CN103293243A

CN103293243A - 食品中羧甲基赖氨酸成分的检测方法及应用

Info

Publication number: CN103293243A
Application number: CN2013102158744A
Authority: CN
Inventors: 林钦; 周艳琼; 戴明; 张英; 郑小严; 黄红霞
Original assignee: FUJIAN INSPECTION AND RESEARCH INSTITUTE FOR PRODUCT QUALITY; Zhejiang University ZJU
Current assignee: FUJIAN INSPECTION AND RESEARCH INSTITUTE FOR PRODUCT QUALITY; Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-06-03
Filing date: 2013-06-03
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2033-06-03
Also published as: CN103293243B

Abstract

本发明涉及一种食品中羧甲基赖氨酸成分的检测方法及应用。所述的检测方法包括如下步骤：样品中的蛋白质酸水解后用衍生剂进行衍生，衍生后的溶液经过固相萃取得到待测溶液，采用同位素稀释超高效液相色谱串联质谱法对食品中羧甲基赖氨酸成分进行定性和定量分析；所述衍生剂为9-芴甲基氯甲酸酯。

Description

食品中羧甲基赖氨酸成分的检测方法及应用

技术领域

本发明涉及食品中羧甲基赖氨酸成分的检测方法及应用。

背景技术

晚期糖基化终末产物是在非酶条件下，蛋白质、氨基酸、脂类或核酸等大分子物质的游离氨基与还原糖的醛基经过缩合、重排、裂解、氧化修饰后产生一类稳定的化合物。晚期糖基化终末产物是一类结构多样性的化合物，在食品以及生物体内以多种不同的单体形式存在，如羧甲基赖氨酸、羧乙基赖氨酸、戊糖苷素、吡咯素等。晚期糖基化终末产物积累于机体的不同组织器官，如血管内皮细胞、神经细胞、肾皮质等组织纤维，它不仅可以直接影响细胞和组织功能、参与疾病的产生，也可以通过与特异受体结合发生反应来改变蛋白质和细胞功能，导致机体的病理变化，如糖尿病及其多种并发症。

羧甲基赖氨酸（Carboxymethyllysine, CML）是食品在加工过程中发生美拉德反应时产生的蛋白质化学修饰以及生物体内的糖氧化、脂质氧化和羰基应激的一个重要的生物指标。它是晚期糖基化终末产物最主要的单体之一，常作为检测食品中或生物体内晚期糖基化终末产物含量的一个重要生物标记物。

目前，尚无食品中羧甲基赖氨酸的国标推荐检测方法，已报道的羧甲基赖氨酸的检测方法有：（1）酶联免疫吸附法（ELISA），通过单克隆抗羧甲基赖氨酸抗体来检测羧甲基赖氨酸，但该方法的缺点是缺乏选择性和非特异性，可能会出现假阳性或导致实验结果过高。（2）色谱法、利用荧光检测器或质谱仪对样品中的羧甲基赖氨酸进行分析。使用高效液相色谱（HPLC）结合荧光检测器时，需要采用衍生剂邻苯二甲醛对样品进行柱后衍生或FMOC-CL对生物样品进行柱后衍生。羧甲基赖氨酸在激发波长260nm和发射波长310nm处有特征吸收峰，利用荧光检测器对其进行定性及定量，该方法耗时，干扰性强。使用气相色谱法（GC）或气相色谱质谱法（GC-MS）时，需要采用易挥发的衍生剂对样品进行衍生，衍生时间较长，并且操作过程比较复杂。高效液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）、超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)，利用硼氢化钠对样品进行还原，三氯乙酸提取蛋白质，6mol/L盐酸水解蛋白质或酶解蛋白质，蛋白质水解液经固相萃取净化，然后分析。缺点是离子抑制较强，羧甲基赖氨酸在色谱峰中的保留时间不稳定，不利于定性及定量分析，样品前处理和流动相中均使用了九氟戊酸离子对试剂，该试剂对质谱仪的损害较大。而本方法在原有方法的基础上，进行优化和改进后，克服了这些问题，且具有高效、准确、高灵敏度的特点，在分析羧甲基赖氨酸的含量方面有其独到之处。

