/N)＝3作为检出限，R(S/N)＝10作为定量限，得到方法的检出限为0.4ng/mL，定量限为1.0ng/mL。当奶粉质量为7g，定容体积为100mL时，折算成奶粉质量分数分别为0.6μg/100g和1.5μg/100g。
2.4.3精密度与回收率
向奶粉样品中分别添加三个不同质量浓度的标准溶液进行回收率试验，各个水平平行测定6次，计算加标回收率和相对标准偏差，结果见表8-4。生物素三个水平的加标回收率在89.6％～93.1％，相对标准偏差在1.71％～4.33％，表明该方法比较准确，适用于奶粉中生物素的定性定量分析。
表8-4 生物素加标回收试验结果
2.4.4与微生物方法的比对
微生物法是我国测定婴幼儿食品和乳品中生物素的国标分析方法。实验比较了UPLC-IDMS法与微生物法之间的差异来验证所建立方法的准确性。对5种配方奶粉样品同时做了两种方法的比对试验，检测结果见表8-5。利用SPSS软件对实验结果做非参数Mann-Whitney秩和检验，分析两种方法测定结果之间差异是否显著：得出P＝0.705(>0.05)，表明两种方法测定结果无显著差异，证明了实验建立的方法可以用于配方奶粉中生物素的检测。
表8-5 微生物法和UPLC-IDMS法对照试验
| 样品序号 | 微生物法(μg/100g) | UPLC-IDMS法(μg/100g) |
| A | 16.7 | 17.1 |
| B | 31.0 | 33.8 |
| C | 17.4 | 16.2 |
| D | 21.7 | 21.3 |
| E | 16.7 | 16.0 |
2.5实际样品测定
利用所建立的方法对市售的5种配方奶粉(样品a～e)进行测定，每个样品平行测定3次，计算平均值，结果见表8-6。可以看出，5种配方奶粉中生物素含量均大于8μg/100g的，符合国家标准。
表8-6 配方奶粉中生物素UPLC-IDMS测定结果
| 样品序号 | UPLC-IDMS法(μg/100g) |
| a | 17.1 |
| b | 34.5 |
| c | 16.5 |
| d | 19.1 |
| e | 16.4 |
3结论
本发明建立了一种可以快速检测配方奶粉中的生物素含量的方法。奶粉中生物素含量较低且基质复杂，通过加入同位素内标可消除实验过程中基质效应的影响和处理过程生物素损失带来的偏差，同时利用质谱的高选择性，简化了实验步骤，获得了稳定良好的测定结果。该方法操作过程简单，分析周期短，灵敏度高，重复性好，适合奶粉中生物素的分析研究，必将受到广泛的重视。
Claims (10)
1.一种超高效液相色谱-串联质谱法检测食品中生物素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备供试样品
称取样品，加入水溶解或者乙酸铵缓冲液(5-10mmol/L)溶解，涡旋振荡后超声提取1-3次；提取液加入高氯酸或三氯甲烷涡旋振荡后，离心；上清液用超纯水稀释，经微滤膜过滤后即为供试样品；
2)超高效液相色谱测定
将步骤1)的供试样品进行超高效液相色谱串联质谱测定，色谱条件为：
色谱柱：Waters Acquity HSS T3柱(1.0mm×100mm,1.8μm)或BEH C18柱(100mm×2.1mm,1.7μm)；
流速：0.2-0.4mL/min；
柱温：30-40℃；(优选40℃)；
样品温度：10-15℃(优选15℃)；
进样量：10μL；
流动相A：5-10mmol/L乙酸铵缓冲液(含0.1％甲酸)；(优选10mmol/L)；
流动相B：乙腈；
梯度洗脱；
流动相梯度洗脱条件
3)质谱测定
离子源：电喷雾离子源正离子模式(ESI+)；
监测方式：多反应检测(MRM)；
毛细管电压：1.5-2.3kv；(优选1.5kv)
离子源温度：150℃；
脱溶剂气温度：500℃；
锥孔气流量(氮气)：50L/h；
脱溶剂气流量(氮气)：700-1000L/h；优选1000L/h；
碰撞气流速(氩气)：0.17mL/min；
母离子m/z＝245.1，子离子m/z＝227和97，锥孔电压20-30v(优选22v)，碰撞能量分别为10-20ev(优选14ev)和30-40ev(优选30ev)；
4)计算结果
通过调整y轴截距(X＝x+b/a)，由线性方程y＝ax+b得到校正方程y＝aX，y代表峰面积，X代表样品中分析物的浓度；取样品经样品前处理后上机测试，得到峰面积，并根据校正方程和稀释倍数计算出样品中分析物的浓度，平行测定6次(n＝6)，可以得到测定结果。
2.根据权利要求1所述的超高效液相色谱-串联质谱法检测食品中生物素含量的方法，其特征在于，所述方法还包括标准工作液的配制：即精确称取生物素标准品适量(精确至0.01mg)用水溶解，配制成100μg/mL的储备液，冷藏避光保存；临用时，用水稀释成标准系列浓度溶液，经微滤膜(如0.22μm GHP滤膜)过滤，进行UPLC-MS-MS分析检测。
