KR20190126052A - 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 복합체 형성 방법 - Google Patents

당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 복합체 형성 방법 Download PDF

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후지필름 와코 준야쿠 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 복합체의 양을 증가시키는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명은, "N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당 또는 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 다당을 갖는 수용성 화합물(본 발명에 관한 다당류)의 존재하에, 당쇄를 갖는 물질을 함유하는 시료와 상기 당쇄를 갖는 물질의 당쇄에 친화성을 갖는 렉틴을 접촉시키는, 상기 당쇄를 갖는 물질과 상기 렉틴과의 복합체 형성 방법", 및 "본 발명에 관한 다당류를 함유하여 이루어지는, 당쇄를 갖는 물질과 상기 당쇄를 갖는 물질의 당쇄에 친화성을 갖는 렉틴과의 복합체 형성 촉진제"에 관한 것이다.

Description

당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 복합체 형성 방법
본 발명은, 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 복합체 형성 방법에 관한 것이다.
당쇄는, 동일한 단당 분자 또는 2종류 이상의 단당 분자가 글리코사이드 결합을 통하여 쇄상에 결합한 화합물이다.
당쇄는, 생체 내에서는 단백질이나 지방질과 결합한 복합 당질의 형태로, 주로 세포 표면에 존재한다. 그리고, 세포의 증식, 세균이나 바이러스의 감염, 신경의 신장, 염증, 면역 등의, 생체 내의 중요한 생리 작용에 관여하고 있다.
생체 내에 존재하는 당단백질 등의 당쇄를 갖는 물질에 부가하고 있는, 당쇄의 종류와 그 수는, 통상 일정하다. 그러나, 질병 특이적으로 당쇄가 변화하는 경우가 있어, 그와 같은 당쇄는, 진단의 바이오마커로서 이용되고 있다.
예를 들면, 세포의 암화 및 암의 진행에 따른 당쇄가 변화하는 당쇄나 당단백질이 알려져 있으며, 그들은 종양 마커로서 알려져 있다.
당쇄를 갖는 종양 마커로서는, α-페토프로테인(AFP: 간암 마커), 전립선 특이 항원(prostate specific antigen, PSA: 전립선암 마커), 암태아성 항원(carcinoembryonic antigen, CEA: 대장암 등 마커), CA19-9(carbohydrate antigen 19-9, CA19-9: 췌장암 마커, 소화기암 마커), 포도칼릭신 등이 알려져 있다.
당쇄를 검출·분석하는 방법으로서는, 렉틴을 이용하는 방법이 일반적이다. 렉틴이란, 식물, 동물, 미생물 등에 존재하는 단백질 또는 당단백질 중, 당쇄를 특이적으로 인식하여 결합한다고 하는 성질을 갖는 물질이며, 효소나 항체를 제외한 것의 총칭이다. 렉틴은 당쇄에 대한 특이성이 높기 때문에, 렉틴을 이용하여 당쇄를 갖는 물질을 특이적으로 검출할 수 있다.
렉틴을 이용하여 당쇄나 당쇄를 갖는 물질을 검출하는 방법으로서는, 표면 플라즈몬 공명법, 렉틴 전기 영동법(예를 들면 캐필러리 전기 영동), 렉틴 컬럼법(예를 들면 렉틴 어피니티 크로마토그래피), 렉틴 마이크로어레이법, 불용성 담체에 고정화한 렉틴이나 비오틴 표지(標識)한 렉틴을 이용한 샌드위치법 등의 면역학적 측정 방법 등이 알려져 있다.
특허문헌 1: 일본 특허공보 제4862093호
렉틴은 당쇄의 인식 특이성이 높기는 하지만, 당쇄로의 결합력은, 항체의 당쇄로의 결합력과 비교하여 매우 약한 것이 알려져 있다. 예를 들면, 항원 항체 반응의 해리 상수는 10-9~10-7 정도이지만, 렉틴과 당쇄 간의 해리 상수는 10-7~10-3 정도에 지나지 않는다(Jun Hirabayashi, et al, Chem. Soc. Rev., vol.442, pp.4443-4458, 2013 등). 이로 인하여, 렉틴과 당쇄로, 항원 항체 반응과 같은 강고한 복합체를 형성시키는 것은 어렵다. 그러므로, 렉틴과 당쇄를 갖는 물질의 복합체를 형성시키고, 그 복합체의 양을 측정함으로써 당쇄를 갖는 물질을 측정하는 측정법을 실시한 경우, 얻어지는 복합체의 양이 충분하지 않기 때문에, 만족하는 측정 감도가 얻어지지 않는다는 문제가 있었다.
또한, 일본 특허공보 제4862093호(특허문헌 1)에는, 폴리 음이온성 폴리머의 존재하에, 항체나 렉틴 등의 분석물에 대하여 친화성을 갖는 어피니티 분자와 하전 캐리어 분자와의 복합체를 형성하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 그 문헌에서는, 폴리 음이온성 폴리머의 존재하에 항원 항체 반응을 행하고 있지만, 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 반응에 대해서는 구체적인 개시가 없다. 이로 인하여, 특허문헌 1의 개시 내용으로부터는, 폴리 음이온성 폴리머가 당쇄-렉틴 간의 상호 작용에 어떠한 영향을 미치는지 아닌지에 대해서는, 분명하지 않다.
이상으로부터, 본 발명의 과제는, 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 복합체의 양을 증가시키는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 상기의 문제점을 해결하기 위하여 예의 연구한 결과, 당쇄와 렉틴과의 복합체 형성 반응을, N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당 또는 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 다당을 갖는 수용성 화합물의 존재하에 행함으로써, 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 복합체의 양이 증가하여, 상기의 문제점을 해결할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성했다.
본 발명은, 이하의 구성으로 이루어진다.
(1) N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당 또는 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 다당을 갖는 수용성 화합물의 존재하에, 당쇄를 갖는 물질을 함유하는 시료와 상기 당쇄를 갖는 물질의 당쇄에 친화성을 갖는 렉틴을 접촉시키는, 상기 당쇄를 갖는 물질과 상기 렉틴과의 복합체 형성 방법.
(2) N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당 또는 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 다당을 갖는 수용성 화합물이, 그 렉틴이 친화성을 갖는 당쇄를 갖지 않는 것인, 상기 (1)에 기재된 방법.
(3) N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당 또는 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 다당을 갖는 수용성 화합물이, 덱스트란 황산 혹은 그 염, 또는 콘드로이틴 황산 c 혹은 그 염인, 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 방법.
(4) 하기 (i)~(ii)로부터 선택되는, 상기 (1), (2), (3) 중 어느 한쪽에 기재된 방법
(i) N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당이 덱스트란 황산 또는 그 염이며, 당쇄를 갖는 물질이 α페토프로테인-L3(AFP-L3)이고, 렉틴이 렌즈콩 렉틴이다.
(ii) N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당 또는 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 다당을 갖는 수용성 화합물이 덱스트란 황산 혹은 그 염, 또는 콘드로이틴 황산 c 혹은 그 염이며, 당쇄를 갖는 물질이 α(2,3) 당쇄 유리형 전립선 특이 항원이고, 렉틴이 다릅나무 렉틴(Maackia amurensis Lectin)이다.
(5) N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당 또는 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 다당을 갖는 수용성 화합물을 함유하여 이루어지는, 당쇄를 갖는 물질과 상기 당쇄를 갖는 물질의 당쇄에 친화성을 갖는 렉틴과의 복합체 형성 촉진제.
(6) N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당 또는 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 다당을 갖는 수용성 화합물이, 상기 렉틴이 친화성을 갖는 당쇄를 갖지 않는 것인, 상기 (5)에 기재된 복합체 형성 촉진제.
(7) N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당 또는 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 다당을 갖는 수용성 화합물이, 덱스트란 황산 혹은 그 염, 또는 콘드로이틴 황산 c 혹은 그 염인, 상기 (5) 또는 (6)에 기재된 복합체 형성 촉진제.
(8) 하기 (i)~(ii)로부터 선택되는, 상기 (5), (6), (7) 중 어느 하나에 기재된 복합체 형성 촉진제:
(i) N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당이 덱스트란 황산 또는 그 염이며, 당쇄를 갖는 물질이 α페토프로테인-L3(AFP-L3)이고, 렉틴이 렌즈콩 렉틴이다.
(ii) N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당 또는 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 다당을 갖는 수용성 화합물이, 덱스트란 황산 혹은 그 염, 또는 콘드로이틴 황산 c 혹은 그 염이며, 당쇄를 갖는 물질이 α(2,3) 당쇄 유리형 전립선 특이 항원이고, 렉틴이 다릅나무 렉틴이다.
(9) 상기 (1)에 기재된 방법으로 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 복합체를 형성시킨 후, 상기 복합체의 양을 측정하는, 당쇄를 갖는 물질의 측정 방법.
본 발명의 복합체 형성 방법을 실시함으로써, 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 복합체의 양이 증가한다. 이로 인하여, 본 발명의 복합체 형성 방법을 이용하여, N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당 또는 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 다당을 갖는 수용성 화합물의 존재하에 당쇄를 갖는 물질을 측정하면, 당쇄를 갖는 물질의 고감도의 측정을 행할 수 있다.
또, 본 발명의 복합체 형성 방법은, 당쇄에 대한 렉틴의 친화성을 이용한 모든 반응, 검출, 측정, 당쇄의 분석 등에 이용할 수 있다. 그리고, 검출이나 측정의 감도를 높이는, 고정밀도의 당쇄의 분석이 가능해지는, 당쇄를 갖는 물질을 효율적으로 분리할 수 있는, 등의 효과가 있다.