发明内容

本发明的一个目的在于填补现有羧甲基赖氨酸检测技术的不足，提供一种食品中羧甲基赖氨酸成分的检测方法。本发明的技术解决方案是：

本发明的食品中羧甲基赖氨酸成分的检测方法，其包括如下步骤：样品中的蛋白质酸水解后用衍生剂进行衍生，衍生后的溶液经过固相萃取得到待测溶液，采用同位素稀释超高效液相色谱串联质谱法对食品中羧甲基赖氨酸成分进行定性和定量分析；所述衍生剂为9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC-CL）。

所述的食品中羧甲基赖氨酸成分的检测方法，其具体包括如下步骤：

1）样品经脱脂后，用硼氢化钠进行还原；

2）经步骤1)还原后的产物加入三氯乙酸进行沉淀，沉淀出蛋白质；

3）将沉淀出的蛋白质经盐酸水解；

4）将水解后的溶液用FMOC-CL溶液进行衍生，得衍生后的溶液；

5）衍生后的溶液经固相萃取后进行浓缩，浓缩后用溶剂溶解，得待测液；

6）待测液采用同位素稀释超高效液相色谱串联质谱法进行测定；

与现有技术相比较，本发明是一种利用柱前衍生结合固相萃取净化以及同位素稀释超高效液相色谱串联质谱进行的检测方法, 本发明建立了FMOC-CL衍生剂对食品中蛋白质水解液进行衍生，然后经过PEP固相萃取小柱进行固相萃取，40%乙腈和二氯甲烷的淋洗，有效除去干扰物质，具有很好的净化作用，提高灵敏度。羧甲基赖氨酸经过FMOC-CL的衍生后，改变了其极性，更有利于色谱峰中羧甲基赖氨酸保留时间的稳定，改变了液相条件，不再使用NFPA（九氟戊酸）这种离子对试剂，有效保护质谱仪。采用同位素稀释超高效液相色谱串联质谱法对食品中的羧甲基赖氨酸的定性以及定量分析，该检测方法具有分析时间短，灵敏度高，选择性高，准确度高，稳定性好等特点。能对食品中的羧甲基赖氨酸进行准确定性及定量分析。

附图说明

图1衍生产物裂解途径;

图2羧甲基赖氨酸标准品的一级质谱图;

图3羧甲基赖氨酸标准品的二级质谱图;

图4氘代羧甲基赖氨酸标准品的一级质谱图;

图5氘代羧甲基赖氨酸标准品的二级质谱图;

图6羧甲基赖氨酸标准品的色谱图;

图7蛋白粉中羧甲基赖氨酸的色谱图。

具体实施方式

以下结合附图的具体实施例对本发明进一步说明。（但不是对本发明的限制）。

本发明的食品中羧甲基赖氨酸成分的检测方法，其包括如下步骤：样品中的蛋白质酸水解后用衍生剂进行衍生，衍生后的溶液经过固相萃取得到待测溶液，采用同位素稀释超高效液相色谱串联质谱法对食品中羧甲基赖氨酸成分进行定性和定量分析；所述衍生剂为9-芴甲基氯甲酸酯FMOC-CL。

1）样品经脱脂后，用硼氢化钠进行还原；

3）将沉淀出的蛋白质经盐酸水解；

6）待测液采用同位素稀释超高效液相色谱串联质谱法进行测定。

所述的食品中羧甲基赖氨酸成分的检测方法，其步骤4)具体为：将水解后的溶液经过滤，取定量的滤液调pH8-9后，与乙腈按1:1比例混匀，以体积比5:1加入5%的硼砂缓冲液混匀，以体积比5:1的比例加入FMOC-CL溶液进行衍生，得到衍生后的溶液。

所述的食品中羧甲基赖氨酸成分的检测方法其步骤4)中所用的FMOCL-CL的浓度为10g/L-25g/L，衍生时间为10min-30min。经过条件优化，优选FMOCL-CL的浓度为10g/L，衍生时间为10min。

