CN110426471A - 一种婴幼儿食品中生物素含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种婴幼儿食品中生物素含量的测定方法，本发明基于超高效液相色谱‑同位素稀释质谱法，对于婴幼儿配方乳粉和婴幼儿谷类辅助食品中生物素的不同提取和净化方法进行比较，建立了生物素含量的分析测定方法。方法分析周期短、灵敏度和准确度高，适合婴幼儿配方乳粉和谷类辅助食品中生物素含量的测定。本发明对于生产企业监控生物素强化剂量、正确标示含量水平具有重要意义，也可为政府监管提供有力的技术支持。

Description

一种婴幼儿食品中生物素含量的测定方法

技术领域

本发明涉及食品检测技术领域，尤其涉及一种婴幼儿食品中生物素含量的测定方法。

背景技术

生物素(biotin)又称维生素B₇，维生素H，化学结构中包括一个羧基侧链(含5个碳原子)和两个五元杂环，是一种双环化合物。在体内由侧链上的羧基与酶蛋白的赖氨酸残基ε-NH2结合，发挥辅酶作用。生物素参与蛋白质、脂肪和糖类的代谢是维持人体正常机能与代谢活动不可或缺的B族水溶性维生素之一。生物素可能有8种不同的异构体，但只有D-生物素具有生物活性，而且GB 14880-2012《食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》中也规定了生物素的添加形式为D-生物素。

文献报道人体肠道微生物可以合成一些生物素，所以成年人体内极少缺乏生物素。但由于婴幼儿肠道功能较弱无法合成，且婴幼儿饮食种类单一，所以易导致生物素缺乏。婴儿若缺乏生物素会造成严重的神经症状，出现躁狂、嗜睡、发育迟缓，以及舌炎和皮炎等症状，因此需在婴幼儿食品中强化生物素。食品安全国家标准GB 10765-2010、GB10767-2010和GB 10769-2010中对生物素的添加量作了明确的规定，因此生物素也成为婴幼儿配方乳粉和婴幼儿谷类辅助食品中的必检项目。所以准确测定婴幼儿食品中生物素含量对于生产企业控制生物素强化剂量和政府监管提供有力的技术支撑。

生物素的测定方法很多，主要包括微生物法、酶联免疫法、分光光度法、荧光分光光度法、荧光免疫层析法、生物传感器法、毛细管电泳法、液相色谱法、液相色谱质谱联用法等。其中，酶联免疫法专一性强，但试剂价格昂贵。生物传感器法重现性差；分光光度法灵敏度低。荧光法可靠性存在缺陷。毛细管电泳法样品的微量制备和电渗的控制存在困难。微生物法是国标GB 5009.259-2016的分析方法，这种方法虽然灵敏度较高，但是此法具有检测周期长、实验条件要求高，样本间平行性不好、菌种保存困难、重复性差、操作复杂等缺点，难以广泛使用。高效液相色谱法的限制在于生物素没有典型的紫由于生物素无典型的紫外和荧光发色团，灵敏度较低，对于一些生物素含量比较低且基质干扰较大的样品无法测定，而且单纯的紫外检测器或荧光检测器定性效果不理想。超高效液相色谱-质谱联用法具有灵敏性高、选择性好、分析速度快、灵敏度和准确度高等优点，更适合于低含量且基质复杂样品的测定。

婴幼儿配方乳粉的主要原料是乳类及乳蛋白制品，婴幼儿谷类辅助食品是一种或多种谷物(如小麦、大米、大麦、燕麦、黑麦、玉米等)为主要原料，二者基质差异较大，所添加生物素含量均很低。婴幼儿配方乳粉含有大量的蛋白质、脂肪和磷脂，传统的前处理过程难以除去磷脂，基质干扰较大，影响了分析结果的准确性。婴幼儿谷类辅助食品中谷物中含有的生物素主要以与蛋白质相结合的形式存在，文献中报道的普通婴幼儿配方乳粉中生物素的测定方法对其提取效率偏低，而且生物素含量与婴幼儿配方乳粉相比更低，基质影响更明显，难以对其生物素含量进行准确测定。

