CN108387672A - 一种液体乳中爱德万甜含量的超高效液相色谱串联质谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种液体乳中爱德万甜含量的超高效液相色谱串联质谱检测方法，属于液体乳分析技术领域。该方法具体包括以下步骤：（1）样品预处理；（2）制备标准工作溶液；（3）配制基质加标溶液；（4）用超高效液相色谱一串联质谱联用仪进行检测分析计算。本发明大大的缩短了分析时间，提高了检测效率；准确度高且稳定；检出限低，线性范围宽，提高了分析灵敏度，建立了检测液体乳中爱德万甜的UPLC电喷雾串联三重四级杆质谱联用的分析方法，填补了国内检测爱德万甜质谱定性定量法的空白，对国内爱德万甜的探索研究具有重要意义。

Description

一种液体乳中爱德万甜含量的超高效液相色谱串联质谱检测 方法

技术领域

本发明涉及一种液体乳中爱德万甜含量的超高效液相色谱串联质谱检测方法，属于液体乳分析技术领域。

背景技术

爱德万甜（Advantame），分子式为N-{N-[3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)丙基]-L-a-天冬氨酰}-L-苯丙氨酸-1-甲酯）（C24H30N2O7·H2O），分子量为476.52。Advantame水溶性好、耐热温度高，适于高温加工产品。

爱德万甜是一种非营养低热量高强度的新型甜味剂，具有非常微弱的知觉强度的苦味和酸味，可以添加于多种食品，且其甜味可达蔗糖20000倍，因此用量可以远低于现有市场上的蔗糖和其他高倍甜味剂。阿斯巴甜含有苯基丙氨酸，但由于Advantame其很小剂量就能达到增甜的效果，不会引发苯丙酮酸尿症或者PKU(氨基酸代谢性疾病常见的类型)。2014年5月21日，美国FDA发布最终法规，修订食品添加剂条例，批准高倍甜味剂Advantame作为非营养甜味剂和增味剂用于除肉类及家禽之外的食品中。同年5月15日，欧盟发布法规（EU） NO 497/2014，修订关于食品添加剂的法规（EC）NO1333/2008和（EU）NO231/2012附件中有关Advantame 作为甜味剂使用的规定。欧盟专家组通过对Advantame的稳定性、降解产物、毒性以及暴露风险进行评估，根据联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会评估结果，该物质的每日允许摄入量不超过5 mg/kg·bw。专家组认为按照该限量用于食品不会构成健康风险。

目前，在国外爱德万甜作为一种新型超级甜味剂被广泛应用于食品、饮料和药品，其安全性得到了国外食品安全机构的认可。国家卫计委在2017年10月31日发布《关于爱德万甜等6种食品添加剂新品种、环己基氨基磺酸钠（又名甜蜜素）等6种食品添加剂扩大用量和使用范围的公告（2017年第8号）》，该物质可作为甜味剂用于多种食品类别，改善食品口感。

目前，通过液相色谱检测爱德万甜时，分离时间为长，检出限高。现有技术中，尚未有能够快速高效的检测爱德万甜的方法。因此，研究一种能够高效快速的检测爱德万甜的方法成为了亟待需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种液体乳中爱德万甜含量的超高效液相色谱串联质谱检测方法。该方法能用于大批量不同类型液体乳样品中爱德万甜的含量检测，将大大提高液体乳中爱德万甜的检测效率，降低乳品生产企业和检验机构的检测成本。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种液体乳中爱德万甜含量的超高效液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤：

（1）称取样品，加水涡旋分散混匀，然后加入亚铁氰化钾溶液，乙酸锌溶液涡旋混匀，超声提取，定容后离心，过滤取清液待净化；用活化HLB SPE 柱，将提取清液上样， 5%甲醇淋洗，抽干，用甲醇洗脱两次，洗脱液45℃水浴氮吹至近干，用初始流动相复溶，经0.22μm有机微孔滤膜过滤，得预处理样品待上机；