所述的食品中羧甲基赖氨酸成分的检测方法，其步骤5)具体为：衍生后的溶液加入甲酸，经聚合物吸附型固相萃取柱富集，依次用40%乙腈和二氯甲烷进行淋洗，由5%的氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，氮吹浓缩后用50%乙腈溶解得待测液。

所述的食品中羧甲基赖氨酸成分的检测方法的色谱条件为：采用BEH-C18，1.7μm，2.1mm×100mm色谱柱；流动相：A相为0.5%甲酸水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱。流速：200-300μL/min，柱温：35℃，进样量：5-10μL。

所述的检测方法的质谱条件：电离源为电喷雾正离子模式(ESI+)；多反应监测(MRM)；特征离子：羧甲基赖氨酸母离子649.3，定量子离子179.0，定性子离子427.4；羧甲基赖氨酸-D4同位素母离子653.3，子离子431.4。采用氘代羧甲基赖氨酸同位素标准品为内标，进行羧甲基赖氨酸含量测定。

所述的检测方法，其使用的检测仪器：用于样品的定性定量分析测定的有：超高效液相色谱串联四级杆质谱仪，配电喷雾离子源（ESI⁺），离心机：转速≥10000r/min，涡旋混合器，分析天平，组织捣碎机，固相萃取仪，氮吹仪，烘箱，移液器，PEP60mg/3mL固相萃取柱，色谱柱：BEH-C₁₈（1.7μm，2.1mm×100mm）；所使用的试剂：羧甲基赖氨酸的标准品，氘代羧甲基赖氨酸标准品，乙腈（色谱纯），甲醇（色谱纯），超纯水，其他试剂均为分析纯。

本发明提供一种食品中羧甲基赖氨酸的检测方法，将提取液用FMOC-CL衍生，衍生产物裂解途径见附图1，经固相萃取，采用同位素稀释超高效液相色谱串联质谱法对待测样品溶液中羧甲基赖氨酸进行定性和定量分析；

检测条件为：

液相条件：采用BEH-C₁₈，1.7μm，2.1mm×100mm色谱柱；流动相：A相为0.5%甲酸水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱：0-2min，90%A-68%A；2-5min，68%A；5-6min，20%A；6-8min，90%A。流速：200-300μL/min，柱温：35℃，进样量：5-10μL。

质谱条件：电离源为电喷雾正离子模式(ESI⁺)；多反应监测(MRM)；毛细管电压3.50KV；源温度120℃；脱溶剂气温度400℃；脱溶剂气流量700L/h，碰撞室压力：2.7í10^-3mbar，特征离子及其它质谱参数见表1，采用氘代羧甲基赖氨酸同位素标准品为内标，进行羧甲基赖氨酸含量测定。

表 1 羧甲基赖氨酸的主要特征离子及质谱参数

具体地，本发明所述待测样品中羧甲基赖氨酸的检测方法包括以下几个过程：

（1）标准溶液的配制

A、羧甲基赖氨酸标准储备溶液：准确称取适量的羧甲基赖氨酸标准品，用70%甲醇溶液溶解后并定容于容量瓶中，配制成浓度为200μg/mL的标准储备溶液。置于4℃冰箱中保存。

B、同位素内标标准储备溶液：准确称取适量的氘代羧甲基赖氨酸标准品，用70%甲醇溶液配制成40μg/mL的标准储备溶液。置于4℃冰箱中保存。

C、羧甲基赖氨酸标准使用溶液：根据需要，临用时吸取一定量的羧甲基赖氨酸标准储备溶液，用水稀释配制成标准使用溶液，置于4℃冰箱中保存。

D、同位素内标标准工作溶液：根据需要，临用时吸取一定量的同位素内标标准储备溶液，用水进行适当稀释，配制成同位素内标标准工作溶液。置于4℃冰箱中保存。

（2）确定检测的标准

A、定性检测标准：每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括1个母离子，2个子离子，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表 2 规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。