3.根据权利要求1或2所述的超高效液相色谱-串联质谱法检测食品中生物素含量的方法，其特征在于，步骤1)所述的制备供试样品为称取样品0.1-1.0g于50mL离心管中，按照1:5-1:20(优选1:10)的比例(样品重量与水或乙酸铵缓冲液体积之比)加入水或5-10mmol/L乙酸铵缓冲液(优选10mmol/L)溶解，涡旋振荡1-3min(优选1min)，超声5-20min(优选10min)；提取液按照1:5-20(优选1:10)的体积比加入高氯酸或三氯甲烷，涡旋振荡1-3min(优选1min)，离心(10000r/min离心10min)；上清液用超纯水适当稀释，经0.22μm GHP(亲水性聚丙烯)滤膜过滤后即为供试样品。
4.一种超高效液相色谱-串联质谱法同时检测食品中生物素、泛酸、氰钴胺素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备供试样品
称取样品，加入水溶解或者乙酸铵缓冲液液(2-15mmol/L)溶解，涡旋振荡后超声提取1-3次；提取液加入高氯酸或三氯甲烷涡旋振荡后，离心；上清液用超纯水稀释，经微滤膜过滤后即为供试样品；
2)超高效液相色谱测定
将步骤1)的供试样品进行超高效液相色谱串联质谱测定，色谱条件为：
色谱柱：Waters Acquity HSS T3柱(1.0mm×100mm,1.8μm)或BEH C18柱(100mm×2.1mm,1.7μm)；
流速：0.2-0.4mL/min；
柱温：30-40℃；(优选40℃)；
样品温度：10-15℃(优选15℃)；
进样量：10μL；
流动相A：5-10mmol/L乙酸铵缓冲液(含0.1％甲酸)；(优选10mmol/L)；
流动相B：乙腈；
梯度洗脱：
流动相梯度洗脱条件
3)质谱测定
离子源：电喷雾离子源正离子模式(ESI+)；
监测方式：多反应检测(MRM)；
毛细管电压：1.5-2.3kv；(优选1.5kv)
离子源温度：150℃；
脱溶剂气温度：500℃；
锥孔气流量(氮气)：50L/h；
脱溶剂气流量(氮气)：700-1000L/h；优选1000L/h；
碰撞气流速(氩气)：0.17mL/min；
3种维生素的定量和定性离子对、锥孔电压、碰撞能量等参数见下表：
3 种维生素的定性和定量离子对、锥孔电压和碰撞能量
*定量离子对；
4)计算结果
通过调整y轴截距(X＝x+b/a)，由线性方程y＝ax+b得到校正方程y＝aX，y代表峰面积，X代表样品中分析物的浓度；取样品按照经样品前处理后上机测试，得到峰面积，并根据校正方程和稀释倍数计算出样品中分析物的浓度，平行测定6次(n＝6)，可以得到测定结果。
5.根据权利要求4所述的超高效液相色谱-串联质谱法同时检测食品中生物素、泛酸、氰钴胺素含量的方法，其特征在于，所述方法还包括混合标准工作液的配制：即精确称取生物素、泛酸钙、氰钴胺素标准品适量(精确至0.01mg)用水溶解，配制成100μg/mL的储备液，冷藏避光保存；临用时，用水稀释成标准系列浓度溶液，经微滤膜(如0.22μm GHP滤膜)过滤，进行UPLC-MS-MS分析检测。
6.根据权利要求4或5所述的超高效液相色谱-串联质谱法同时检测食品中生物素、泛酸、氰钴胺素含量的方法，其特征在于，步骤1)所述制备供试样品为称取样品0.1-1.0g于50mL离心管中，按照1:5-20(优选1:10)的比例(样品重量与水或乙酸铵缓冲液体积之比)加入水或5-10mmol/L乙酸铵缓冲液(优选10mmol/L)溶解，涡旋振荡1-3min(优选1min)，超声5-20min(优选10min)；提取液按照1:5-15(优选1:10)的体积比加入高氯酸或三氯甲烷，涡旋振荡1-3min(优选1min)，离心(10000r/min离心10min)；上清液用超纯水适当稀释，经0.22μm GHP(亲水性聚丙烯)滤膜过滤后即为供试样品。
7.一种超高效液相色谱-同位素稀释质谱法测定食品中的生物素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备供试样品
称取样品，加入0.5mol/L硫酸或1.0mol/L盐酸溶解后在121℃，1MPa条件下水解30min；或加入水溶解后超声10min；提取液加入高氯酸或三氯甲烷后涡旋振荡，离心；
上清液用超纯水稀释，经微滤膜过滤后即为供试样品；
2)超高效液相色谱测定
将步骤1)的供试样品进行超高效液相色谱测定，色谱条件为：
色谱柱：BEH C18柱(100mm×2.1mm，1.7μm)或优选Waters Acquity＠HSS T3柱(2.1mm×100mm，1.8μm)；
