CN103884787B - 一种肽-晚期糖基化终末产物的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肽-晚期糖基化终末产物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）液体样品中二羰基化合物的消除；（2）通过固相萃取技术对样品进行除杂和肽-晚期糖基化终末产物的富集；（3）利用高分辨质谱对富集后的肽-晚期糖基化终末产物定性；（4）利用肽酶对富集后的肽-晚期糖基化终末产物进行酶解，过膜除去肽酶，得到游离态的晚期糖基化终末产物；（5）通过质谱分析对游离态的晚期糖基化终末产物进行定量分析。本发明方法能够高通量检测肽-晚期糖基化终末产物，减少了肽-晚期糖基化终末产物定量检测的复杂性，且具有较好的检出限，目标物的浓度和其信号的峰面积具有良好的线性关系，具有很好的定量效果。

Description

一种肽-晚期糖基化终末产物的检测方法

技术领域

本发明涉及涉及一种肽-晚期糖基化终末产物（肽-AGEs）的定性及定量检测方法。

背景技术

晚期糖基化终末产物（AGEs）可以引起体内蛋白质的糖基化，使血管壁韧性减低，易于受损，同时AGEs可与细胞上的受体结合，促进炎性细胞因子的释放。AGEs还可促进氧自由基形成，从而使组织损伤。AGEs和白内障的形成、动脉硬化、早老性痴呆(阿耳茨海默氏病)、淀粉性变样、肾病、神经病、视网膜病等有关。AGEs一旦形成易在组织内堆积，且可以有放大效应，促进更多的AGEs形成。

AGEs可分为内源性AGEs和外源性AGEs。内源性AGEs是机体内糖类与蛋白质发生糖基化反应而产生的，内源性AGEs的危害性已经由医学界明确证实了。外源性AGEs是指人体从外部吸入或食入的AGEs，其中大部分是由膳食带入人体内的，称为食源性AGEs。基于对内源性AGEs作人体危害性的证实，越来越多学者开始关注由膳食摄入的AGEs对人体的影响。针对外源性的AGEs是在食品加工过程中产生的，应该通过控制食品的加工条件来减少AGEs的产生。目前已发现了四十多种AGEs，其中包括了羧甲基赖氨酸（CML）、羧乙基赖氨酸（CEL）、吡咯素（pyrraline）等。

根据AGEs的存在方式，AGEs可以分为游离态的AGEs和结合态的AGEs。游离态的AGEs是不与蛋白质或多肽结合在一起的AGEs，大多为小分子类物质。结合态的AGEs是指发生Maillard反应后，生成的AGEs的某些N端和C端仍然以共价键的方式与蛋白或多肽残基相连，它包括了蛋白-晚期糖基化终末产物（蛋白-AGEs）和肽-晚期糖基化终末产物（肽-AGEs）。由于游离态的AGEs本身就种类繁多，结构复杂，而由于结合态的AGEs的相连基团的复杂多样，使得结合态的AGEs的定性和定量变得尤为复杂。

对于肽-AGEs，目前仅仅是很笼统的说明是肽-AGEs一类物质，并没有针对具有何种肽结构的肽-AGEs进行定性，无法准确地表征肽-AGEs的结构。针对结合态的AGEs，目前主要的检测方法是通过酸水解法将结合态的AGEs转化为游离态的AGEs进行检测，然而，由于酸水解的条件过于剧烈，而且不同的AGEs在剧烈的酸解条件下稳定性不同，最后得到的不同AGEs含量会有不同程度的损失。因此，酸水解法不利于AGEs的准确定量。

由于AGEs种类繁多，结构复杂，目前运用较多的测定方法是酶联免疫法和液质联用技术法。酶联免疫法是基于单克隆抗体检测食品中的AGEs含量，操作方便，高效的特点，但不能同时检测几种AGEs的含量，如同时检测羧甲基赖氨酸、吡咯素的含量，而且不具有高分辨的特点。