取羧甲基赖氨酸标准储备溶液500μL，加入500μL乙腈，涡旋混匀，加入200μL 5%硼砂溶液，涡旋混匀，加入200μL 10g/L的9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC-CL），涡旋混匀，衍生10min，加入50μL甲酸，混匀，再用40%乙腈溶液定容至3mL，涡旋混匀，待固相萃取。备好的溶液以1滴/s的速度过已活化平衡的PEP固相萃取柱（60mg/3mL，先后用2mL甲醇和2mL 0.5%的甲酸溶液活化平衡PEP柱），待样液完全流出后，用2mL，40%乙腈溶液淋洗，真空抽干，再用2mL二氯甲烷淋洗，真空抽干5min。最后用5mL 5%氨水甲醇溶液洗脱，真空抽干并收集流出液。将流出液氮吹浓缩至200μL左右（温度低于40℃），用50%乙腈溶解残留物定容至2mL，涡旋混匀，过PTFE膜，采用上述液相条件，质谱条件以及质谱参数进行UPLC-MS/MS分析，根据羧甲基赖氨酸的色谱峰的保留时间，它的两个子离子的相对丰度比以及浓度相当的标准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较作为定性标准；

表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 %

相对离子丰度	>50	>20	>10	≤10
					最大允许偏差	±20	±25	±30	±50

B、定量标准检测：内标法定量：羧甲基赖氨酸以氘代羧甲基赖氨酸为内标物，以峰面积积分值对试样进行内标法定量，标准工作溶液和试样溶液的响应值均应在仪器检测线性范围内。

（3）对待测食品进行检测

A、对待测食品进行前处理：称取1.0g(精确到0.001g)研磨粉碎后的样品置于50mL离心管中。加入10mL正己烷，充分涡旋，于1,0000rpm离心3min，弃正己烷层，重复上述正己烷脱脂过程2次，氮吹（40℃）挥去正己烷。向脱脂后的样品中加入10mL，0.2mol/L硼砂盐缓冲液，混匀，加入5mL 1mol/L硼氢化钠溶液（0.1mol/L氢氧化钠配制），混匀，4℃，过夜。还原后的样品中加入2mL60%三氯乙酸溶液,混匀，1,0000rpm离心5min，弃上清液。将沉淀的蛋白质物质转移至50mL的安瓿瓶中，加入20mL，6mol/L盐酸溶液，混匀，110℃，水解24h。水解液用超纯水定容至50mL，滤纸过滤，收集滤液。取1mL滤液（根据样品中蛋白质含量高低的需要对滤液进行适当的稀释），加入200μL，0.8μg/mL氘代羧甲基赖氨酸同位素内标，混匀，再用50% KOH溶液调pH于8~9，用超纯水定容至5mL，混匀。取上述溶液500μL，加入500μL乙腈溶液，混匀，加入200μL，5%硼砂溶液，混匀，漩涡加入200μL 10g/L FMOC-CL乙腈溶液，混匀，放置10min后加入50μL甲酸，混匀，再用40%乙腈溶液定容至3mL，混匀。该溶液以1滴/s的速度过PEP固相萃取柱（Agela，60mg/3mL，2mL甲醇和2mL 0.5%的甲酸溶液活化平衡），待样液完全流出后，用2mL，40%乙腈溶液淋洗，真空抽干，再用2mL二氯甲烷淋洗，真空抽干。最后用5mL 5%氨水甲醇溶液洗脱，真空抽干并收集流出液。将流出液氮吹（温度低于40℃）浓缩至200μL左右，用50%乙腈溶液溶解并定容至2mL，混匀，过PTFE膜，转移到进样瓶中，待分析。

B、定性及定量检测：将步骤A中处理好的溶液，按照上述液相条件：采用BEH-C₁₈，1.7μm，2.1mm×100mm色谱柱；流动相：A相为0.5%甲酸水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱：0-2min，90%A-68%A；2-5min，68%A；5-6min，20%A；6-8min，90%A。流速：200-300μL/min，柱温：35℃，进样量：5-10μL。