도 1은 실시예 1에서 얻어진, 덱스트란 황산 나트륨을 함유하는 AFP-L3 용액을 이용하여, 비아코어(Biacore)에 의한 측정으로 얻어진 센서 그램(+)과, 덱스트란 황산 나트륨을 함유하지 않는 AFP-L3 용액을 이용하여, 비아코어(Biacore)에 의한 측정으로 얻어진 센서 그램(◆)이다.
도 2는 실시예 1에서 얻어진, 콘드로이틴 황산 c 나트륨을 함유하는 AFP-L3 용액을 이용하여, 비아코어(Biacore)에 의한 측정으로 얻어진 센서 그램(□)과, 콘드로이틴 황산 c 나트륨을 함유하지 않는 AFP-L3 용액을 이용하여, 비아코어(Biacore)에 의한 측정으로 얻어진 센서 그램(◆)이다.
도 3은 실시예 2 및 실시예 3에서 사용한 마이크로칩의 모식도이다.
도 4는 실시예 2 및 실시예 3에서 사용한 마이크로칩의 칩내 유로의 모식도이다.
도 5는 실시예 2에서 얻어진, 콘드로이틴 황산 c 나트륨의 농도와 복합체 1분획의 피크 면적과의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 6은 실시예 3에서 얻어진, 덱스트란 황산 나트륨의 농도와 복합체 1분획의 피크 면적과의 관계를 나타내는 그래프이다.
[1] 본 발명의 복합체 형성 방법
본 발명의 복합체 형성 방법은, "N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당 또는 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 다당을 갖는 수용성 화합물의 존재하에, 당쇄를 갖는 물질을 함유하는 시료와 그 당쇄를 갖는 물질의 당쇄에 친화성을 갖는 렉틴을 접촉시키는, 그 당쇄를 갖는 물질과 그 렉틴과의 복합체 형성 방법"이다.
"당쇄를 갖는 물질의 당쇄에 친화성을 갖는 렉틴"을, 이하, 간단히 "렉틴"이라고 기재하는 경우가 있다.
N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당
본 발명에 관한 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당으로서는, 일반적으로 다당이라고 하는 것이며, 구성당으로서 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는, 수용성인 것을 들 수 있다.
예를 들면, 1종류의 단당이 글리코사이드 결합에 의하여 다수 중합한 호모 다당(단순 다당), 복수 종의 단당이 글리코사이드 결합에 의하여 다수 중합한 헤테로 다당(복합 다당), 또는 당알코올 등이며, 구성당으로서 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는, 수용성인 것을 들 수 있다.
수용성의 호모 다당(단순 다당)이며, 구성당으로서 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 것으로서는, 덱스트란, 아가로스, 카라지난, 덱스트란 황산, 카복시메틸 덱스트란, 푸코이단, 후노란, 키토산, 및 이러한 유도체 등을 들 수 있다.
수용성의 헤테로 다당(복합 다당)이며, 구성당으로서 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 것으로서는, 포피란, 글루코만난, 알진산, 잔탄 검, 및 이러한 유도체 등을 들 수 있다.
수용성의 당알코올이며, 구성당으로서 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 것으로서는, 에리트리톨, 자일리톨, 및 이러한 유도체 등을 들 수 있다.
이러한 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당 중에서도 수용성의 호모 다당이 바람직하고, 덱스트란 황산 및 그 유도체가 보다 바람직하며, 덱스트란 황산이 특히 바람직하다.
본 발명에 관한 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당은, 예를 들면 리튬염, 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염, 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리 토류 금속염, 암모늄염, 트라이에틸아민염, 다이메틸아민염 등의 유기 아민염이어도 된다.
그 바람직한 염은, 다당 또는 다당을 갖는 화합물의 종류에 따라서 다르지만, 나트륨염이 바람직하고, 덱스트란 황산 나트륨이 보다 바람직하다.
또, 본 발명에 관한 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당의 분자량은, 수백~수백만, 바람직하게는 약 1,000~1,000,000, 보다 바람직하게는 약 5,000~500,000이다.
N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 다당을 갖는 수용성 화합물
본 발명에 관한 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 다당을 갖는 수용성 화합물로서는, 다당에 단백질이나 지방질이 결합한 이른바 복합 당질이며, 그 다당 부분의 구성당으로서 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는, 수용성인 것을 들 수 있다.
예를 들면 글리코스아미노글리칸에 단백질이 결합한 프로테오글리칸 등의 복합 당질이며, 그 글리코스아미노글리칸 부분의 구성당으로서 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는, 수용성인 것을 들 수 있다.
그와 같은 수용성의 프로테오글리칸으로서는, 콘드로이틴 황산 a, 콘드로이틴 황산 b, 콘드로이틴 황산 c, 콘드로이틴 황산 d, 콘드로이틴 황산 e 등의 콘드로이틴 황산, 및 이러한 유도체 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 콘드로이틴 황산 c 및 그 유도체가 바람직하고, 콘드로이틴 황산 c가 특히 바람직하다.
본 발명에 관한 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 다당을 갖는 수용성 화합물은, 예를 들면 리튬염, 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염, 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리 토류 금속염, 암모늄염, 트라이에틸아민염, 다이메틸아민염 등의 유기 아민염이어도 된다.
그 바람직한 염은, 다당 또는 다당을 갖는 화합물의 종류에 따라서 다르지만, 나트륨염이 바람직하다. 예를 들면, 콘드로이틴 황산 나트륨이 바람직하고, 콘드로이틴 황산 c 나트륨이 보다 바람직하다.
또, 본 발명에 관한 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 다당을 갖는 수용성 화합물의 분자량은, 수백~수백만, 바람직하게는 약 1,000~1,000,000, 보다 바람직하게는 약 5,000~500,000이다.
본 발명에 관한 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당 또는 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 다당을 갖는 수용성 화합물로서는, "그 존재하에 당쇄를 갖는 물질과 렉틴을 접촉시켜 반응시킬 때에, 그 반응 시의 조건하에서, 그 반응액 중에서 균일한 용해 상태가 되는 정도의, 충분한 수용성을 나타내는 것"이 선택된다. 그 바람직한 구체예는, 상기한 바와 같다.
또한, "N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당 또는 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 다당을 갖는 수용성 화합물"을 일괄하여, 이하 "본 발명에 관한 다당류"라고 기재하는 경우가 있다.
당쇄를 갖는 물질
본 발명에 관한 "당쇄를 갖는 물질"은, "렉틴이 친화성을 갖는(결합하는) 당쇄 구조를 갖는 당쇄"를 갖는 물질이면 되고, 특별히 한정되지 않는다.
당쇄를 갖는 물질의 구체예로서는, 예를 들면 AFP, PSA, CA19-9, CA125, PIVKA-II, 포도칼릭신 등의 종양 마커, α1-글로불린, α2-글로불린, β-글로불린, γ-글로불린, 페투인 등의 혈청 단백질, 콜라겐 등의 섬유 단백질, 고나도트로핀, 인간 융모 성선 자극 호르몬(hCG), 황체 형성 호르몬(LH), 난포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH) 등의 호르몬류, 리보뉴클레아제, 타카아밀라제, γ-글루타밀트랜스페라제(γ-GTP), 알칼리성 포스파타제, 콜린에스테라제, 라이소자임 등의 효소류, 피브로넥틴, 프로테오글리칸 등의 세포 간 물질, α1-산성 당단백질, α1-안티트립신, α2-매크로글로불린, α2-HS 당단백질, 트랜스페린, 합토글로빈, 세룰로플라스민, 암태아성 항원(CEA), 면역 글로블린(IgG, IgM, IgA, IgD, IgE), 보체 성분(C1, C1q, C1r, C1s, C4, C2, C3, C5, C6, C7, C8, C9), 인터페론, 혈액 응고 인자(피브리노겐, 프로트롬빈, V 인자, VII 인자, IX 인자, X 인자, XI 인자, XII 인자, XIII 인자 등), 안티트롬빈 III, 에리트로포이에틴, 다능성 줄기 세포(ES 세포, iPS 세포 등)의 미분화 마커(SSEQ-1, SSEA-3/4, 포도칼릭신 등) 등을 들 수 있다.
본 발명에 관한 당쇄를 갖는 물질로서는 AFP, PSA, 포도칼릭신이 바람직하고, AFP 및 PSA가 보다 바람직하다.
본 발명에 관한 당쇄를 갖는 물질에는, 렉틴이 친화성을 갖는 당쇄 구조를 갖는 "당쇄"도 포함된다. 예를 들면, 아밀로스, 아밀로펙틴, 셀룰로스, 글리코젠 등을 들 수 있다. 마우스 ES 세포 등의 미분화 줄기 세포로 발현이 확인되어 있는 Lewis X (Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNac)나, 당단백질 등으로부터 유리한 당쇄의 단편 등도, 본 발명에 관한 당쇄를 갖는 물질에 포함된다. 바람직하게는, Lewis X (Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNac)를 들 수 있다.
본 발명에 관한 "당쇄를 갖는 물질"에 관한 당쇄로서는, 렉틴이 친화성을 갖는 당쇄 구조를 갖는 것을 들 수 있다.
예를 들면, 상기한 당쇄를 갖는 물질이 갖는 당쇄를 들 수 있다. 또, 그 일례로서, 암 환자의 혈액 중 등에 관찰되는 당쇄를 들 수 있다.