流速：0.2-0.4mL/min；
柱温：30-40℃；(优选40℃)；
样品温度：10-15℃(优选15℃)；
进样量：10μL；
流动相A：5-10mmol/L乙酸铵缓冲液(含0.1％甲酸)；(优选10mmol/L)；
流动相B：乙腈；
梯度洗脱，洗脱条件见下表
流动相梯度洗脱条件
3)质谱测定
离子源：电喷雾离子源正离子模式(ESI+)；
监测方式：多反应检测(MRM)；
毛细管电压：1.5-3.0kv；(优选3.0kv)
离子源温度：150℃；
脱溶剂气温度：500℃；
锥孔气流量(氮气)：50L/h；
脱溶剂气流量(氮气)：700-1000L/h；优选1000L/h；
碰撞气流速(氩气)：0.18mL/min；
生物素定性和定量离子对分别为m/z 245.1＞97.0和m/z 245.1＞227.0，生物素-D2的定性和定量离子对分别为m/z 247.1＞99.0和m/z 247.1＞229.0；生物素及其同位素的母离子、定量定性离子、锥孔电压、碰撞能量等参数见下表；
生物素及其同位素内标的质谱参数
*定量离子；
4)计算结果
通过调整y轴截距(X＝x+b/a)，由线性方程y＝ax+b得到校正方程y＝aX(y代表峰面积，X代表样品中分析物的浓度)；取样品经样品前处理后上机测试，得到峰面积，并根据校正方程和稀释倍数计算出样品中分析物的浓度，平行测定6次(n＝6)，可以得到测定结果。
8.根据权利要求7所述的超高效液相色谱-同位素稀释质谱法测定食品中的生物素含量的方法，其特征在于，所述方法还包括标准储备液的制备。
9.根据权利要求7或8所述的超高效液相色谱-同位素稀释质谱法测定食品中的生物素含量的方法，其特征在于，步骤1)所述制备供试样品为称取样品5g(精确至0.0001g)于50mL锥形瓶中，加入与样品中生物素含量相近的生物素-D2标准储备液；瓶中加入30mL温水振摇溶解后，超声提取10min。冷却至室温，提取液用5mol/L硫酸溶液或1.0mol/L盐酸溶液调pH值到1.7，再用10mol/L氢氧化钠溶液调pH值到4.6，溶液转移到100mL容量瓶中，用水冲洗3次，合并溶液于容量瓶中，定容混匀后过滤，滤液过0.2μm GHP滤膜，待上机分析。
10.根据权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于，所述食品为块状或粉状或流质类食品，如奶粉、配方奶粉(牛奶粉、羊奶粉)、米粉、配方米粉、面条、营养面条、果泥，保健食品等。
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|---|---|
| CN (1) | CN104614479B (zh) |
Cited By (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104914192A (zh) * | 2015-06-30 | 2015-09-16 | 华润紫竹药业有限公司 | 多种维生素片的分析方法 |
| CN106153773A (zh) * | 2016-08-22 | 2016-11-23 | 河北三元食品有限公司 | 利用超高效液相色谱串联质谱快速定量测定婴幼儿配方奶粉中l‑肉碱的方法 |
| CN106383191A (zh) * | 2016-08-23 | 2017-02-08 | 国家烟草质量监督检验中心 | 一种尿液中d‑泛酸含量的液相色谱串联质谱测定方法 |
| CN106680389A (zh) * | 2016-12-15 | 2017-05-17 | 天津量信检验认证技术有限公司 | 快速分离测定婴幼儿食品和乳品中水溶性b族维生素的方法 |
| CN107860847A (zh) * | 2017-11-14 | 2018-03-30 | 济南维瑞医药科技开发有限公司 | 一种检测多种维生素制剂中维生素b12有关物质的方法 |
| CN108195956A (zh) * | 2017-12-15 | 2018-06-22 | 广州中生生物技术有限公司 | 食品中维生素e含量的测定方法 |
| CN108387672A (zh) * | 2018-02-01 | 2018-08-10 | 山东省食品药品检验研究院 | 一种液体乳中爱德万甜含量的超高效液相色谱串联质谱检测方法 |
| CN109580928A (zh) * | 2017-09-28 | 2019-04-05 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 原料奶三种快速前处理方法 |