质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI⁺)；多反应监测（MRM）；毛细管电压3.50KV；源温度120℃；脱溶剂气温度400℃；脱溶剂气流量700L/h，碰撞室压力：2.7í10^-3mbar，特征离子及质谱参数见表1。

采用UPLC-MS/MS对羧甲基赖氨酸进行定性及定量分析。根据色谱峰的保留时间、质谱参数以及丰度来确定是否含有羧甲基赖氨酸，根据色谱峰的峰面积，氘代羧甲基赖氨酸同位素以及线性回归方程计算得到实际样品中羧甲基赖氨酸的浓度，再根据检测量即可计算出羧甲基赖氨酸的含量，取平均值后即得测得值。

（4）检出限：待测化合物的定性离子的重构离子的色谱峰的信噪比应大于等于3（S/N≥3），定量离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于10（S/N≥10）。

（5）回收率：扣除本底法，在样品中加入低、中、高不同量的羧甲基赖氨酸标准溶液，按照所描述的待测样品检测方法，每组平行测定3组，计算平均加标回收率。

（6）重复性：取待测样品进行重复性实验，按照所描述的待测样品检测方法，平行测定6组，计算得出受试样品检测的相对标准偏差。

（7）稳定性：取待测样品进行稳定性实验，按照所描述的待测样品检测方法，平行测定3组，于1d内的6个不同时段进行进样分析；同时，分5d连续测定，取平均值，并计算日内差和日间差的相对标准偏差。

通过有效评价，本发明所述检测方法的专属性、准确度、精密度、重复性、稳定性以及线性范围较好。

实例1:市售薯片中羧甲基赖氨酸的检测

1、制作标准工作曲线：采用空白基质加标法，内标法定量。将羧甲基赖氨酸标准储备液用超纯水稀释配制成羧甲基赖氨酸标准使用液，浓度为4μg/mL左右，精确吸取标准使用液5μL，10μL，25μL，50μL，100μL，200μL，500μL，其中每个标准使用液中加入200μL氘代羧甲基赖氨酸同位素标准工作溶液，混匀，用水稀释至5mL。配制成浓度范围为3.6ng/mL，7.2ng/mL，18.1ng/mL，36.1ng/mL，72.3ng/mL，144.6ng/mL，361.4ng/mL的标准溶液。从这一系列浓度标准溶液中精确吸取500μL溶液，加入500μL乙腈，涡旋混匀，加入200μL 5%硼砂溶液，涡旋混匀，加入200μL 10g/L的9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC-CL），涡旋混匀，衍生10min，加入50μL甲酸，混匀，再用40%乙腈溶液定容至3mL，涡旋混匀，待固相萃取。备好的溶液以1滴/s的速度过已活化平衡的PEP固相萃取柱（60mg/3mL，先后用2mL甲醇和2mL 0.5%的甲酸溶液活化平衡PEP柱），待样液完全流出后，用2mL，40%乙腈溶液淋洗，真空抽干，再用2mL二氯甲烷淋洗，真空抽干5min。最后用5mL 5%氨水甲醇溶液洗脱，真空抽干并收集流出液。将流出液氮吹浓缩至200μL左右（温度低于40℃），用50%乙腈溶解残留物定容至2mL，涡旋混匀，过PTFE膜，待上机分析。

按照上述色谱分析条件，质谱条件和质谱参数分析，制备标准工作曲线：在羧甲基赖氨酸浓度为3.6-361.4ng/mL范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系，线性回归方程为：Y=0.36586x＋0.241965，R²=0.9989。以此为实际样品的测定提供定性及定量标准。

2、样品处理：

（1）称样：称取1.0g(精确到0.0001g)研磨粉碎后的薯片样品置于50mL离心管中。

（2）脱脂：10mL正己烷，充分涡旋，于1,0000rpm离心3min，弃正己烷层，重复上述正己烷脱脂过程2次，氮吹（40℃）挥去正己烷。

（3）硼氢化钠还原反应：向脱脂后的样品中加入10mL，0.2mol/L硼砂盐缓冲液，涡旋混匀，加入5mL1mol/L硼氢化钠溶液（0.1mol/L氢氧化钠配制）混匀，4℃，过夜。