（2）制备标准工作溶液：准确称取爱德万甜标准品 10.0 mg，甲醇溶解并定容到 10mL，配制成1 mg/mL 的储备液，置 4 ℃冰箱保存；

（3）配制基质加标溶液：取不含爱德万甜的空白待测样品溶液，然后加入爱德万甜的标准储备液溶液，配制的不同浓度的基质加标样品溶液，得到标准谱图，形成基质加标曲线；以标准质量色谱图的色谱峰面积为纵坐标，以基质加标中爱德万甜的响应浓度值为横坐标作图，得到线性回归方程；

（4）分析计算：试样用超高效液相色谱一串联质谱联用仪进行检测分析计算。

进一步的，步骤（1）具体为：称取2.00g样品于50mL离心管中，加10mL水涡旋分散混匀，分别加入0.3mL亚铁氰化钾溶液，0.3mL乙酸锌溶液涡旋混匀，超声提取30min，定容至15mL，于8000 r/min离心5 min，过滤取清液待净化；用3mL甲醇，3mL水活化HLB SPE 柱，将提取清液以每秒1滴速度上样，5mL 5%甲醇淋洗，抽干，用6mL甲醇洗脱两次，洗脱液45℃水浴氮吹至近干，用1mL初始流动相复溶，经0.22μm有机微孔滤膜过滤，得预处理样品待上机。

进一步的，所述亚铁氰化钾溶液浓度为106g/L；所述乙酸锌溶液的浓度为183g/L。

本发明提供的方法中，超高效液相色谱的色谱柱为Accucore C18，柱长100mm，柱内径2.1mm，填料内径2.6μm；所述超高效液相色谱的流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸。

进一步的，所述超高效液相色谱的梯度洗脱的柱温：40℃，进样体积：5μL，流速0.30 mL/min，梯度洗脱条件如下：

进一步的，所述质谱参数为：离子源：电喷雾电离源；扫描方式：多反应监测；电离电压：3.5Kv;离子传输管温度：333℃；雾化温度：317℃；辅助气流速：12units；鞘气流速：40units；碰撞气压力：2mTorr。

本发明建立了一种液体乳中爱德万甜含量的超高效液相色谱串联质谱分析检测方法，采用本发明提供的检测方法，爱德万甜在0.1ng/mL-1000 ng/mL浓度范围内线性良好，相关系数为0.9992，方法的检出限为0. 01μg/kg。爱德万甜在不同类型液体乳中的低中高三个添加水平下，实际样品的回收率范围在90%-116%之间，相对标准偏差为0.21%-1.59%（n=6）。本发明分析速度快、定量准确可靠、灵敏度高，适用于不同类型液体乳中爱德万甜的测定，填补了国内质谱法测定爱德万甜的技术空白。

本发明的有益效果：

（1）本发明填补了国内质谱法检测爱德万甜的技术空白；

（2）本发明较现有技术，大大的缩短了分析时间，提高了检测效率；准确度高且稳定；本发明中爱德万甜检出限为0.01μg/kg，检出限远低于现有文献报道水平，线性范围宽，提高了分析灵敏度，建立了检测液体乳中爱德万甜的UPLC电喷雾串联三重四级杆质谱联用的分析方法，填补了国内检测爱德万甜质谱定性定量法的空白，对国内爱德万甜的探索研究具有重要意义。

附图说明

图1为爱德万甜标准溶液的MRM色谱图。

图2为爱德万甜空白基质溶液MRM色谱图。

图3为爱德万甜的基质加标溶液MRM色谱图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行进一步说明。

本发明仪器与材料：

TSQ Quantiva超高效液相色谱串联质谱联用仪（美国ThermoFisher Scientific公司），配备ESI电离源；色谱柱：Accucore C18（100mm×2.1mm，2.6μm）（美国ThermoFisherScientific公司）；BSA822-cw型电子天平(德国Sartorios公司)；AB204-S型电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；MS3旋涡混合器(德国IKA公司)；SB-800DTD型超声波清洗器(中国宁波新芝生物科技股份有限公司)；3-18K型冷冻离心机(德国Sigma公司)；Milli-Q超纯水制备器(美国Millipore公司)，氮吹仪(美国Organomation公司)；HLBSPE柱（3mL/60mg，美国Waters公司）。