그 구체예로서는, 예를 들면
(1) 푸코스가 부가된 당쇄: 간암 환자에게서 관찰되는, APF-L3의 당쇄인 Fucα1→6GlcNac(코어 푸코스)(Kobayashi Y. et al., J. Biol. Chem., vol.287, No.41, pp.33973-33982, October 5, 2012) 등,
(2) 말단에 시알산이 부가된 당쇄: 간암 환자에게서 관찰되는, PSA의 당쇄인 Siaα2→3Gal(Chikara Oyama et al., Glycobiology, vol.14, No.8, pp.671-679, 2004, Yoneyama T. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., vol.448, No.4, pp.390-396, 2014, Tomokazu Ishikawa et al., J. Urology, vol.196, p.e331) 등,
(3) N-아세틸갈락토사민이 부가된 당쇄: 간암 환자에게서 관찰되는, PSA의 당쇄인 GalNacβ1-R(일본 특허공보 제5630757, Takatoshi Kaya, et al., Anal. Chem., vol.87, No.3, pp.1797-1803, 2015) 등을 들 수 있다.
예를 들면, AFP는 간(肝) 세포암 마커이지만, 간 세포암뿐만 아니라 만성 간염이나 간경변에서도 혈중 농도가 고가(高價)를 나타낸다. 그러나, 간 세포암 환자의 혈청 중에는, 당쇄에 α-L-푸코스 잔기나 N-아세틸글루코사민 잔기(이분(bisecting) N-아세틸글루코사민)가 부가한 당쇄(Fucα1→6GlcNac)를 갖는 AFP(AFP-L3)가 고빈도로 관찰되는 것이 확인되어 있다.
또, PSA는 전립선암 마커로서 알려져 있다. 정상자의 혈청 중에 관찰되는 PSA는, 대부분이 당쇄의 말단 시알산 잔기가 당쇄의 말단으로부터 2번째의 갈락토스 잔기에 α(2,6) 결합한 N형 당쇄를 갖는 PSA이다. 그러나, 전립선암 환자의 혈청 중에는, 당쇄의 말단 시알산 잔기가 당쇄의 말단으로부터 2번째의 갈락토스 잔기에 α(2,3) 결합한 당쇄(Siaα2→3Gal)를 갖는 PSA(이하, "α(2,3) 당쇄 PSA"라고 기재함)가 증가하는 것이 알려져 있다(Tajiri M. et al., 2008, vol.18, pp.2-8).
당쇄의 말단 시알산 잔기가 당쇄의 말단으로부터 2번째의 갈락토스 잔기에 α(2,3) 결합한 당쇄(Siaα2→3Gal)란, 구체적으로는 이하의 구조를 말한다.
Figure pct00001
α(2,3) 당쇄 PSA의 당쇄의 구조의 일례를 하기 식 (I)에 나타낸다.
Figure pct00002
또, 세포의 미분화 마커나 분화 마커로서 알려져 있는 당단백질의 당쇄도 본 발명에 관한 당쇄를 갖는 물질로서 들 수 있다.
예를 들면, 최근 ES 세포, iPS 세포 등의 다능성 줄기 세포의 세포 표면에 존재하는 것이 분명해진 당쇄 구조인, (Fucα1-2Galβ1-3GlcNac)나 (Fucα1-2Galβ1-3GalNac)를 들 수 있다. 또, 그 당쇄 구조를 갖는 미분화 당쇄 마커로서, 복합 당질인 포도칼릭신(Podocalyxin)이 동정(同定)되어 있다(WO2013/065302호).
당쇄를 갖는 물질을 함유하는 시료
본 발명에 관한 당쇄를 갖는 물질을 함유하는 시료로서는, 예를 들면 혈액, 혈청, 혈장, 요(尿), 정액, 골수액, 타액, 땀, 복수(復水), 분편현탁액(糞便懸濁液), 조직 추출액, 조직 절편, 조직 생검 시료, 기관 등의, 인간이나 동물 등의 생체 유래 시료, 또는 이러한 생체 유래 시료로부터 조제된 것, 바이러스, 세균, 세포 등의 미생물 또는 이들로부터 조제된 것을 들 수 있다.
이들 중에서도, 혈액, 혈청, 또는 혈장이 바람직하고, 혈청이 보다 바람직하다.
세포 추출액, 상기 미생물 유래의 추출액, 또는 그 추출액으로부터 조제된 것도 본 발명에 관한 당쇄를 갖는 물질을 함유하는 시료로서 이용할 수 있다.
또, 상기 세균, 세포 등의 중에는, 당단백질을 분비하는 것이 있다. 또, 세포막 등에 존재하는 당단백질로부터 당쇄가 유리하는 경우도 있다. 이로 인하여, 상기의 생체 유래 시료나 미생물의 배양액도, 본 발명에 관한 당쇄를 갖는 물질을 함유하는 시료로서 이용할 수 있다.
본 발명에 관한 당쇄를 갖는 물질을 함유하는 시료는, 물이나 적당한 완충액에 희석하여 이용해도 된다.
그를 위하여 이용되는 물로서는, 예를 들면 증류수, 탈이온수 등의 정제수 등을 들 수 있다.
완충액으로서는, 예를 들면 트리스 완충액, 인산 완충액, 베로날 완충액, 붕산 완충액, 굿(good) 완충액, Tris-HCl 완충액, MES 완충액, HEPES 완충액, 인산 완충액 등을 들 수 있다. 이들 완충액의 완충제 농도로서는, 통상 5~1,000mM, 바람직하게는 5~300mM의 범위로부터 적절히 선택된다. 그 pH도 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 5~9의 범위를 들 수 있다.
또한, 본 명세서에서는, "당쇄를 갖는 물질을 함유하는 시료"와 "당쇄를 갖는 물질"을 특별히 구별하지 않고 이용하고 있는 경우가 있다. 즉, 본 명세서에 있어서 단순히 "당쇄를 갖는 물질을 함유하는 시료"라고 기재한 경우, "당쇄를 갖는 물질"의 의미를 포함하는 경우가 있다.
렉틴
본 발명에서 이용되는 렉틴은, 복합체를 형성하는 대상이 되는 당쇄를 갖는 물질의 당쇄에 친화성을 갖고, 그 당쇄를 인식하여 그 당쇄에 결합하는 렉틴이면 되고, 그와 같은 성질을 갖는 렉틴을, 기지(旣知)의 렉틴으로부터 임의로 선택하면 된다. 그 중에서도, 그 당쇄에 특이적으로 결합하는 렉틴이 바람직하다.
렉틴의 유래는 한정되지 않고, 동물, 식물, 진균류 세균, 바이러스 등에서 유래하는 렉틴이어도 된다. 또, 천연 유래 렉틴이어도 되고, 리캄버넌트 품(品)이어도 되며, 시판되고 있는 렉틴이어도 된다.
렉틴의 구체예로서는, 예를 들면 노랑들콩 렉틴(LTL), 완두콩 렉틴(PSA), 렌즈콩 렉틴(Lens culinaris agglutinin: LCA), 울렉스 오이로패우스 렉틴(UEA-1), 누룩곰팡이 렉틴(AOL), 들주발버섯 렉틴(AAL), 머시룸 렉틴(ABA), 잭칼린 렉틴(Jacalin), 땅콩 렉틴(PNA), 등나무 렉틴(WFA), 줄맨드라미 렉틴(ACA), 오세이지 오렌지 렉틴(MPA), 식용 달팽이 렉틴(HPA), 헤어리 베치 렉틴(VVA), 말콩 렉틴(DBA), 대두 렉틴(SBA), 그리포니아 심플리시폴리아 렉틴(GSL-I, GSL-IA4, GSL-II, GSL-IB4), 날개콩 렉틴(PTL-I), 강낭콩 렉틴(PHA-E, PHA-L), 난초나무 렉틴(BPL), 딱총나무 렉틴(SNA), 덧나무 렉틴(SSA), 하늘타리 렉틴(TJA-II, TJA-I), 다릅나무 렉틴(Maackia amurensis Lectin, MAA, MAH), 밀배아 렉틴(WGA), 독말풀 렉틴(DSA), 토마토 렉틴(LEL), 감자 렉틴(STL), 쐐기풀 렉틴(UDA), 미국자리공 렉틴(PWM), 닭벼슬나무 렉틴(ECA), 피마자 렉틴(RCA120), 나팔수선화 렉틴(NPA), 작두콩 렉틴(ConA), 설강화 렉틴(GNA), 아마릴리스 렉틴(HHL), 유럽회나무 렉틴(EEL) 등을 들 수 있다.
또, 다능성 줄기 세포의 미분화 마커가 갖는 당쇄를 인식하는 렉틴을 들 수 있다. 예를 들면, 다능성 줄기 세포의 미분화 마커로서 알려지는 포도칼릭신이 갖는 당쇄인 (Fucα1-2Galβ1-3GlcNac)나 (Fucα1-2Galβ1-3GalNac)를 인식하는 렉틴인, BC2LCN을 들 수 있다(Tateno H, et al., J. Biol. Chem., vol.286, No.23, pp.20345-20353, 2011). BC2LCN은, 그람 음성 세균(Burkholderia cenocepacia) 유래의 BC2L-C 단백질의 N 말단 도메인에 대응한 렉틴이다(GenBank Accession No. YP_002232818).
본 발명에서 이용되는 렉틴으로서는, LCA, MAA, 또는 BC2LCN이 바람직하고, LCA 또는 MAA가 보다 바람직하다.