（4）沉淀蛋白质：还原后的样品中加入2mL60%三氯乙酸溶液，混匀，1,0000rpm离心5min，弃上清液，保留蛋白质物质。

（5）盐酸水解：将沉淀的蛋白质物质转移至50mL的安瓿瓶中，加入20mL，6mol/L盐酸溶液，混匀，110℃，水解24h。水解液用超纯水定容至50mL，过滤，收集滤液。

（6）FMOC-CL衍生反应：取1mL滤液（根据样品中蛋白质含量高低的需要对滤液进行适当的稀释），加入200μL，0.8μg/mL氘代羧甲基赖氨酸同位素内标，混匀，再用50%氢氧化钾溶液调pH于8~9，用超纯水定容至5mL，混匀。取上述溶液500μL，加入500μL乙腈溶液，涡旋混匀，加入200μL，5%硼砂溶液，混匀，漩涡加入200μL，10g/L FMOC-CL乙腈溶液，涡旋混匀，放置10min。加入50μL甲酸，混匀。

（7）固相萃取：用40%乙腈溶液将衍生溶液定容至3mL，涡旋混匀。该溶液以1滴/s的速度过PEP固相萃取柱（Agela，60mg/3mL，2mL甲醇和2mL 0.5%的甲酸溶液活化平衡），待样液完全流出后，用2mL，40%乙腈溶液淋洗，真空抽干，再用2mL二氯甲烷淋洗，真空抽干。最后用5mL，5%氨水甲醇溶液洗脱，真空抽干并收集流出液。将流出液氮吹（40℃）浓缩至200μL左右，用50%乙腈溶液溶解并定容至2mL，涡旋混匀，过PTFE膜，转移到进样瓶中，待分析。

3、超高效液相色谱串联质谱测定：按照上述液相条件：

采用BEH-C₁₈，1.7μm，2.1mm×100mm色谱柱；流动相：A相为0.5%甲酸水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱：0-2min，90%A-68%A；2-5min，68%A；5-6min，20%A；6-8min，90%A。流速：200-300μL/min，柱温：35℃，进样量：5-10μL。

质谱条件：电离源为电喷雾正离子模式(ESI⁺)；多反应监测(MRM）；毛细管电压3.50KV；源温度120℃；脱溶剂气温度400℃；脱溶剂气流量700L/h，碰撞室压力：2.7í10^-3mbar，特征离子及质谱参数见表1。

采用UPLC-MS/MS对羧甲基赖氨酸进行定性及定量分析，平行测定六组，根据线性方程得到羧甲基赖氨酸的浓度，再根据薯片样品的称样量即可计算出羧甲基赖氨酸的含量，取平均值。

4、方法学考察，其中包括线性、检测限、重复性、稳定性、回收率。

4.1 线性：采用空白基质加标法，内标法定量，在3.6ng/mL～360ng/mL浓度范围内，羧甲基赖氨酸的线性方程为Y=0.36586x＋0.241965，R²=0.9989。

4.2 检测限：经逐级稀释法检测羧甲基赖氨酸的含量，计算本方法对羧甲基赖氨酸的最低检测限(LOD)值为1μg/kg，最低定量限(LOQ)值为3μg/kg。

4.2 重复性：取薯片样品进行重复性实验(n=6)，按上述样品预处理和进样分析，计算待测样品检测的RSD为2.8%，见表3所示，证明方法的重复性良好。

表3 UPLC-MS/MS方法检测薯片中羧甲基赖氨酸的重复性实验(n=6)

4.3 稳定性：取同一待测溶液，于1d内的6个不同时段进行进样分析，同时分5d连续测定，取平均值，并计算得到日内差和日间差的RSD小于6.5，见表4所示，证明方法的稳定性良好。

表4 UPLC-MS/MS方法检测薯片中羧甲基赖氨酸的稳定性实验(n=3)