| CN109828058A (zh) * | 2019-03-29 | 2019-05-31 | 新疆维吾尔自治区分析测试研究院 | 基于液相色谱-串联质谱法测定多种脂溶性维生素的方法 |
| CN110426471A (zh) * | 2019-08-02 | 2019-11-08 | 山东省食品药品检验研究院 | 一种婴幼儿食品中生物素含量的测定方法 |
| CN112697911A (zh) * | 2020-12-15 | 2021-04-23 | 普研（上海）标准技术服务股份有限公司 | 测定婴幼儿食品和乳品中维生素b12添加量的液相色谱法 |
| CN113138238A (zh) * | 2021-04-15 | 2021-07-20 | 河南省纳普生物技术有限公司 | 一种亚麻荠种子中8种黄酮及酚酸类成分含量的检测方法 |
| CN114216982A (zh) * | 2021-12-14 | 2022-03-22 | 黑龙江飞鹤乳业有限公司 | 维生素b12的检测方法 |
| CN114280177A (zh) * | 2021-12-15 | 2022-04-05 | 上海市徐汇区中心医院 | 一种脂溶性维生素a、d、e的检测方法 |
| CN114441681A (zh) * | 2022-01-28 | 2022-05-06 | 山东省食品药品检验研究院 | 一种测定特殊医学配方食品中20种游离氨基酸和l-羟脯氨酸的方法 |
| CN114487197A (zh) * | 2022-01-27 | 2022-05-13 | 河南省商业科学研究所有限责任公司 | 一种检测食品中花生衣红素含量的方法及其应用 |
| CN115078585A (zh) * | 2022-06-27 | 2022-09-20 | 辰欣药业股份有限公司 | 一种特殊医学用途全营养配方食品中泛酸含量的测定方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101504393A (zh) * | 2008-11-14 | 2009-08-12 | 浙江医药股份有限公司新昌制药厂 | d-生物素及其杂质含量的HPLC测定方法 |
| CN102539616A (zh) * | 2012-02-14 | 2012-07-04 | 山东师范大学 | 一种燕窝生物素的提取及检测方法 |
-
2015
- 2015-01-30 CN CN201510052317.4A patent/CN104614479B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101504393A (zh) * | 2008-11-14 | 2009-08-12 | 浙江医药股份有限公司新昌制药厂 | d-生物素及其杂质含量的HPLC测定方法 |
| CN102539616A (zh) * | 2012-02-14 | 2012-07-04 | 山东师范大学 | 一种燕窝生物素的提取及检测方法 |
Non-Patent Citations (7)
Cited By (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104914192A (zh) * | 2015-06-30 | 2015-09-16 | 华润紫竹药业有限公司 | 多种维生素片的分析方法 |
| CN106153773A (zh) * | 2016-08-22 | 2016-11-23 | 河北三元食品有限公司 | 利用超高效液相色谱串联质谱快速定量测定婴幼儿配方奶粉中l‑肉碱的方法 |
| CN106383191A (zh) * | 2016-08-23 | 2017-02-08 | 国家烟草质量监督检验中心 | 一种尿液中d‑泛酸含量的液相色谱串联质谱测定方法 |
| CN106680389A (zh) * | 2016-12-15 | 2017-05-17 | 天津量信检验认证技术有限公司 | 快速分离测定婴幼儿食品和乳品中水溶性b族维生素的方法 |
| CN109580928A (zh) * | 2017-09-28 | 2019-04-05 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 原料奶三种快速前处理方法 |
| CN107860847A (zh) * | 2017-11-14 | 2018-03-30 | 济南维瑞医药科技开发有限公司 | 一种检测多种维生素制剂中维生素b12有关物质的方法 |
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