液质联用技术具有高效、高灵敏度、高分辨率的特点，在分析AGEs的结构方面有其独到之处，而且能够对不同的AGEs进行定性，并且采用单扫描的模式可以同时检测几种AGEs各自的含量，并且做到定量准确。然而在进行液质联用分析前，样品的前处理是必不可少的，因此，为了采用液质联用技术定性和定量检测肽-晚期糖基化终末产物，样品中二羰基化合物的消除、样品的富集等前处理步骤对于其准确的定性和定量显得十分的重要。现有的肽-晚期糖基化终末产物的检测中，存在以下不利因素：肽-晚期糖基化终末产物产生量少，并且反应体系中存在磷酸盐，反应也会同时大量生成其它物质。此外，体系中产生的二羰基化合物也会同时导致反应的后延现象，而且多肽种类多样性导致肽-AGEs复杂多样，这些均不利于肽-AGEs的质谱定性及定量分析。对于样品中二羰基化合物的消除目前选择较多的是在反应到规定时间后加入还原试剂，如硼氢化钠等将未反应完的二羰基化合物还原为醇，以此来消除样品中的二羰基化合物。然而，一些AGEs，如吡咯素(pyrraline)也含有醛基，同样也会被还原为醇，严重影响了吡咯素的定性和定量。与此同时，这种方法对于反应中间体二羰基化合物的定量只能通过被还原为醇后实施，然而，在质谱检测中，醇类在质谱中信号响应较低，加之二羰基化合物的含量相对较少，因此这种方法对于反应中间体二羰基化合物的定量十分不利。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷本发明的目的在于提供一种肽-晚期糖基化终末产物（肽-AGEs）的定性及定量检测方法，该方法能够有效的消除样品中的二羰基化合物，防止二羰基化合物向肽-晚期糖基化终末产物转化。通过除杂和富集步骤能够有效的去除反应体系中的磷酸盐和其它干扰杂质，使目标物肽-晚期糖基化终末产物能在质谱中有很好的信号响应。同时，采用酶解法将肽-晚期糖基化终末产物（肽-AGEs）酶解为游离的AGEs，能有效地对AGEs定量，克服了多肽结构的多样性对AGEs定量的限制。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种肽-晚期糖基化终末产物的检测方法，包括以下步骤：

（1）液体样品中二羰基化合物的消除；

（2）通过固相萃取技术对样品进行除杂和肽‐晚期糖基化终末产物的富集，具体步骤：选取官能化聚苯乙烯/二乙烯苯萃取柱，分别使用甲醇和水活化萃取柱，上样，用水淋洗去除杂质，用纯甲醇将肽‐晚期糖基化终末产物洗脱出来；氮吹干后复溶，最后过膜；

（3）利用高分辨质谱对富集后的肽‐晚期糖基化终末产物定性；

（4）利用肽酶对富集后的肽‐晚期糖基化终末产物进行酶解，过膜除去肽酶，得到游离态的晚期糖基化终末产物；

（5）通过质谱分析对游离态的晚期糖基化终末产物进行定量分析。

本发明所述肽-晚期糖基化终末产物为：

含有赖氨酸残基的肽-AGEs；

含有精氨酸残基的肽-AGEs；

交联在两个赖氨酸残基之间的肽-AGEs；

交联在两个精氨酸残基之间的肽-AGEs；

交联在一个赖氨酸残基与一个精氨酸残基之间的肽-AGEs。

优选地，肽-晚期糖基化终末产物为肽-羧甲基赖氨酸或肽-吡咯素。

若样品中原料含有短肽和还原糖，则样品中存在还原糖的裂解产生二羰基化合物，若反应原料为短肽和二羰基醛类，则样品存在未完全反应的二羰基醛。这类二羰基化合物具有较高的反应活性，能够在100℃以下继续和肽发生反应，引起反应的后延，导致对肽-晚期糖基化终末产物定量检测变得极其不准确。此外，作为反应中间体的二羰基化合物由于具有高反应活性，因此在反应中对反应中间体定量十分困难。

本发明优选采用邻苯二胺作为中间体二羰基化合物的消除剂。即在反应到规定时间后加入邻苯二胺，其中邻苯二胺加入量的标准为其摩尔量大于样品中还原糖或醛类的摩尔量。邻苯二胺可以迅速和二羰基化合物反应生成稳定的喹啉化合物，邻苯二胺只和二羰基化合物反应，不会与含有醛基的AGEs发生反应，有利于含醛基的AGEs的定性和定量。同时，喹啉化合物在质谱中具有很强的信号响应，具有较低的检出限，对于反应中间体二羰基化合物的定量具有重要的作用。