乙腈：（色谱纯）美国飞世尔公司；甲醇：（色谱纯）美国飞世尔公司；超纯水：由Milli-Q超纯水机制备；醋酸铵：（色谱纯）德国Flukar公司；氨水：（分析纯）国药集团化学试剂有限公司；亚铁氰化钾：（分析纯）国药集团化学试剂有限公司；乙酸锌：（分析纯）国药集团化学试剂有限公司：爱德万甜标样：（纯度≥97.0％，美国Sigma-Aldrich），0.22μm有机微孔滤膜。

实施例1

1.1标准储备液

准确称取爱德万甜标准品 10.0 mg，甲醇溶解并定容到 10 mL，配制成1 mg/mL 的储备液，置 4 ℃冰箱保存。

1.2配制基质加标溶液

取不含爱德万甜的空白待测样品溶液，然后加入爱德万甜的加标用标准溶液，配制为一系列的基质加标溶液，备用；

1.3试样

称取2.00g（精确到0.01g）样品于50mL塑料离心管中，加10mL水涡旋分散混匀，分别准确加入沉淀剂0.3mL亚铁氰化钾溶液（106g/L），0.3mL乙酸锌溶液（183g/L）涡旋混匀，超声提取30min，定容至15mL，于8000 r/min离心5 min，过滤取清液待净化；用3mL甲醇，3mL水活化HLB SPE 柱，将提取清液以每秒1滴速度上样，5mL 5%甲醇淋洗，抽干，用6mL甲醇洗脱两次，洗脱液45℃水浴氮吹至近干，用1mL初始流动相复溶，经0.22μm有机微孔滤膜过滤待上机。

1.4液相色谱和质谱条件

液相色谱参数：色谱柱：Accucore C18，柱长100mm，柱内径2.1mm，填料内径2.6μm；

流动相：A:乙腈，B:0.1%甲酸；

梯度洗脱，梯度条件见表1，柱温：40℃，进样体积：5μL；

表1 液相色谱梯度条件

“梯度变化曲线为6”是指梯度变化曲线为直线；

质谱参数：

离子源：电喷雾电离源；扫描方式：多反应监测；电离电压：3.5Kv;离子传输管温度：333℃；雾化温度：317℃；辅助气流速：12units；鞘气流速：40units；碰撞气压力：2mTorr；其他质谱参数见表2；

表2 爱德万甜的质谱参数

注：*定量离子

1.5绘制基质加标曲线：采用上述检测条件测定配制的不同浓度的基质加标样品溶液，得到爱德万甜标准溶液的MRM色谱图如图1所示，形成基质加标曲线，采用基质加标外标法同时实现定性定量分析，根据标准谱图中保留时间确定待测组分溶液中爱德万甜，以外标法计算待测组分溶液中爱德万甜的含量。

超高效液相色谱-串联质谱仪进行检测时，由于基质效应的影响，导致目标化合物发生离子增强或抑制作用，因此采用基质加标外标法定量。取空白样品，准确移取添加爱德万甜的标准储备液适量，配制一系列的基质加标样品，制备基质加标溶液，形成基质加标曲线。

1.6定性及定量结果分析

基质加标曲线：采用不含爱德万甜的不同类型液体乳样品，分别加入0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL等七个浓度水平的标准溶液，按照上述方法步骤进行检测，获得质量色谱图，空白样品及加标样品质量色谱图见图2与图3所示，质量色谱图中定量离子对的色谱峰面积y为纵坐标，以基质加标溶液相应离子的浓度值（ng/mL）x为横坐标，作标准曲线，获得爱德万甜的线性回归方程（如表3所示）。

表3 液体乳基质加标曲线

（一）方法回收率、精密度和检出限

采用不同类型液体乳（灭菌乳、调制乳和发酵乳）空白样品，进行添加回收率和精密度的实验。空白样品中分别添加10μg/kg、50μg/kg和100μg/kg三个浓度水平，按照本方法进行处理，每个添加水平进行平行测定6次。同时使用基质匹配标准溶液进行回收率和偏差计算，结果见表4所示。

表4添加回收率与精密度( n = 6)

由表4可见，爱德万甜的回收率在90%-116%。不同水平加标样品样品重复测定6次，测定结果表明RSD为0.21-1.59%。结果表明，该方法能够满足实际样品的检测需要。采用在空白液体乳中添加目标化合物的方法，测定爱德万甜的检出限为0.01μg/kg。