发明内容

本发明提供了一种婴幼儿食品中生物素含量的测定方法，以解决婴幼儿食品中生物素含量低，基质复杂，难以准确测定的问题。

本发明提供的一种婴幼儿食品中生物素含量的测定方法，婴幼儿食品包括婴幼儿配方乳粉和婴幼儿谷类辅助食品，包括以下步骤：

(1)分别以生物素标准品和生物素同位素标准品配制生物素标准储备液和生物素同位素标准储备液；用甲醇水溶液分别对生物素标准储备液和生物素同位素标准储备液稀释，得到生物素标准中间液和生物素同位素标准中间液。

(2)分别取不同体积的生物素标准中间液，各加入相同体积的生物素同位素标准中间液，以初始流动相定容，得到标准系列工作液。

(3)称取一定质量的婴幼儿食品样品，加入生物素同位素标准中间液后，经等电点沉淀或高温水解水解，经滤纸过滤，得到样品提取液。

(4)将固相萃取柱连接到固相萃取装置上，取样品提取液，加入乙酸溶液，涡旋混匀后上样，先用水和甲醇溶液淋洗，再用乙腈-甲醇洗脱，收集全部洗脱液，氮吹至近干，用初始流动相复溶，经有机相微孔滤膜过滤后，得到样品待测液。

(5)分别吸取标准系列工作液注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得标准系列工作液的色谱图；根据标准系列工作液的色谱图中，生物素色谱峰峰面积与生物素同位素色谱峰峰面积的比值以及生物素浓度，建立生物素标准曲线。

(6)吸取样品待测液注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得样品色谱图；将样品色谱图中生物素色谱峰峰面积与生物素同位素色谱峰峰面积的比值，代入生物素标准曲线中，得到婴幼儿食品样品中生物素含量。

优选地，超高效液相色谱质谱联用仪的色谱条件如下：色谱柱：C18液相色谱柱，其柱长100mm，柱内径2.1mm，填料粒度1.7μm；柱温：40℃；进样量：5μL；流动相：0.1％甲酸溶液和乙腈；流速：0.3mL/min。

优选地，超高效液相色谱质谱联用仪的质谱条件如下：离子源：电喷雾离子源；离子化模式：正离子模式；毛细管电压：3.0kV；锥孔电压：30V；脱溶剂气温度450℃；离子源温度：150℃；脱溶剂气流速：850L/h：锥孔反吹气流速：150L/h；碰撞气流速：0.12mL/min；采集模式：多反应监测。

优选地，步骤(3)中，当婴幼儿食品样品为婴幼儿配方乳粉样品时，称取一定质量的婴幼儿配方乳粉样品于比色管中，加入生物素同位素标准中间液后，加入45℃～50℃的水，置于超声波中超声提取约25min以上，并冷却至室温后，用盐酸溶液调pH至1.7±0.1，放置约2min后，再用氢氧化钠溶液调节pH至4.5±0.1，用水定容，经滤纸过滤后，得到样品提取液。

优选地，步骤(3)中，当婴幼儿食品样品为婴幼儿谷类辅助食品样品时，称取一定质量的婴幼儿谷类辅助食品样品于比色管中，加入生物素同位素标准中间液后，加入0.1mol/L硫酸溶液充分摇匀，在121℃下水解30min，冷却至室温，用1mol/L氢氧化钠溶液调pH至4.5±0.2后，用水定容，经滤纸过滤后，得到样品提取液。

优选地，步骤(4)中，所述固相萃取柱为QASIS PRiME HLB固相萃取柱。

本发明针对婴幼儿食品，包括婴幼儿配方乳粉和婴幼儿谷类辅助食品两种不同基质的样品，建立了液相色谱-串联质谱法测定其中生物素含量的分析方法。本发明具有以下

有益效果：

(1)提高检测效率。GB 5009.259-2016国家标准所采用的微生物分析方法检测周期长，仅接种和培养就需要19h～20h；操作复杂，需要在无菌条件下操作，对实验环境要求苛刻；样本间平行性不好；菌种保存困难等等。本方法具有前处理过程简单、分析周期短，极大的提高了检验效率，适合于婴幼儿配方乳粉和婴幼儿谷类辅助食品中生物素含量的批量化检测。