本发明中所述邻苯二胺加入的摩尔量为样品中还原糖或醛类的摩尔量的2-5倍。

肽-晚期糖基化终末产物体系中含有较多的杂质，如类黑精、非极性化合物、磷酸盐等，这些杂质会严重干扰肽-晚期糖基化终末产物在液质联用设备中的定性和定量分析。本发明优选的一种除杂和富集方法为固相萃取技术。该方法选取官能化聚苯乙烯/二乙烯苯萃取柱，该萃取柱的填料表面同时具有亲水性和憎水性基团，从而对各类极性、非极性化合物具有较均衡的吸附作用。pH使用范围为1-14。其吸附能力和样品容量远高于C18键合硅胶。先采用甲醇和去离子水分别活化萃取柱，然后根据萃取柱的载样量进行上样，而后用去离子水进行淋洗，将目标物肽-晚期糖基化终末产物保留到固相萃取柱上，同时洗去其它干扰杂质，最后用甲醇将目标物洗脱下来，收集后用氮气吹干，用1mL流动相复溶，从而达到了除杂和富集的效果。为肽-晚期糖基化终末产物的质谱定性和定量分析提供了良好的样品前处理。

经过步骤（3）得到的肽-晚期糖基化终末产物虽然可以定性，但是由于肽的结构的不同，而且目前市场没有肽-晚期糖基化终末产物的标准品，因此必须将肽-晚期糖基化终末产物变为游离的晚期糖基化终末产物以便于定量检测。本发明优选羧肽酶A对肽-晚期糖基化终末产物进行酶解，其中羧肽酶A的加入量按照0.2-1.0EC unit/0.05μmol底物的标准加入，水解条件为30-40℃下水浴2-5h。然后过0.45μm膜除去羧肽酶。羧肽酶A相对其它酶能够针对性的将肽-晚期糖基化终末产物充分释放出来，使得获得的游离态的晚期糖基化终末产物含量能够有效的代表肽-晚期糖基化终末产物含量。

对于步骤（3）得到的肽‐晚期糖基化终末产物，采用UPLC-MS/MS液质联用高分辨质谱对于得到的肽-晚期糖基化终末产物进行定性分析。通过除杂富集步骤，UPLC-MS/MS液质联用高分辨质谱能够准确地对肽-晚期糖基化终末产物进行定性。确定肽-晚期糖基化终末产物的真实存在。本发明所述晚期糖基化终末产物定性采用高分辨质谱分析，其中定性所用高分辨质谱采用液相系统为Agilent1290液相系统，UPLC检测条件为：

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18Column2.1×150mm

柱温：30℃

流动相：水（0.1%甲酸）：乙腈（0.1%甲酸）=95：50-0.8min

水（0.1%甲酸）：乙腈（0.1%甲酸）=60：408min

水（0.1%甲酸）：乙腈（0.1%甲酸）=95：510-12min

流速：0.2mL/min

进样量：10μL。

步骤（5）所述对游离态的晚期糖基化终末产物定量采用普通质谱分析，其中定量所用液相色谱采用Waters1525机型，检测条件为：

色谱柱：Waters Symmetry C18分析柱250mm×4.6mm

柱温：25℃

流动相：水（0.1%甲酸）：乙腈（0.1%甲酸）=85：15

流速：0.5mL/min

进样量：10μL。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明用于肽-晚期糖基化终末产物的定性和定量分析的方法，通过液体样品中二羰基化合物的消除能够有效消除样品中的中间体，使定量更为准确，有利于研究肽-晚期糖基化终末产物的生成规律，而且反应中间体二羰基化合物和邻苯二胺反应后生成的稳定的喹啉，有利于研究反应中间体的变化。通过本发明方法处理的肽-晚期糖基化终末产物的定性方便准确易读，而且能够同时检测多种肽-晚期糖基化终末产物。此外通过酶解肽-晚期糖基化终末产物为游离态的晚期糖基化终末产物，通过液质联用技术实现肽-晚期糖基化终末产物准确定性和定量检测。本发明具有较好的检出限，目标物的浓度和其信号的峰面积具有良好的线性关系，具有很好的定量效果。