하기 표 1에, 본 발명에서 이용되는 렉틴의 예와, 각각의 렉틴의 유래(Origin), 그 렉틴이 친화성을 갖는 당쇄 구조(Specificity)의 예를 아울러 나타낸다.
[표 1]
Figure pct00003
렉틴은, 검출 가능한 표지 물질로 표지되어 있어도 된다.
렉틴을 표지하기 위하여 이용되는 표지 물질로서는, 예를 들면 형광 색소(플루오레세인아이소싸이오사이아네이트(FITC), Cy5, Alexa Fluor 647 등), 효소(서양 고추냉이 유래 퍼옥시다제), 보효소, 화학 발광 물질, 방사성 물질(32P, 14C, 125I, 3H, 131I 등), 비오틴 등의 표지 물질을 들 수 있다. 또, 표지 물질은 직접 렉틴에 결합시켜도 되고, 적당한 스페이서를 통하여 결합시켜도 된다.
렉틴은, 표지 물질의 종류에 따른 자체 공지의 표지 방법으로, 표지하면 된다.
또한 렉틴은 불용성 담체 등의 고상(固相)으로 고정화되어 있어도 된다. 고상으로서 이용되는 불용성 담체로서는, 통상 이 분야에서 이용되는 담체이면 어느 쪽도 사용 가능하다. 그 형상은, 예를 들면 입자(라텍스 입자, 비즈, 자기 비즈 등), 튜브, 카본 나노 튜브, 칩, 디스크상편(狀片), 미립자, 박막, 미세관, 플레이트, 마이크로 플레이트, 필터 등의 통상 이 분야에서 이용되는 형상이면 되고, 그 재질도 특별히 한정되지 않는다.
또, 렉틴을 기판에 고정화하여 제작된 마이크로칩, 마이크로어레이, 매크로어레이, 마이크로타이터 플레이트도, 본 발명에 이용할 수 있다.
렉틴을 불용성 담체에 고정화하는 방법으로서는, 사용하는 불용성 담체의 종류에 따른 자체 공지의 고정화 방법을 들 수 있다.
본 발명의 복합체 형성 방법
본 발명의 복합체 형성 방법은, 최종적으로 "본 발명에 관한 다당류를 함유하는, 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 복합체"가 얻어지는 방법이면 된다. 본 발명에 관한 다당류의 존재하에, 당쇄를 갖는 물질을 함유하는 시료와 그 당쇄를 갖는 물질의 당쇄에 친화성을 갖는 렉틴을 접촉시키는 방법이며, 최종적으로 "본 발명에 관한 다당류를 함유하는, 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 복합체의 용액"이 얻어지는 방법이 바람직하다.
본 발명의 복합체 형성 방법으로서는, 구체적으로는 예를 들면,
(i) 당쇄를 갖는 물질을 함유하는 시료를, 본 발명에 관한 다당류 또는 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액과 혼합하여 혼합액을 얻은 후, 얻어진 혼합액을, 그 당쇄를 갖는 물질의 당쇄에 친화성을 갖는 렉틴 또는 그 렉틴을 함유하는 용액과 혼합하여 반응시키는 방법,
(ii) 당쇄를 갖는 물질의 당쇄에 친화성을 갖는 렉틴 또는 그 렉틴을 함유하는 용액을, 본 발명에 관한 다당류 또는 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액과 혼합하여 혼합액을 얻은 후, 얻어진 혼합액을, 당쇄를 갖는 물질을 함유하는 시료와 혼합하여 반응시키는 방법,
(iii) 당쇄를 갖는 물질을 함유하는 시료를 본 발명에 관한 다당류 또는 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액과 혼합하여 혼합액을 얻은 후, 얻어진 혼합액을, 그 당쇄를 갖는 물질의 당쇄에 친화성을 갖는 렉틴과 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액과 혼합하여 반응시키는 방법,
(iv) 당쇄를 갖는 물질을 함유하는 시료를, 그 당쇄를 갖는 물질의 당쇄에 친화성을 갖는 렉틴 또는 그 렉틴을 함유하는 용액과 혼합하여 반응시킨 후, 얻어진 반응액을, 본 발명에 관한 다당류 또는 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액과 혼합하여 혼합액을 얻는 방법, 등을 들 수 있다.
본 발명의 복합체 형성 방법에 있어서는, 본 발명에 관한 다당류의 존재하에, 당쇄를 갖는 물질의 당쇄와 렉틴이 반응하여, 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 복합체를 형성한다.
즉, 상기 방법에 있어서 "반응"이란, 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 복합체 형성 반응을 가리킨다.
상기 방법 중에서도, (i)~(iii) 방법이 바람직하고, (i) 또는 (iii) 방법이 보다 바람직하다.
본 발명의 복합체 형성 방법을 자동 분석 장치를 이용하여 행하는 경우에는, 사용하는 시액 중 어느 한쪽에 본 발명에 관한 다당류를 함유시키면 된다. 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액을, 자동 분석 장치의 시약을 넣는 셀 1개에 세팅하여 이용해도 된다. 그리고, 자동 분석 장치를 이용한 측정에 있어서, 당쇄를 갖는 물질과 렉틴을, 본 발명의 다당류의 존재하에서 접촉시켜, 당쇄를 갖는 물질의 당쇄와 렉틴을 반응시키면 된다.
본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액에 이용되는 용매로서는, 물 또는 완충액 등을 들 수 있다.
렉틴을 함유하는 용액에 이용되는 용매로서는, 예를 들면 완충액을 들 수 있다.
본 발명에 관한 다당류와 렉틴을 함유하는 용액에 이용되는 용매로서는, 예를 들면 완충액을 들 수 있다.
본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액에 이용되는 물로서는, 예를 들면 증류수, 탈이온수 등의 정제수 등을 들 수 있다.
본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액, 렉틴을 함유하는 용액, 및 렉틴과 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액에 이용되는 완충액의 구체예로서는, 예를 들면 트리스 완충액, 인산 완충액, 베로날 완충액, 붕산 완충액, 굿 완충액, Tris-HCl 완충액, MES 완충액, HEPES 완충액, 인산 완충액 등을 들 수 있다. 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 복합체 형성 반응을, 시판 중인 키트나, 자동 분석 장치 등의 측정 기기를 이용하여 행하는 경우에는, 키트에 첨부된 완충액, 자동 분석 장치 전용 완충액 등(예를 들면, 후술하는 비아코어TM용 HBS-EP 버퍼 등)을 이용해도 된다.
또, 이들 완충액의 완충제 농도로서는, 통상 5~1,000mM, 바람직하게는 5~300mM의 범위로부터 적절히 선택된다. 그 pH도 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 5~9의 범위를 들 수 있다.
또, 이들 완충액에는, 통상 이 분야에서 이용되는 시약류, 예를 들면 완충제, 반응 촉진제, 단백질, 염류, 계면활성제 등의 안정화제, 방부제 등이며, 공존하는 시약 등의 안정성을 저해하거나 하지 않고, 당쇄와 렉틴과의 반응을 저해하지 않는 것이 포함되어 있어도 된다. 또 그 농도도, 통상 이 분야에서 통상 이용되는 농도 범위로부터 적절히 선택하면 된다.
당쇄를 갖는 물질을 함유하는 용액에 이용되는 용매의 구체예 및 그 조건 등은, 상기한 바와 같다.
본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액 중의 본 발명에 관한 다당류의 농도, 렉틴을 함유하는 용액 중의 렉틴의 농도, 및 당쇄를 갖는 물질을 함유하는 시료 중의 당쇄를 갖는 물질의 농도는, 본 발명에 관한 다당류의 존재하에 당쇄를 갖는 물질과 렉틴을 접촉시켜, 반응시켰을 때의 반응액 중의 농도가 각각 목적의 농도 범위 내가 되는 농도이면 된다.
예를 들면, 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액 중의 본 발명에 관한 다당류의 농도는, 0.01(w/v)%~50(w/v)%, 바람직하게는 0.1(w/v)%~25(w/v)%, 보다 바람직하게는 0.5(w/v)%~15(w/v)%, 더 바람직하게는 0.5~10(w/v)%이다.
렉틴을 함유하는 용액 중의 렉틴의 농도는, 1μg/mL~30mg/mL, 바람직하게는 10μg/mL~20mg/mL, 보다 바람직하게는 1~10mg/mL이다.
당쇄를 갖는 물질을 함유하는 시료 중의 당쇄를 갖는 물질의 농도는, 1pg/mL~1mg/mL, 바람직하게는 10pg/mL~100μg/mL, 보다 바람직하게는 1ng~50μg/mL이다.
본 발명의 복합체 형성 방법에 있어서, 본 발명에 관한 다당류의 존재하에 당쇄를 갖는 물질과 렉틴을 접촉시켜, 반응시켰을 때의, 반응액 중의 본 발명에 관한 다당류의 농도는, 사용하는 본 발명에 관한 다당류의 종류나, 그 후에 행하는 측정법, 분석법 등에 따라 다르지만, 0.01(w/v)%~50(w/v)%, 바람직하게는 0.1(w/v)%~25(w/v)%, 보다 바람직하게는 0.5(w/v)%~15(w/v)%, 더 바람직하게는 0.5~10(w/v)%이다.
후술하는 캐필러리 전기 영동 장치의 마이크로 유로 내에서 당쇄를 갖는 물질과 렉틴을 반응시키는 경우는, 마이크로 유로 내에서의 본 발명에 관한 다당류의 농도는, 0.01(w/v)%~50(w/v)%, 바람직하게는 0.1(w/v)%~25(w/v)%, 보다 바람직하게는 1(w/v)%~15(w/v)%, 더 바람직하게는 4~10(w/v)%이다.