(2)首次采用固相萃取柱对婴幼儿食品进行净化，有效去除了样品中的脂肪、盐、磷脂等基质干扰物对生物素测定的影响，降低基质效应的影响，提高了分析的准确性；减少了对仪器和色谱柱的污染。

(3)方法的灵敏度高、准确性好、精密度好。适合于婴幼儿配方乳粉和婴幼儿谷类辅助食品中低含量的生物素的测定。

应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为不同提取方式对生物素提取的影响；

图2为样品提取液酸度的影响；

图3为不同样品经固相萃取柱净化和不净化对基质效应的影响；

图4为本发明提供的标准溶液(10ng/mL)的MRM和TIC色谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种婴幼儿食品中生物素含量的测定方法，以解决婴幼儿食品中生物素含量低，基质低，难以准确测定的问题。下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

1仪器、试剂与材料

ACQUITY^TM超高效液相色谱仪和Xevo TQ-S质谱仪配有电喷雾(ESI)电离源和Masslynx^TM色谱工作站美国Waters公司；超声波清洗器宁波新芝生物科技有限公司；MS3涡旋混合器IKA公司；N-EVAP-45位氮吹仪美国Organomation公司；SQP-电子天平塞多利斯科学仪器有限公司；Milli-Q超纯水系统美国Millipore公司；GM-300型粉碎机德国莱驰公司。

D-生物素标准物质，德国Dr.Ehrenstorfer公司；生物素-d2即氘代生物素同位素ISOREAG公司；实验用的婴幼儿食品样品(包括婴幼儿配方乳粉和婴幼儿谷类辅助食品)均购自于当地超市。甲醇、乙腈(色谱纯)美国Fisher公司；甲酸(色谱纯)美国Sigma-Aldrich公司；水为Milli-Q超纯水机制备；氮气(>99.999％)；硫酸、乙酸(优级纯)国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠(分析纯)国药集团化学试剂有限公司。

ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.7μm)美国Waters公司；QASISPRiME HLB固相萃取柱(60mg，3mL)美国Waters公司；有机微孔滤膜(0.22μm)上海安谱科学仪器有限公司。

2标准溶液的配制

D-生物素标准储备液(100μg/mL)：准确称取5mg(精确至0.1mg)生物素标准品于50mL容量瓶中，用甲醇溶液(50％)定容刻度。储存于棕色玻璃瓶中，-20℃密封保存1年。

D-生物素标准中间液(100ng/mL)：取适量1.00mL生物素标准储备液于10mL容量瓶中，用甲醇溶液(50％)稀释并定容至刻度；然后甲醇溶液(50％)逐级稀释到100ng/mL，储存于棕色玻璃瓶中，2℃～4℃保存1个月。

生物素-d2标准储备液(100μg/mL)：准确称取5mg(精确至0.1mg)生物素-D2于50mL容量瓶中，用甲醇溶液(50％)定容刻度。储存于棕色玻璃瓶中，-20℃密封保存1年。

生物素-d2标准中间液(2μg/mL)：吸取2.00mL生物素-d2标准储备液于100mL容量瓶中，用甲醇溶液(50％)稀释并定容至刻度，储存于棕色玻璃瓶中，2℃～4℃保存1个月。

标准系列工作液配制：准确吸取生物素-d2标准中间液75μL、D-生物素标准中间液适量于10mL容量瓶中，以初始流动相配制成质量浓度为0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL的标准系列工作液，现用现配。

3样品制备

粉末状样品经混匀后，直接取样；片状、颗粒状样品，经样本粉碎机磨成粉，储存于样品瓶中避光保存。立即测定或4℃冰箱保存，1周内测定。

4样品前处理

4.1提取

4.1.1婴幼儿配方乳粉提取

若婴幼儿食品样品为婴幼儿配方乳粉样品时，称取1g(精确到0.001g)婴幼儿配方乳粉样品于于50mL比色管中，加入375μL生物素-d2标准中间液，加入约25mL 45℃～50℃的水，置于超声波中超声提取约25min以上，并冷却至室温，用盐酸溶液调pH至1.7±0.1，放置约2min后，再用氢氧化钠溶液调节pH至4.5±0.1，用水定容至50mL，经滤纸过滤后，得到婴幼儿配方乳粉样品提取液。