4.4 回收率：取同一薯片样品进行回收率实验，按上述样品预处理和进样分析。低、中、高加标量分别为3.6ng/mL、9ng/mL、18ng/mL，每组平行测定6次，计算平均加标回收率。结果见表 5 所示。

表5 UPLC-MS/MS方法检测薯片中羧甲基赖氨酸的加标回收率实验(n=3)

Figure 2013102158744100002DEST_PATH_IMAGE007

实施例2：本发明检测方法的应用，市售蛋白粉中羧甲基赖氨酸的检测

1、制作标准工作曲线同实施例1

2、样品处理及测定同实施例1，蛋白粉中羧甲基赖氨酸的含量为386.77 mg/kg。

实施例3：市售曲奇饼干中羧甲基赖氨酸的检测

1、制作标准工作曲线同实施例1

2、样品处理及测定同实施例1，曲奇饼干中羧甲基赖氨酸的含量为108.84 mg/kg。

实施例4：市售卤鸡翅中羧甲基赖氨酸的检测

1、制作标准工作曲线同实施例1

2、样品处理及测定同实施例1，卤鸡翅中羧甲基赖氨酸的含量为84.58 mg/kg。

Claims

1.食品中羧甲基赖氨酸成分的检测方法，其特征在于, 所述的检测方法包括如下步骤：样品中的蛋白质酸水解后用衍生剂进行衍生，衍生后的溶液经过固相萃取得到待测溶液，采用同位素稀释超高效液相色谱串联质谱法对食品中羧甲基赖氨酸成分进行定性和定量分析；所述衍生剂为9-芴甲基氯甲酸酯。

2.根据权利要求1所述的食品中羧甲基赖氨酸成分的检测方法，其特征在于, 所述的的检测方法具体包括如下步骤：

样品经脱脂后，用硼氢化钠进行还原；

经步骤1还原后的产物加入三氯乙酸进行沉淀，沉淀出蛋白质；

将沉淀出的蛋白质经盐酸水解；

将水解后的溶液用FMOC-CL溶液进行衍生，得衍生后的溶液；

衍生后的溶液经固相萃取后进行浓缩，浓缩后用溶剂溶解，得待测液；

待测液采用同位素稀释超高效液相色谱串联质谱法进行测定。

3.根据权利要求2所述的食品中羧甲基赖氨酸成分的检测方法，其特征在于, 所述的检测方法其步骤4具体为：将水解后的溶液经过滤，取定量的滤液调pH8-9后，与乙腈按1:1比例混匀，以体积比5:1加入5%的硼砂缓冲液混匀，以体积比5:1的比例加入FMOC-CL溶液进行衍生，得到衍生后的溶液。

4.根据权利要求2所述的食品中羧甲基赖氨酸成分的检测方法，其特征在于, 所述的检测方法其步骤4中所用的FMOCL-CL的浓度为10g/L-25g/L，衍生时间为10min-30min;经过条件优化，优选FMOCL-CL的浓度为10g/L，衍生时间为10min。

5.根据权利要求1所述的食品中羧甲基赖氨酸成分的检测方法，其特征在于,所述的检测方法其步骤5具体为：衍生后的溶液加入甲酸，经聚合物吸附型固相萃取柱富集，依次用40%乙腈和二氯甲烷进行淋洗，由5%的氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，氮吹浓缩后用50%乙腈溶解得待测液。

6.根据权利要求1所述的食品中羧甲基赖氨酸成分的检测方法，其特征在于, 所述的检测方法的色谱条件为：采用BEH-C18，1.7μm，2.1mm×100mm色谱柱；流动相为：A相为0.5%甲酸水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱;流速为：200-300μL/min，柱温为：35℃;进样量为：5-10μL;

所述的检测方法的质谱条件为：电离源为电喷雾正离子模式(ESI+)；多反应监测(MRM)；特征离子：羧甲基赖氨酸母离子649.3，定量子离子179.0，定性子离子427.4；羧甲基赖氨酸-D4同位素母离子653.3，子离子431.4;采用氘代羧甲基赖氨酸同位素标准品为内标，进行羧甲基赖氨酸含量测定。