렉틴의 그 반응액 중의 농도는, 1μg/mL~30mg/mL, 바람직하게는 10μg/mL~20mg/mL, 보다 바람직하게는 1~10mg/mL이다.
당쇄를 갖는 물질의 그 반응액 중의 농도는, 1pg/mL~1mg/mL, 바람직하게는 10pg/mL~100μg/mL, 보다 바람직하게는 1ng~50μg/mL이다
또한, 상기 방법 (iii)의 경우에는, 최종적으로 얻어진 "본 발명에 관한 다당류를 함유하는, 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 복합체의 용액" 중의 본 발명에 관한 다당류의 농도, 렉틴의 농도, 및 당쇄를 갖는 물질의 농도가, 각각 상기한 목적의 농도 범위 내가 되면 된다.
당쇄를 갖는 물질을 함유하는 시료와 렉틴을 접촉시키고 반응시키는 조건, 및 본 발명에 관한 다당류의 존재하에 당쇄를 갖는 물질을 함유하는 시료와 렉틴을 접촉시키고 반응시키는 조건으로서는, 당쇄를 갖는 물질의 당쇄와 렉틴이 충분히 반응하고, 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 복합체를 형성할 수 있는 조건이면 된다.
예를 들면, 당쇄를 갖는 물질을 함유하는 시료와 렉틴과의 반응 시의 온도는, 당쇄를 갖는 물질의 당쇄와 렉틴과의 반응을 억제하지 않는 범위이면 특별히 한정되지 않고, 10~50℃, 바람직하게는 20~40℃의 범위를 들 수 있다. 또, 그 반응 시간은, 이용되는 렉틴과 pH 및 온도 등의 반응 조건에 따라 다르다. 예를 들면 1~60분, 바람직하게는 1~15분 정도로 반응시키면 된다.
본 발명의 복합체 형성 방법에 이용되는, 본 발명에 관한 다당류와 렉틴의 선택 방법은 이하와 같다.
즉, 본 발명의 복합체 형성 방법에 이용되는 본 발명에 관한 다당류는, 본 발명의 복합체 형성 방법에 이용되는 렉틴이 친화성을 갖는 당쇄 구조를 갖지 않는 것을 선택한다. 즉, 어느 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 복합체를 형성시키는 경우, 그 당쇄를 갖는 물질의 당쇄에 친화성을 갖고, 그 당쇄를 인식하여 결합하는 렉틴을 선택한다. 그리고, 본 발명에 관한 다당류로서는, 선택한 그 렉틴이 친화성을 갖는 당쇄 구조를 갖지 않는 것을 선택한다.
예를 들면, 어느 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 복합체를 형성시키는 경우에 있어서, 상기 표 1에 기재된 렉틴을 선택한 경우, 본 발명에 관한 다당류로서는, 표 1에 기재된 그 렉틴이 친화성을 갖는 당쇄 구조(Specificity)를 갖지 않는, 본 발명에 관한 당쇄를 선택한다.
구체적인 예를 들면, 예를 들면 변이 당쇄(Fucα1→6GlcNAc)를 갖는 AFP(AFP-L3)와 렉틴과의 복합체를 형성시키는 경우, 이 변이 당쇄(Fucα1→6GlcNAc)에 친화성을 갖는 렉틴으로서, 예를 들면 LCA를 이용할 수 있다. 이 경우, AFP-L3과 LCA의 접촉 시(반응 시)에 공존시키는 본 발명에 관한 다당류로서, LCA가 친화성을 갖는 당쇄(Fucα1→6GlcNAc, α-Man)를 갖지 않는 것을 선택한다. 그와 같은 본 발명에 관한 다당류로서는, 예를 들면 덱스트란 황산, 콘드로이틴 황산, 또는 이들의 염(예를 들면 덱스트란 황산 나트륨, 콘드로이틴 황산 c 나트륨) 등을 들 수 있다.
덱스트란 황산은, 글루코스가 1,6 결합에 의하여 중합한 덱스트란의 일부가 황산화된 구조를 갖는다. 콘드로이틴 황산은, D-글루쿠론산(GlcUA)과 N-아세틸-D-갈락토사민(GalNAc)의 2당이 반복되는 당쇄에 황산이 결합한 구조를 갖는다. 그러나, 덱스트란 황산도 콘드로이틴 황산도, LCA가 친화성을 갖는 당쇄(Fucα1→6GlcNAc, α-Man)를 갖지 않는다.
예를 들면, 변이 당쇄(Siaα2→3Gal)를 갖는 PSA와 렉틴과의 복합체를 형성하는 경우, 당쇄(Siaα2→3Gal)에 친화성을 갖는 렉틴으로서, 예를 들면 MAA를 이용할 수 있다. 이 경우, PSA와 MAA의 반응 시에 공존시키는 본 발명에 관한 다당류는, MAA가 친화성을 갖는 당쇄(Siaα2→3Galβ1→4GlcNAc)를 갖지 않는 것을 선택한다. 그와 같은 본 발명에 관한 다당류로서는, 예를 들면 덱스트란 황산, 콘드로이틴 황산, 또는 이들의 염(예를 들면 덱스트란 황산 나트륨, 콘드로이틴 황산 c 나트륨 등)을 들 수 있다.
세포 표면에 미분화 마커인 (Fucα1-2Galβ1-3GlcNac) 및/또는 (Fucα1-2Galβ1-3GalNac)을 갖는 다능성 줄기 세포와 렉틴과의 복합체를 형성시키는 경우, 그 당쇄에 친화성을 갖는 렉틴으로서, 예를 들면 BC2LCN을 이용할 수 있다. 이 경우, 다능성 줄기 세포와 BC2LCN의 접촉 시(반응 시)에 공존시키는 본 발명에 관한 다당류는, BC2LCN이 친화성을 갖는 당쇄인 (Fucα1-2Galβ1-3GlcNac)를 갖지 않고, (Fucα1-2Galβ1-3GalNac)도 갖지 않는 것을 선택한다. 그와 같은 본 발명에 관한 다당류로서는, 예를 들면 덱스트란 황산, 콘드로이틴 황산, 또는 이들의 염(예를 들면 덱스트란 황산 나트륨, 콘드로이틴 황산 c 나트륨 등)을 들 수 있다.
본 발명의 복합체 형성 방법의 구체예를 이하에 나타내지만, 이것에 한정되지 않는다.
(i) 1pg/mL~1mg/mL의 AFP-L3을 함유하는 혈청 등의 시료를, 0.01(w/v)%~50(w/v)%의 덱스트란 황산 나트륨을 함유하는 5~1000mM Tris-HCl 완충액(pH5~9) 등의 완충액과 혼합하여 혼합액을 얻는다. 얻어진 혼합액을, 1μg/mL~30mg/mL의 LCA와 0.01(w/v)%~50(w/v)%의 덱스트란 황산 나트륨을 함유하는 5~1000mM Tris-HCl 완충액(pH5~9) 등의 완충액과 혼합하여, 10~50℃에서 1~60분간 반응시킨다. 그 반응액 중의 AFP-L3의 농도는 1pg/mL~1mg/mL, 덱스트란 황산 나트륨의 농도는 0.01(w/v)%~50(w/v)%, LCA의 농도는 1μg/mL~30mg/mL이다.
(ii) 1pg/mL~1mg/mL의 AFP-L3을 함유하는 혈청 등의 시료를, 0.01(w/v)%~50(w/v)%의 콘드로이틴 황산 c 나트륨을 함유하는 5~1000mM Tris-HCl 완충액(pH5~9) 등의 완충액과 혼합하여 혼합액을 얻는다. 얻어진 혼합액을, 1μg/mL~30mg/mL의 LCA와 0.01(w/v)%~50(w/v)%의 콘드로이틴 황산 c 나트륨을 함유하는 5~1000mM Tris-HCl 완충액(pH5~9) 등의 완충액과 혼합하여, 10~50℃에서 1~60분간 반응시킨다. 그 반응액 중의 AFP-L3의 농도는 1pg/mL~1mg/mL, 콘드로이틴 황산 c 나트륨의 농도는 0.01(w/v)%~50(w/v)%, LCA의 농도는 1μg/mL~30mg/mL이다.
(iii) 1pg/mL~1mg/mL의 α(2,3) 당쇄 유리형 PSA를 함유하는 혈청 등의 시료를, 0.01(w/v)%~50(w/v)%의 덱스트란 황산 나트륨을 함유하는 5~1000mM Tris-HCl 완충액(pH5~9) 등의 완충액과 혼합하여 혼합액을 얻는다. 얻어진 혼합액을, 1μg/mL~30mg/mL의 MAA와 0.01(w/v)%~50(w/v)%의 덱스트란 황산 나트륨을 함유하는 5~1000mM Tris-HCl 완충액(pH5~9) 등의 완충액과 혼합하여, 10~50℃에서 1~60분간 반응시킨다. 그 반응액 중의 α(2,3) 당쇄 유리형 PSA의 농도는 1pg/mL~1mg/mL, 덱스트란 황산 나트륨의 농도는 0.01(w/v)%~50(w/v)%, MAA의 농도는 1μg/mL~30mg/mL이다.