生物素是一种水溶性维生素，婴幼儿配方乳粉和谷类辅助食品均含有蛋白质，所以在提取目标物的同时需去除蛋白质。对于婴幼儿配方乳粉中水溶性维生素主要有等电点沉淀和酸水解两种方式去除蛋白质。考察了等电点沉淀和0.1mol/L硫酸溶解后在121℃下水解30min的提取效果(表1)。研究发现，两种提取方式，蛋白质沉淀效果都比较好，滤液均一透明，均可顺利通过滤膜。由表1可见，对回收率和精密度的影响没有明显差异；基质效应都在15％以下，影响较小。由于等电点沉淀操作相对简单，而婴幼儿配方乳粉中蛋白质以乳清蛋白(等电点为pH 1.7)和酪蛋白(等电点pH 4.5)为主，所以选择调pH 1.7和pH 4.5沉淀蛋白。

表1不同提取方式对婴幼儿配方乳粉中回收率、精密度和基质效应的影响(n＝6)

4.1.2婴幼儿配方乳粉提取

若婴幼儿食品样品为婴幼儿谷类辅助食品样品时，称取1g(精确到0.001g)粉碎均匀的婴幼儿谷类辅助食品样品于50mL比色管中，加入375μL生物素-d2标准中间液，加入25mL的0.1mol/L硫酸溶液充分摇匀，在121℃下水解30min，冷却至室温，用1mol/L氢氧化钠溶液调pH至4.5±0.2后，用水定容至50mL，经滤纸过滤，得到婴幼儿谷类辅助食品样品提取液。

婴幼儿谷类辅助食品由于配方中主要原料是一种或多种谷物(如：大米、小米、小麦、大麦、燕麦、黑麦、玉米等)，对于这类产品，样品中不但含有蛋白质还有淀粉，考察了不同的酶解、酸水解及其组合模式对婴幼儿谷类辅助食品中生物素的提取效果(图1)。具体考察条件如下：a.样品中加入45℃～50℃的水溶解混匀后，加入0.1g淀粉酶和0.1g木瓜蛋白酶，在55℃下酶解30min后冷却至室温，调节试样溶液的pH至1.7±0.1，放置约1min后，调节pH至4.5±0.1；b.样品用0.1mol/L硫酸溶解后在121℃下水解30min，调节试样溶液的pH至4.5±0.1；c.样品经与b相同的方式水解后，加入1mL蛋白酶-淀粉酶液(分别称取0.2g淀粉酶和0.2g木瓜蛋白酶，加入20mL水混匀)，在36℃±1℃下酶解16h。由图1可见，对于婴幼儿谷类辅助食品，酶解方式生物素的含量(图1，A)和回收率(图1，B)偏低，而硫酸水解和硫酸水解之后再酶解结果无明显差异。综合考虑样品中生物素的提取效率、基质效应和检验周期，实验选择硫酸水解的提取方式。

4.2净化

将QASIS PRiME HLB固相萃取柱连接到固相萃取装置上，取4.1的样品提取液(包括婴幼儿配方乳粉样品提取液和婴幼儿谷类辅助食品样品提取液)1mL滤液于15mL离心管中，加入1mL 3％乙酸溶液，涡旋混匀后上样，然后分别用3mL水和3mL 5％甲醇溶液淋洗，最后用1mL乙腈-甲醇(9:1，V/V)洗脱，45℃氮吹至近干，用1mL初始流动相复溶，经0.22μm有机相微孔滤膜过滤后，得到样品待测液(包括婴幼儿配方乳粉样品待测液和婴幼儿谷类辅助食品样品待测液)。

婴幼儿配方乳粉和谷类辅助食品成分复杂，通常含有大量的蛋白质、脂肪和磷脂。在样品前处理过程中，蛋白质通过水解沉淀被去除，但脂肪和磷脂会随着目标物成分一起被提取出来。这些共提取物会干扰生物素的测定，影响生物素的离子化过程，降低其离子化效率，从而影响分析的准确性；同时还会污染仪器和色谱柱。由于生物素的结构包括两个五元杂环和一个含5个碳原子的羧基侧链，所以适合反相吸附剂的固相萃取柱进行净化。