附图说明

图1为邻苯二胺与反应中间体二羰基化合物反应产生喹啉从而消除反应中间体的示意图。

图2为肽-吡咯素的高分辨率质谱图。其中(A)为pyrraline-Ala的高分辨质谱图。(B)为pyrraline-Gly的高分辨质谱图。

图3为游离出来的吡咯素定量时的单扫描离子流图。其中(A)为通过pyrraline-Ala游离出来吡咯素单扫描离子流图。(B)为通过pyrraline-Gly游离出来吡咯素单扫描离子流图。

图4为实施例1中建立的标准曲线。其中(A)为羧甲基赖氨酸的标准曲线，(B)为吡咯素的标准曲线，(C)为3-脱氧葡萄糖醛酮的标准曲线。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

本发明用含2-4个氨基酸的短肽与还原糖反应，或者通过含2-4个氨基酸的短肽和醛类在磷酸盐缓冲液的环境中制取肽-晚期糖基化终末产物，能够在100℃以上的条件下快速制取结构较为单一的肽-晚期糖基化终末产物，如肽-羧甲基赖氨酸、肽-吡咯素，不会由于反应肽的不同而导致肽-羧甲基赖氨酸、肽-吡咯素结构的复杂多样性，为后续实验研究肽-晚期糖基化终末产物的生成规律提供了简单便利的方法，降低了肽-晚期糖基化终末产物定量检测的难度。

实施例1

采用二肽(N)Lys-Ala(C)与葡萄糖反应，(N)Lys-Ala(C)与葡萄糖在0.2M PBS(磷酸缓冲液，pH=6.8)介质中混合，二肽浓度10^-3mol/L，葡萄糖浓度5×10^-3mol/L，总体积15mL，在微波消解罐中140℃加热20min。达到指定加热时间后立即加入摩尔量为样品中还原糖摩尔量2倍的邻苯二胺，使其反应立刻终止。3h后，采用固相萃取技术富集，步骤如下：选取官能化聚苯乙烯/二乙烯苯作萃取柱，分别使用4mL甲醇4mL水活化萃取柱，用1mL样品上样，2mL水淋洗，负压抽干4min后用4mL纯甲醇洗脱，将洗脱液在50℃下氮吹至干，流动相定容至1mL，通过0.45μm膜过滤然后进行高分辨质谱分析。图2（A）显示的是经过上述前处理得到的肽-吡咯素pyrraline-Ala，其具有较高的质谱响应信号，从图中可以看出其实际质荷比M⁺=326.1708,理论质荷比M₁ ⁺=326.1710，两者误差小于0.002，因此具有良好的定性说服力。进一步，选羧肽酶A对肽-晚期糖基化终末产物进行酶解，其中羧肽酶A的加入量按照0.1EC unit/0.05μmol底物的标准加入，充分混匀后在30℃下水浴2h，使肽-晚期糖基化终末产物充分水解为游离态（将游离的羧甲基赖氨酸和吡咯素释放出来）。而后通过0.45μm或0.22μm膜除去羧肽酶A，将剩下的溶液取1mL进行质谱定量分析：将得到的游离的晚期糖基化终末产物及反应中间体生成的喹啉，采用LC-MS/MS多扫描模式对反应中间体和晚期糖基化终末产物如羧甲基赖氨酸、吡咯素同时进行定量分析。图3(A)显示出峰单一，干扰较少，说明本发明的除杂富集效果好，通过实验结果表明，吡咯素浓度10ng/mL时，吡咯素的信噪比（RSN）大于10，表明方法的定量限（LOQ）可以达到10ng/mL，且本发明中吡咯素质谱信号响应值能够达到10⁵，信噪比远远大于10。利用羧甲基赖氨酸、吡咯素标准品建立标准曲线，用二羰基化合物标准品与邻苯二胺反应生成喹啉，建立二羰基化合物的标准曲线。且所有标准曲线的回归线的相关系数（R²）均大于0.990，表明目标物浓度和峰面积有很强的线性关系，具有很好的定量基础。