(iv) 1pg/mL~1mg/mL의 α(2,3) 당쇄 유리형 PSA를 함유하는 혈청 등의 시료를, 0.01(w/v)%~50(w/v)%의 콘드로이틴 황산 c 나트륨을 함유하는 5~1000mM Tris-HCl 완충액(pH5~9) 등의 완충액과 혼합하여 혼합액을 얻는다. 얻어진 혼합액을, 1μg/mL~30mg/mL의 MAA와 0.01(w/v)%~50(w/v)%의 콘드로이틴 황산 c 나트륨을 함유하는 5~1000mM Tris-HCl 완충액(pH5~9) 등의 완충액과 혼합하여, 10~50℃에서 1~60분간 반응시킨다. 그 반응액 중의 α(2,3) 당쇄 유리형 PSA의 농도는 1pg/mL~1mg/mL, 콘드로이틴 황산 c 나트륨의 농도는 0.01(w/v)%~50(w/v)%, MAA의 농도는 1μg/mL~30mg/mL이다.
(v) 1pg/mL~1mg/mL의 AFP-L3을 함유하는 혈청 등의 시료를, 1μg/mL~30mg/mL의 LCA와 0.01(w/v)%~50(w/v)%의 덱스트란 황산 나트륨 또는 콘드로이틴 황산 c 나트륨을 함유하는 5~1000mM Tris-HCl 완충액(pH5~9) 등의 완충액과 혼합하여, 10~50℃에서 1~60분간 반응시킨다. 그 반응액 중의 AFP-L3의 농도는 1pg/mL~1mg/mL, 덱스트란 황산 나트륨 또는 콘드로이틴 황산 c 나트륨의 농도는 0.01(w/v)%~50(w/v)%, LCA의 농도는 1μg/mL~30mg/mL이다.
(vi) 1pg/mL~1mg/mL의 α(2,3) 당쇄 유리형 PSA를 함유하는 혈청 등의 시료를, 1μg/mL~30mg/mL의 MAA와 0.01(w/v)%~50(w/v)%의 덱스트란 황산 나트륨 또는 콘드로이틴 황산 c 나트륨을 함유하는 5~1000mM Tris-HCl 완충액(pH5~9) 등의 완충액과 혼합하여 10~50℃에서 1~60분간 반응시킨다. 그 반응액 중의 α(2,3) 당쇄 유리형 PSA의 농도는 1pg/mL~1mg/mL, 덱스트란 황산 나트륨 또는 콘드로이틴 황산 c 나트륨의 농도는 0.01(w/v)%~50(w/v)%, MAA의 농도는 1μg/mL~30mg/mL이다.
(vii) 1pg/mL~1mg/mL의 AFP-L3을 함유하는 혈청 등의 시료를, 0.01(w/v)%~50(w/v)%의 덱스트란 황산 나트륨 또는 콘드로이틴 황산 c 나트륨을 함유하는 5~1000mM HBS-EP 완충액(pH5~9) 등의 완충액과 혼합하여 혼합액을 얻는다. 얻어진 혼합액을, 센서칩 등의 고상으로 고정화된 LCA와 접촉시켜, 10~50℃에서 1~60분간 반응시킨다. 그 반응액 중의 AFP-L3의 농도는 1pg/mL~1mg/mL, 덱스트란 황산 나트륨 또는 콘드로이틴 황산 c 나트륨의 농도는 0.01(w/v)%~50(w/v)%, LCA의 농도는 1μg/mL~30mg/mL이다.
(viii) 1pg/mL~1mg/mL의 α(2,3) 당쇄 유리형 PSA를 함유하는 혈청 등의 시료를, 0.01(w/v)%~50(w/v)%의 덱스트란 황산 나트륨 또는 콘드로이틴 황산 c 나트륨을 함유하는 5~1000mM HBS-EP 완충액(pH5~9) 등의 완충액과 혼합하여 혼합액을 얻는다. 얻어진 혼합액을, 센서칩 등의 고상으로 고정화된 MAA와 접촉시켜, 10~50℃에서 1~60분간 반응시킨다. 그 반응액 중의 α(2,3) 당쇄 유리형 PSA의 농도는 1pg/mL~1mg/mL, 덱스트란 황산 나트륨 또는 콘드로이틴 황산 c 나트륨의 농도는 0.01(w/v)%~50(w/v)%, MAA의 농도는 1μg/mL~30mg/mL이다.
또한, 본 발명의 복합체 형성 방법에 의하여 당쇄를 갖는 물질과 렉틴의 복합체의 양이 증가하는 이유는 명확하지 않지만, 예를 들면 본 발명에 관한 다당류의 존재하에 당쇄를 갖는 물질과 렉틴을 반응시킴으로써, 일단 생성한 복합체가 안정화하고, 당쇄를 갖는 물질과 렉틴으로 재분리하지 않게 되거나, 또는 분리하는 양이 감소하여, 결과적으로 본 발명에 관한 다당류의 비존재하에 반응시킨 경우보다, 그 복합체의 양이 증가하는 것을 생각할 수 있다.
또는, 본 발명에 관한 다당류가 존재함으로써, 렉틴의 당쇄를 갖는 물질의 당쇄에 대한 친화성이 높아져, 이로 인하여, 본 발명에 관한 다당류의 비존재하에 당쇄를 갖는 물질과 렉틴을 접촉시킨 경우보다, 본 발명에 관한 다당류의 존재하에 당쇄를 갖는 물질과 렉틴을 접촉시킨 경우가, 그 복합체의 양이 증가한다고 생각할 수 있다.
[2] 본 발명의 복합체 형성 방법의 응용
본 발명의 복합체 형성 방법은, 당쇄에 대한 렉틴의 친화성을 이용하는 모든 측정 방법, 분석 방법, 검출 방법 등에 이용할 수 있다.
상기한 당쇄에 대한 렉틴의 친화성을 이용하는 측정 방법, 분석 방법, 또는 검출 방법으로서는, 예를 들면 표면 플라즈몬 공명법, 캐필러리 전기 영동, 렉틴 어피니티 크로마토그래피, 렉틴 마이크로어레이법, ELISA, 조직 염색, 전기 영동법, 플로 사이토메트리 등을 들 수 있다.
상기 방법 중에서도, 표면 플라즈몬 공명법 또는 캐필러리 전기 영동이 바람직하다.
이하에, 본 발명의 복합체 형성 방법을, 상기한 각각의 방법에 응용하는 방법을 예로 하여, 설명한다.
각각의 방법에 이용되는 본 발명에 관한 다당류, 당쇄를 갖는 물질, 당쇄를 갖는 물질을 함유하는 시료, 및 렉틴 등의, 각 성분의 구체예, 각 성분의 용액에 이용되는 용매, 그 용액 중의 각 성분의 농도, 반응 조건 등은, 상기한 본 발명의 복합체 형성 방법에 관한 설명에 기재한 바와 같다.
또, 이하에 설명하는 각 응용 방법에 있어서 이용되는 본 발명에 관한 다당류와 렉틴의 선택 조건도, 상기한 바와 같다.
또한, 본 발명의 복합체 형성 방법을 실시한 후, 당쇄를 갖는 물질의 측정, 당쇄의 검출, 당쇄 구조의 해석 등을 실시하는 경우, 본 발명에 관한 다당류의 존재하에서 측정·검출 등을 실시하는 것이 바람직하다.
즉, 복합체 형성 후에는, 목적의 반응이나 목적의 측정·검출이 종료될 때까지(예를 들면 복합체의 측정·검출이 목적인 경우는, 측정·검출이 종료될 때까지), 복합체를 함유하는 용액 중에, 본 발명에 관한 다당류를 공존시켜 두는 것이 바람직하다. 그 용액의 종류, 및 용액 중의 다당류의 농도는, 상기한 바와 같다.
예를 들면, 후술하는 면역학적 측정법 등에 있어서, 복합체를 형성하지 않았던 유리의 당쇄를 갖는 물질이나 렉틴을 세정 처리 등으로 제거한 경우, 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 세정액을 이용하여 세정 처리를 행하는 것이 바람직하다. 또, 본 발명에 관한 다당류의 존재하에 그 복합체의 양을 측정하는 것이 바람직하다.
표면 플라즈몬 공명법으로의 응용
표면 플라즈몬 공명법은, 표면 플라즈몬이 금속/액체 계면에서 여기한 경우에 일어나는, 이른바 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance = SPR)의 광학 현상을 이용하여 생체 분자 간의 상호 작용을 해석(측정)하는 분자 간 상호 작용 해석 시스템이다.
본 발명의 복합체 형성 방법을 표면 플라즈몬 공명법에 응용하는 방법으로서는, 예를 들면 이하의 방법을 들 수 있다.
센서칩에, 측정 대상인 당쇄를 갖는 물질의 당쇄에 친화성을 갖는 렉틴을 고정화한다. 측정 대상의 시료와 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액을 조제하고, 표면 플라즈몬 공명 분광 장치의 유로로부터 렉틴을 고정화한 센서칩의 표면에 흐르게 하면 된다.
상기에서 이용되는 측정 대상의 시료와 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액을 얻는 방법으로서는, 최종적으로 그 용액이 얻어지는 방법이면 된다. 예를 들면, 그 시료에 본 발명에 관한 다당류 또는 그 용액을 첨가하는 방법이나, 그 시료와 본 발명에 관한 다당류를 물이나 적당한 완충액에 용해하는 방법을 들 수 있다. 후술하는 다른 측정 방법에 관한 "측정 대상의 시료와 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액"도, 동일한 방법으로 얻어진다.
표면 플라즈몬 공명법에서의 측정은, 표면 플라즈몬 공명 분광 장치에 첨부한 사용 설명서에 따라, 그 측정에 있어 지적(至適)의 조건으로 행하면 된다.