由于生物素化学结构中含有一个戊酸侧链，其水溶液呈弱酸性pH值约为4.5，所以使用QASIS PRiME HLB固相萃取柱净化时，样品提取液的酸度可能会影响生物素在固相萃取柱上的保留。实验以生物素-d2峰面积响应值为参考，考察了上样前在婴幼儿配方乳粉样品和婴幼儿谷类辅助食品样品提取液中加入1mL 3％乙酸溶液调节酸度和不加1mL 3％乙酸溶液固相萃取柱对生物素保留的影响(图2)。实验表明，加入1mL 3％乙酸溶液后生物素-d2峰面积响应值是没加1mL 3％乙酸溶液的4至8倍，样品提取液的酸度对于固相萃取柱对生物素的保留影响比较大。原因是加入1mL 3％乙酸溶液后，生物素主要以分子状态存在，极性较弱，上样时能很好地保留在固相萃取柱上；没加1mL 3％乙酸溶液时生物素主要以离子状态存在，有较强极性，在固相萃取柱上保留较弱，上样和淋洗过程流失了大部分目标物。所以实验选择上样前加入1mL 3％乙酸溶液增加固相萃取柱对生物素的吸附。

由于婴幼儿配方乳粉主要以乳类及乳蛋白制品为主要原料，而婴幼儿谷类辅助食品主要原料是一种或多种谷物，二者基质差异较大；所以实验以基质效应为参考，考察了使用QASIS PRiME HLB固相萃取柱净化和不使用QASIS PRiME HLB净化对婴幼儿配方乳粉和婴幼儿谷类辅助食品净化效果的影响。由图3可见，对于不同样品，使用QASIS PRiME HLB固相萃取柱净化和不净化对基质效应的影响不同。婴幼儿配方乳粉净化和不净化基质效应影响较大，净化前基质影响较大，净化后基质效应不明显；婴幼儿谷类辅助食品净化后基质效应也明显低于净化前，有效降低了基质效应对生物素含量测定的影响，提高了分析结果的准确性和灵敏度。所以实验选择使用QASIS PRiME HLB净化。

5生物素含量分析

5.1色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(100mm×2.1mm,1.7μm)美国Waters公司；流速：0.3mL/min；流动相：0.1％甲酸溶液(A)和乙腈(B)；柱温：40℃；进样量：5μL。梯度洗脱程序见表2。

表2 HPLC梯度洗脱程序

流动相组成能够影响目标化合物的分离、峰形和离子化效率，在相同的梯度洗脱条件下，分别比较了乙腈-0.1％甲酸、乙腈-10mmol/L甲酸铵(含0.1％甲酸)、乙腈-0.1％乙酸、乙腈-10mmol/L乙酸铵(含0.1％乙酸)、甲醇-0.1％甲酸五种流动相在BEH C18色谱柱上对目标化合物分离情况、灵敏度、峰形的影响。结果表明，有机相为甲醇时生物素峰面积响应值低、杂峰较多且分离不好；当有机相为乙腈时，0.1％甲酸和10mmol/L甲酸铵(含0.1％甲酸)生物素峰面积响应值与0.1％乙酸和10mmol/L乙酸铵(含0.1％乙酸)相比较高，但流动相中添加乙酸铵对色谱峰峰形及灵敏度没有明显促进作用，所以选择乙腈-0.1％甲酸为流动相。

5.2质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)；离子化模式：正离子模式(ESI+)；毛细管电压：3.0kV；锥孔电压：30V；脱溶剂气温度450℃；离子源温度：150℃；脱溶剂气流速：850L/h：锥孔反吹气流速：150L/h；碰撞气流速：0.12mL/min；采集模式：多反应监测(MRM)；生物素的定性离子定量离子对及质谱参数见表3。