实施例2

采用二肽(N)Lys-Gly(C)与葡萄糖反应，(N)Lys-Gly(C)与葡萄糖在0.2M PBS(磷酸缓冲液，pH=6.8)介质中混合，二肽浓度10^-3mol/L，葡萄糖浓度5×10^-3mol/L，总体积15mL，在微波消解罐中140℃加热20min。达到指定加热时间后立即加入摩尔量为样品中还原糖摩尔量5倍的邻苯二胺，使其反应立刻终止。3h后，采用固相萃取技术富集，步骤如下：分别使用4mL甲醇4mL水活化萃取柱，用1mL样品上样，2mL水淋洗，负压抽干4min后用4mL纯甲醇洗脱，将洗脱液在50℃下氮吹至干，流动相定容至1mL，通过0.45μm膜过滤然后进行高分辨质谱分析。图2(B)显示的是经过上述前处理得到的肽-吡咯素pyrraline-Gly的高分辨率质谱图，其具有较高的质谱响应信号，从图中可以看出其实际质荷比M⁺=312.1552,理论质荷比M₁ ⁺=312.1554，两者误差小于0.002，因此具有良好的定性说服力。进一步，选羧肽酶A对肽-晚期糖基化终末产物进行酶解，其中羧肽酶A的加入量按照2.0EC unit/0.05μmol底物的标准加入，充分混匀后在40℃下水浴5h，使肽-晚期糖基化终末产物充分水解为游离态（将游离的羧甲基赖氨酸和吡咯素释放出来）。而后通过0.22μm膜除去羧肽酶A，将剩下的溶液取1mL进行质谱定量分析。通过酶解肽-晚期糖基化终末产物，将游离的羧甲基赖氨酸和吡咯素释放出来，图3(B)显示出峰单一，干扰较少，说明本发明的除杂富集效果好，吡咯素的信噪比（RSN）大于10，表明方法的定量限（LOQ）可以达到10ng/mL，且本发明中吡咯素质谱信号响应值能够达到10⁵，信噪比远大于10，且标准曲线的回归线的相关系数（R²）大于0.990，具有很好的定量基础。

Claims (4)

1.一种肽-晚期糖基化终末产物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)液体样品中二羰基化合物的消除：在液体样品中加入邻苯二胺，其中邻苯二胺的摩尔量为样品中还原糖或醛类的摩尔量的2-5倍；

(2)通过固相萃取技术对样品进行除杂和肽‐晚期糖基化终末产物的富集，具体步骤：选取官能化聚苯乙烯/二乙烯苯萃取柱，分别使用甲醇和水活化萃取柱，上样，用水淋洗去除杂质，用纯甲醇将肽‐晚期糖基化终末产物洗脱出来；氮吹复溶，最后过膜；

(3)利用高分辨质谱对富集后的肽‐晚期糖基化终末产物定性；所述高分辨质谱采用液相系统为Agilent 1290液相系统，UPLC检测条件为：

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18Column 2.1×150mm

柱温：30℃

流动相：含0.1％甲酸的水：含0.1％甲酸的乙腈＝95：5   0-0.8min

含0.1％甲酸的水：含0.1％甲酸的乙腈＝60：40   8min

含0.1％甲酸的水：含0.1％甲酸的乙腈＝95：5   10-12min

流速：0.2mL/min

进样量：10μL；

(4)利用肽酶对富集后的肽‐晚期糖基化终末产物进行酶解，过膜除去肽酶，得到游离态的晚期糖基化终末产物；

(5)通过质谱分析对游离态的晚期糖基化终末产物进行定量分析，所述质谱采用液相系统为Waters1525机型，检测条件为：

色谱柱：Waters Symmetry C18分析柱250mm×4.6mm

柱温：25℃

流动相：含0.1％甲酸的水：含0.1％甲酸的乙腈＝85：15

流速：0.5mL/min

进样量：10μL。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肽-晚期糖基化终末产物为：

含有赖氨酸残基的肽-AGEs，

含有精氨酸残基的肽-AGEs，

交联在两个赖氨酸残基之间的肽-AGEs，

交联在两个精氨酸残基之间的肽-AGEs，或

交联在一个赖氨酸残基与一个精氨酸残基之间的肽-AGEs。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述肽-晚期糖基化终末产物为肽-羧甲基赖氨酸或肽-吡咯素。

4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述肽酶为羧肽酶A，其中羧肽酶A的加入量按照0.1-2.0EC unit/0.05μmol底物的标准加入，水解条件为30-40℃下水浴2-5h。