장치의 유로로부터 흐르게 하는, 당쇄를 갖는 물질을 함유하는 시료와 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액 중의 본 발명에 관한 다당류의 농도는 0.01(w/v)%~50(w/v)%, 바람직하게는 0.1(w/v)%~25(w/v)%, 보다 바람직하게는 0.5(w/v)%~15(w/v)%, 더 바람직하게는 0.5~10(w/v)%이다.
본 발명의 복합체 형성 방법을 실시하면, 종래의 표면 플라즈몬 공명법과 비교하여, 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 복합체를 보다 많이 얻을 수 있다. 이로 인하여, 종래의 표면 플라즈몬 공명법에 본 발명의 복합체 형성 방법을 적용하고, 그 당쇄를 갖는 물질이 결합한 렉틴을 확인 또는 해석함으로써, 그 물질이 갖는 당쇄의 구조의 정보를 보다 정확하고 또한 고감도로 얻을 수 있다.
또, 최근, 질병의 마커인 변이 당쇄를 갖는 당단백질을 표면 플라즈몬 공명법으로 검출·측정하는 방법이 실시되게 되었다(Takatoshi Kaya, et al., Anal. Chem., vol.87, No.3, pp.1797-1803, 2015). 본 발명에 관한 복합체 형성 방법을 이용한 표면 플라즈몬 공명법을 실시하면, 그 변이 당쇄를 갖는 당단백질을 고감도로 검출할 수 있기 때문에, 본 발명의 방법은, 질병 등의 판정 등, 임상 검사의 분야에 있어서 지극히 유용하다.
표면 플라즈몬 공명법의 대표적인 분석 시스템으로서 비아코어TM법이 있다. 비아코어법은, 일반적으로는 간단히 비아코어(Biacore)로 불린다. 또, "비아코어"라고 한 경우, 비아코어의 분석 시스템에 이용되는 비아코어 기기를 가리키는 경우도 있다.
본 발명에 관한 다당류로서 덱스트란 황산 나트륨을 이용하고, 렉틴으로서 LCA를 이용한 본 발명에 관한 복합체 형성 방법에 따르는 비아코어법에 의하여 AFP-L3을 검출하는 방법의 일례를, 이하에 설명한다.
통상의 방법에 의하여 LCA를 비아코어 전용 칩(센서칩) 상에 고정화한다. 또, 측정 대상의 시료와 덱스트란 황산 나트륨(0.01(w/v)%~50(w/v)%)을 함유하는 완충액(예를 들면 비아코어 전용 런닝 버퍼인 HBS-EP)을 조제한다. 이 용액을, 예를 들면 10~50℃, 바람직하게는 20~40℃, 유속 10~50μL/min으로, 센서칩에 송액하여 반응시킨다. 이로써, 시료 중에 AFP가 포함되어 있으면, 센서칩 상에 AFP-L3과 LCA의 복합체가 형성된다. 송액을 개시한 60~180초 후에, 비아코어에 의한 측정을 행한다. 별도로 버퍼, AFP를 함유하는 버퍼, AFP와 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 버퍼 등을 이용하여 동일한 측정을 행하고, 얻어진 값을 기초로 백그라운드값의 조정을 행한다. 얻어진 비아코어에 의한 측정 결과를 근거로, 통상의 방법에 의하여 AFP-L3의 양을 얻을 수 있다.
미리 농도 기지(旣知)의 AFP-L3을 이용하여 동일하게 비아코어에 의한 측정을 행하여 얻어진 검량선을 이용하여, AFP-L3의 양을 결정해도 된다.
캐필러리 전기 영동으로의 응용
본 발명의 복합체 형성 방법에 의하여 당쇄를 갖는 물질과 당쇄를 갖는 물질의 당쇄에 친화성을 갖는 렉틴과의 복합체를 형성시켜, 얻어진 복합체를 캐필러리 전기 영동에 의하여 분리하고, 그 복합체의 양을 측정함으로써, 당쇄를 갖는 물질의 양을 측정할 수 있다.
본 발명의 복합체 형성 방법을 캐필러리 전기 영동에 응용하는 방법으로서, 예를 들면, 이하의 [방법 1] 및 [방법 2]를 들 수 있다.
[방법 1]
"측정 대상의 시료를, 측정 대상의 당쇄를 갖는 물질에 특이적으로 결합하는 항체와 반응시켜, 당쇄를 갖는 물질과 항체와의 항원 항체 복합체를 얻는다. 얻어진 항원 항체 복합체를, 본 발명에 관한 다당류 및 그 당쇄를 갖는 물질의 당쇄에 친화성을 갖는 렉틴의 존재하에 캐필러리 전기 영동을 행하고, 그 당쇄를 갖는 물질을, 그 렉틴의 당쇄에 대한 친화성의 정도에 근거하여 분리하고, 측정한다."고 하는 방법이다.
당쇄를 갖는 물질에 특이적으로 결합하는 항체로서는, 당쇄를 갖는 물질에 특이적으로 결합하는 항체 1종을 이용해도 되고, 당쇄를 갖는 물질에 특이적으로 결합하지만, 서로 다른 에피토프를 인식하는 2종 이상의 항체를 이용해도 된다.
당쇄를 갖는 물질이 당단백질인 경우, 당쇄를 갖는 물질에 특이적으로 결합하는 항체로서는, 당단백질의 단백질 부분(코어 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체를 들 수 있다.
또, 항체는, 검출 가능한 표지 물질로 표지되어 있어도 된다.
항체를 1종 이용하는 경우에도 2종 이상 이용하는 경우에도, 어느 한 항체는, 음이온성 물질 등의 하전 캐리어 분자로 표지되어 있어도 된다. 하전 캐리어 분자로서는, DNA 등의 핵산쇄를 들 수 있다.
이와 같은 목적으로 사용되는 핵산쇄의 종류로서는, 캐필러리 전기 영동에 통상 이용되고 있는 것이면 되고, 또 그 핵산의 항체로의 결합 방법은, 자체 공지의 방법을 들 수 있다.
또한, 항체는 하전 캐리어 분자와 검출 가능한 표지 물질의 양쪽 모두로 표지되어 있어도 된다.
캐필러리 전기 영동은, 캐필러리 팁으로 행해지는 전기 영동((마이크로)칩 캐필러리 전기 영동)여도 된다.
본 발명에 관한 캐필러리 전기 영동에 사용하는 영동 용액, 영동 조건, 조작 방법, 반응 조건 등은, 캐필러리 전기 영동을 본 발명에 관한 다당류의 존재하에 행하는 것 이외에는 자체 공지의 방법에 따르면 된다.
캐필러리 전기 영동을 시판의 전자동 측정 장치를 이용하여 행하는 경우에는, 미리 이동상(移動相)이 되는 영동 용액에 본 발명에 관한 다당류와 렉틴을 함유시키면 된다. 그리고, 당쇄를 갖는 물질과 항체와의 항원 항체 복합체와 렉틴을, 전자동 측정 장치의 유로 내에서 본 발명에 관한 다당류의 존재하에 반응시키고, 이어서 캐필러리 전기 영동을 실시하면 된다. 그 외는, 그 장치에 첨부된 취급 설명서에 기재된 조건으로, 그 취급 설명서에 기재된 방법에 따라, 캐필러리 전기 영동을 실시하면 된다.
캐필러리 전기 영동의 전자동 측정 장치로서는, 예를 들면 뮤타스 와코 i30(와코 준야쿠 고교(주)제) 등을 들 수 있다.
캐필러리 전기 영동을 행하는 경우, 영동 용액 중의 본 발명에 관한 다당류의 농도는, 0.01(w/v)%~50(w/v)%, 바람직하게는 0.1(w/v)%~25(w/v)%, 보다 바람직하게는 1(w/v)%~15(w/v)%, 더 바람직하게는 4~10(w/v)%이다.
캐필러리 전기 영동을 행하는 경우, 영동 용액 중의 렉틴의 농도는, 캐필러리 전기 영동에 의하여 분리하는 동안, 당쇄를 갖는 물질의 당쇄와 렉틴이 완전하게 결합할 수 있는 양보다 고농도인 것이 바람직하다. 즉, 렉틴의 농도는, 1μg/mL~30mg/mL, 바람직하게는 10μg/mL~20mg/mL, 보다 바람직하게는 1~10mg/mL이다.
항원 항체 복합체와 렉틴을 본 발명에 관한 다당류의 존재하에 접촉시켜, 반응시킬 때의, 반응액 중의 본 발명에 관한 다당류의 농도, 요약하면, 복합체를 분리하여, 검출시킬 때의 용액 중의, 본 발명에 관한 다당류의 농도(마이크로 유로 내에서의 농도)는 0.01(w/v)%~50(w/v)%, 바람직하게는 0.1(w/v)%~25(w/v)%, 보다 바람직하게는 1(w/v)%~15(w/v)%, 더 바람직하게는 4~10(w/v)%이다.
항원 항체 복합체와 렉틴을 본 발명에 관한 다당류의 존재하에 접촉시켜, 반응시킬 때의, 렉틴의 농도, 요약하면, 복합체를 분리하여, 검출시킬 때의 용액 중의, 렉틴의 농도(마이크로 유로 내에서의 농도)는, 1μg/mL~30mg/mL, 바람직하게는 10μg/mL~20mg/mL, 보다 바람직하게는 1~10mg/mL이다.