表3生物素的质谱参数

注：*为定量离子

5.3生物素含量检测

将配制的标准系列工作液按浓度由低到高依次注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得标准系列工作液的色谱图。根据标准工作液的色谱图中，生物素色谱峰峰面积与生物素同位素色谱峰峰面积的比值以及生物素浓度，建立生物素标准曲线。以生物素质量浓度(X，ng/mL)为横坐标，生物素色谱峰峰面积与生物素同位素色谱峰峰面积即D-生物素与生物素-d2峰面积之比(Y)为纵坐标，绘制标准曲线。结果显示，在0.5～25ng/mL范围内，线性回归方程为Y＝1.04308x+0.0133202，R²＝0.9975，线性关系良好。标准溶液图的MRM和TIC色谱如图4所示。

按本方法样品前处理方法处理后，吸取样品待测液(包括婴幼儿配方乳粉样品待测液和婴幼儿谷类辅助食品样品待测液)注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得样品待测液的色谱图。将样品待测液的色谱图中生物素色谱峰峰面积与生物素同位素色谱峰峰面积的比值，代入生物素标准曲线中，得样品中生物素含量。

应用本方法对市售的标示含有生物素的婴幼儿配方乳粉(10份)和婴幼儿谷类辅助食品(10份)进行分析。结果表明，生物素含量分别为婴幼儿配方乳粉13.2～38.3μg/100g、婴幼儿谷类辅助食品2.5～31.9μg/100g。此方法可用于婴幼儿配方乳粉和谷类辅助食品中生物素含量的检测。

按上述前处理方法处理后，测试其信噪比，分别确定定量限和检出限。以信噪比S/N≥10得到目标物的定量限(LOQ)，以信噪比S/N≥3得到目标物的检出限(LOD)。生物素的LOD为0.75μg/100g，LOQ为2.5μg/100g。方法检出限、定量限均低于国标GB 5009.259-2016所采用的微生物方法。可用于含量较低的样品中生物素定性定量分析。

6基质效应评价

分别测定添加同水平同位素内标的纯溶剂与样品待测液中的峰面积响应值，计算二者的相对比值来评价基质效应(Matrix effect)。Matrix effect factor(MEF,％)＝(A-B)/A×100，其中MEF为基质效应因子，A为纯溶剂中内标物质的峰面积响应值，B为样品待测液中内标物质的峰面积响应值。MEF为0表示无基质效应，绝对值越大基质效应越强，在-15％～15％之间，表示基质效应影响不明显。

在液相色谱串联质谱的应用中基质干扰效应最为常见，液相色谱-串联质谱中的基质效应产生的原因一般认为是由于基质中的非挥发性组分与待测物质，在雾滴表面离子化的过程中产生竞争，影响电喷雾接口处的离子化效率。同位素内标与目标物具有相同的化学性质和保留时间，是液相色谱串联质谱技术中消除基质干扰、提高定量准确度最有效的方法，因此实验采用同位素内标来消除基质干扰实现准确定量。实验发现，婴幼儿配方乳粉和谷类辅助食品中生物素的MEF值都在-15％～15％之间，基质效应影响不明显。

7回收率和精密度

向婴幼儿配方乳粉和婴幼儿谷类辅助食品中分别添加3个不同质量浓度的标准溶液进行回收率实验，各个水平平行测定6次，计算加标回收率和相对标准偏差，结果见表4。该方法的回收率为96.7％～101.4％，相对标准偏差为2.29％～5.40％，可见方法的回收率高，重现性好。对乳粉质控样品NIST SRM 1849a样品进行检测，测定结果为1.90mg/kg，在标定值(1.99±0.13mg/kg)的偏差范围内。

表4方法的回收率和精密度(n＝6)

综上本发明基于超高效液相色谱-同位素稀释质谱法，对于婴幼儿配方乳粉和婴幼儿谷类辅助食品中生物素的不同提取和净化方法进行比较，建立了生物素含量的分析测定方法。样品中的生物素经提取和净化后，C18色谱柱上进行梯度洗脱，通过电喷雾正离子模式电离，多反应检测模式进行检测分析，内标法定量。结果表明，生物素在0.5～25ng/mL范围内线性关系良好，相关系数(R²)为0.9975；加标回收率为96.7％～101.4％，相对标准偏差为2.29％～5.40％。方法检出限(S/N≥3)为0.75μg/100g，定量限(S/N≥10)为2.5μg/100g。方法分析周期短、灵敏度和准确度高，适合婴幼儿配方乳粉和谷类辅助食品中生物素含量的测定。本发明对于生产企业监控生物素强化剂量、正确标示含量水平具有重要意义，也可为政府监管提供有力的技术支持。