（二）样品检测

（1）定性分析

实施例1待测液体乳样品预处理为待测样品溶液，用超高效液相色谱-串联质谱仪，按照上述方法给出的步骤测定，获得样品质量色谱图。

若样品质量色谱图中存在与标准质量色谱图中的色谱峰相应的色谱峰；则表明样品中含有爱德万甜。相应的色谱峰是指：样品色谱峰的保留时间与标准色谱峰的保留时间比较，变化范围在±2.5％之内；而且试样色谱峰的相对丰度比与相应标准色谱峰相比，偏差不超过表5规定的范围。标准色谱峰是指标准质量色谱图中的目标物的色谱峰。实施例1待测液体乳样品中分析可知不含爱德万甜。

表5定性时相对离子丰度的最大允许偏差

（2）定量计算

采用外标法定量：根据样品质量色谱图中定量离子色谱峰的面积，采用表3的回归方程，计算得到实施例1待测液体乳中爱德万甜的浓度。

对比例1

采用文献《高效液相色谱法检测饮料中艾德万甜含量》提供的方法进行含量的检测，具体结果见表6。

表6

通过表6可以看出，本发明提供的方法以低的进样体积即可满足检测要求，且检测分析时间缩短，提高了检测效率，检出限低，应用范围广，且适合基质复杂的饮料。

Claims (6)

1.一种液体乳中爱德万甜含量的超高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）称取样品，加水涡旋分散混匀，然后加入亚铁氰化钾溶液，乙酸锌溶液涡旋混匀，超声提取，定容后离心，过滤取清液待净化；用活化HLB SPE 柱，将提取清液上样， 5%甲醇淋洗，抽干，用甲醇洗脱两次，洗脱液45℃水浴氮吹至近干，用初始流动相复溶，经0.22μm有机微孔滤膜过滤，得预处理样品待上机；

（2）制备标准工作溶液：准确称取爱德万甜标准品 10.0 mg，甲醇溶解并定容到 10mL，配制成1 mg/mL 的储备液，置 4 ℃冰箱保存；

（3）配制基质加标溶液：取不含爱德万甜的空白待测样品溶液，然后加入爱德万甜的标准储备液溶液，配制的不同浓度的基质加标样品溶液，得到标准谱图，形成基质加标曲线；以标准质量色谱图的色谱峰面积为纵坐标，以基质加标中爱德万甜的响应浓度值为横坐标作图，得到线性回归方程；

（4）分析计算：试样用超高效液相色谱一串联质谱联用仪进行检测分析计算。

2.根据权利要求1所述的超高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，步骤（1）具体为：称取2.00g样品于50mL离心管中，加10mL水涡旋分散混匀，分别加入0.3mL亚铁氰化钾溶液，0.3mL乙酸锌溶液涡旋混匀，超声提取30min，定容至15mL，于8000 r/min离心5 min，过滤取清液待净化；用3mL甲醇，3mL水活化HLB SPE 柱，将提取清液以每秒1滴速度上样，5mL 5%甲醇淋洗，抽干，用6mL甲醇洗脱两次，洗脱液45℃水浴氮吹至近干，用1mL初始流动相复溶，经0.22μm有机微孔滤膜过滤，得预处理样品待上机。

3.根据权利要求2所述的超高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述亚铁氰化钾溶液浓度为106g/L；所述乙酸锌溶液的浓度为183g/L。

4.根据权利要求1-3任一项所述的超高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的色谱柱为Accucore C18，柱长100mm，柱内径2.1mm，填料内径2.6μm；所述超高效液相色谱的流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸。

5.根据权利要求4所述的超高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的梯度洗脱的柱温：40℃，进样体积：5μL，流速0.30 mL/min，梯度洗脱条件如下：

。

6.根据权利要求1-5任一项所述的超高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述质谱参数为：离子源：电喷雾电离源；扫描方式：多反应监测；电离电压：3.5Kv;离子传输管温度：333℃；雾化温度：317℃；辅助气流速：12units；鞘气流速：40units；碰撞气压力：2mTorr。