以上所述的本发明实施方式并不构成对本发明保护范围的限定。

本领域技术人员在考虑说明书及实践这里发明的公开后，将容易想到本发明的其它实施方案。本发明旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求指出。

Claims (6)

1.一种婴幼儿食品中生物素含量的测定方法，其特征在于，所述婴幼儿食品包括婴幼儿配方乳粉和婴幼儿谷类辅助食品，包括以下步骤：

(1)分别以生物素标准品和生物素同位素标准品配制生物素标准储备液和生物素同位素标准储备液；用甲醇水溶液分别对生物素标准储备液和生物素同位素标准储备液稀释，得到生物素标准中间液和生物素同位素标准中间液；

(2)分别取不同体积的生物素标准中间液，各加入相同体积的生物素同位素标准中间液，以初始流动相定容，得到标准系列工作液；

(3)称取一定质量的婴幼儿食品样品，加入生物素同位素标准中间液后，经等电点沉淀或高温水解，经滤纸过滤，得到样品提取液；

(4)将固相萃取柱连接到固相萃取装置上，取样品提取液，加入乙酸溶液，涡旋混匀后上样，先用水和甲醇溶液淋洗，再用乙腈-甲醇洗脱，收集全部洗脱液，氮吹至近干，用初始流动相复溶，经有机相微孔滤膜过滤后，得到样品待测液；

(5)分别吸取标准系列工作液注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得标准系列工作液的色谱图；根据标准系列工作液的色谱图中，生物素色谱峰峰面积与生物素同位素色谱峰峰面积的比值以及生物素浓度，建立生物素标准曲线；

(6)吸取样品待测液注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得样品色谱图；将样品色谱图中生物素色谱峰峰面积与生物素同位素色谱峰峰面积的比值，代入生物素标准曲线中，得到婴幼儿食品样品中生物素含量。

2.根据权利要求1所述的婴幼儿食品中生物素含量的测定方法，其特征在于，超高效液相色谱质谱联用仪的色谱条件如下：

色谱柱：C18液相色谱柱，其柱长100mm，柱内径2.1mm，填料粒度1.7μm；

柱温：40℃；

进样量：5μL；

流动相：0.1％甲酸溶液和乙腈；

流速：0.3mL/min。

3.根据权利要求1所述的婴幼儿食品中生物素含量的测定方法，其特征在于，超高效液相色谱质谱联用仪的质谱条件如下：

离子源：电喷雾离子源；离子化模式：正离子模式；毛细管电压：3.0kV；锥孔电压：30V；脱溶剂气温度450℃；离子源温度：150℃；脱溶剂气流速：850 L/h：锥孔反吹气流速：150 L/h；碰撞气流速：0.12mL/min；采集模式：多反应监测。

4.根据权利要求1所述的婴幼儿食品中生物素含量的测定方法，其特征在于，步骤(3)中，当婴幼儿食品样品为婴幼儿配方乳粉样品时，称取一定质量的婴幼儿配方乳粉样品于比色管中，加入生物素同位素标准中间液后，加入45℃～50℃的水，置于超声波中超声提取约25min以上，冷却至室温后，用盐酸溶液调pH至1.7±0.1，放置约2min后，再用氢氧化钠溶液调节pH至4.5±0.1，用水定容，经滤纸过滤后，得到样品提取液。

5.根据权利要求1所述的婴幼儿食品中生物素含量的测定方法，其特征在于，步骤(3)中，当婴幼儿食品样品为婴幼儿谷类辅助食品样品时，称取一定质量的婴幼儿谷类辅助食品样品于比色管中，加入生物素同位素标准中间液后，加入0.1mol/L硫酸溶液充分摇匀，在121℃下水解30min，冷却至室温，用1mol/L氢氧化钠溶液调pH至4.5±0.2后，用水定容，经滤纸过滤后，得到样品提取液。

6.根据权利要求1所述的婴幼儿食品中生物素含量的测定方法，其特征在于，步骤(4)中，所述固相萃取柱为QASIS PRiME HLB固相萃取柱。