[방법 2]
측정 대상의 시료와, 그 당쇄를 갖는 물질의 당쇄에 친화성을 갖는 렉틴을 표지 물질로 표지한 표지 렉틴을, 상기한 본 발명의 복합체 형성 방법에 따라, 본 발명에 관한 다당류의 존재하에 접촉시켜, 반응시킨다. 이어서, 얻어진 반응액 중의 [표지 렉틴-당쇄를 갖는 물질]의 복합체를, 캐필러리 전기 영동을 행하여 분리한다. 캐필러리 전기 영동을 행할 때에, 본 발명에 관한 다당류를 용해시킨 영동 용액을 이용해도 된다. 그리고, [표지 렉틴-당쇄를 갖는 물질]의 복합체 유래의 표지 물질의 양을 측정함으로써, 시료 중의 당쇄를 갖는 물질의 양을 측정할 수 있다.
영동 용액 중의 본 발명에 관한 다당류 및 렉틴의 농도, 당쇄를 갖는 물질과 표지 렉틴을 본 발명에 관한 다당류의 존재하에 접촉시켜, 반응시킬 때의, 반응액 중의 본 발명에 관한 다당류의 농도, 요약하면, 복합체를 분리하여, 검출시킬 때의, 용액 중의 본 발명에 관한 다당류의 농도(마이크로 유로 내에서의 농도), 및 렉틴의 농도, 요약하면, 복합체를 분리하여, 검출시킬 때의, 용액 중의 렉틴의 농도(마이크로 유로 내에서의 농도) 등은, 상기한 [방법 1]의 경우에 준한다.
본 발명의 복합체 형성 방법과 캐필러리 전기 영동법을 실시함으로써, 예를 들면 PSA를, 그 당쇄의 차이에 따라 분리 측정할 수 있다.
상기 방법 중에서도, [방법 1]이 바람직하다.
본 발명의 복합체 형성 방법을 캐필러리 전기 영동법에 응용함으로써, 종래법과 비교하여, 얻어지는 당쇄를 갖는 물질과 렉틴의 복합체를 보다 많이 얻을 수 있으므로, 캐필러리 전기 영동에 의하여 검출되는 복합체의 피크의 시그널값(피크 면적 등)이 증대한다. 그 결과, 보다 고감도의 당쇄를 갖는 물질의 측정이 가능해진다.
렉틴으로서 MAA를 이용하여, 본 발명에 관한 다당류로서 덱스트란 황산 나트륨 또는 콘드로이틴 황산 c 나트륨을 이용하고, 상기한 [방법 1]에서, α(2,3) 당쇄 유리형 PSA를 분리하여, 측정하는 방법의 일례를, 이하에 구체적으로 설명한다.
또한, α(2,3) 당쇄 PSA 등의 PSA에는, 각각 α1-안티키모트립신이나 α2-매크로글로불린 등의 결합 단백질과 결합한 결합형과, 결합 단백질과 결합하고 있지 않는 유리형이 존재한다.
먼저, 측정 대상의 시료와, 유리형 PSA에 특이적으로 결합하는 항PSA항체(항PSA 항체 1)를 검출 가능한 표지 물질(예를 들면 형광 물질)로 표지한 표지 항PSA 항체 1을 액상 중에서 반응시킨다. 시료 중에 PSA가 포함되어 있으면, PSA는, 형광 표지 항PSA 항체 1과 결합하여, 이하의 2종의 복합체를 형성한다.
·[표지 항PSA 항체 1-α(2,3) 당쇄 유리형 PSA] 복합체
·[표지 항PSA 항체 1-α(2,3) 당쇄 유리형 PSA 이외의 유리형 PSA] 복합체
얻어진 상기 복합체를 포함하는 반응액과, PSA에 특이적으로 결합하는 항PSA 항체(항PSA 항체 2)를 DNA로 표지한 DNA 표지 항PSA 항체 2를 0.001~10μM, 바람직하게는 0.01~1μM 함유하는 시액 2~50μL과, 영동용 완충액과, 내부 표준 물질(예를 들면 형광 물질: HiLyte647(AnaSpec사제) 등)을, 1~10psi로 30~60초의 가압법에 의하여, 예를 들면, 내경 5~500μm, 바람직하게는 50~200μm, 보다 바람직하게는 50~100μm, 길이 1~10cm의 캐필러리에 도입하고, 20~40℃ 보온하에 5초~30분, 바람직하게는 10초~15분 반응시킨다. 이 반응에 의하여, 이하의 복합체 1 및 복합체 2가 얻어진다.
복합체 1: [표지 항PSA 항체 1-α(2,3) 당쇄 유리형 PSA-DNA 표지 항PSA 항체 2]의 복합체,
복합체 2: [표지 항PSA 항체 1-α(2,3) 당쇄 유리형 PSA 이외의 유리형 PSA-DNA 표지 항PSA 항체 2]의 복합체
이어서, 복합체 1 및 복합체 2를 포함하는 반응액을, MAA(1μg/mL~30mg/mL)와 덱스트란 황산 나트륨이나 콘드로이틴 황산 c 나트륨 등의 본 발명에 관한 다당류(0.01(w/v)%~50(w/v)%)를 함유하는 영동 완충액(이동상) 중에서 캐필러리 전기 영동을 행한다. 복합체 1은 MAA와 상호 작용하지만, 복합체 2는 MAA와 상호 작용하지 않기 때문에, 복합체 1이 복합체 2보다 늦게 영동된다. 이로 인하여, 검출되는 표지 항PSA 항체 1 유래의 표지 물질의 피크의 출현 위치가, 복합체 1과 복합체 2에서 다르다. 따라서, 피크의 위치를 근거로, 복합체 1의 피크 및 복합체 2의 피크를 각각 알 수 있다.
α(2,3) 당쇄 유리형 PSA의 양은, 복합체 1의 피크 면적이나 피크의 높이에 근거하여 구할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 복합체 1과 복합체 2를 본 발명에 관한 다당류의 존재하에 MAA와 반응시킴으로써, 검출되는 복합체가 증대하므로, 보다 고감도로 α(2,3) 당쇄 유리형 PSA를 측정할 수 있다.
상기에서 이용되는 항PSA 항체 1(유리형 PSA에 특이적으로 결합하는 항체), 항PSA 항체 2(PSA에 특이적으로 결합하는 항체)는, 시판의 항체여도 된다.
항PSA 항체 1(유리형 PSA에 특이적으로 결합하는 항체)의 시판품으로서는, 예를 들면 Anti PSA 모노클로널 항체 8A6(HyTest사), Anti PSA 모노클로널 항체(PS1)(HyTest사), Anti PSA 모노클로널 항체(클론 108)(Anogen사), Anti-Prostate Specific Antigen 항체(PS2)(압캠(abcam)사), Anti-Prostate Specific Antigen 항체(2H9)(압캠사) 등을 들 수 있다.
항PSA 항체 2(PSA에 특이적으로 결합하는 항체)는, 유리형 PSA와 결합형 PSA의 양쪽 모두에 결합할 수 있는 항체여도 된다. 예를 들면, PSA의 코어 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 들 수 있다. 그 시판품으로서는, Anti PSA 모노클로널 항체 5A6(HyTest사), Anti PSA 모노클로널 항체 5G6(HyTest사), Anti PSA 모노클로널 항체(PS6)(HyTest사), Anti-Prostate Specific Antigen 항체(EP1588Y)(압캠사), Anti-Prostate Specific Antigen 항체(A67-B/E3)(압캠사), Anti-Prostate Specific Antigen 항체(35H9)(압캠사), Anti-Prostate Specific Antigen 항체(KLK3/801)(압캠사), Anti-Prostate Specific Antigen 항체(3E6)(압캠사), Anti-Prostate Specific Antigen 항체(8301)(압캠사), Anti-Prostate Specific Antigen 항체(A5D5)(압캠사), Anti-Prostate Specific Antigen 항체(PSA 28/A4)(압캠사), Anti-Prostate Specific Antigen 항체(1H12)(압캠사) 등을 들 수 있다.
렉틴 어피니티 크로마토그래피으로의 응용
당단백질, 당펩티드, 당쇄 등을 정제하는 방법으로서, 렉틴 어피니티 크로마토그래피가 자주 이용된다.
렉틴 어피니티 크로마토그래피에서는, 시료를, 측정 대상의 당쇄를 갖는 물질의 당쇄에 친화성을 갖는 렉틴을 아가로스 등의 고상으로 고정화한 충전제를 충전한 컬럼에 흐르게 한다. 시료 중에 측정 대상의 당쇄를 갖는 물질이 있으면, 그 당쇄와 렉틴의 상호 작용에 의하여 발생하는 당쇄를 갖는 물질의 용출의 지연에 근거하여, 목적의 당쇄를 갖는 물질을 분리하여, 측정한다.
본 발명의 복합체 형성 방법을 렉틴 어피니티 크로마토그래피에 응용하는 방법으로서는, 예를 들면 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 이동상을 이용하여, 통상의 렉틴 어피니티 크로마토그래피를 행하는 방법을 들 수 있다.
이동상 중의 본 발명에 관한 다당류의 농도는, 0.01(w/v)%~50(w/v)%, 바람직하게는 0.1(w/v)%~25(w/v)%, 보다 바람직하게는 0.5(w/v)%~15(w/v)%, 더 바람직하게는 0.5~10(w/v)%이다.
본 발명의 복합체 형성 방법을 렉틴 어피니티 크로마토그래피에 응용함으로써, 당쇄를 갖는 물질을, 종래 보다 양호한 효율로 분리할 수 있다.
렉틴 마이크로어레이법으로의 응용
일본 국립 연구 개발 법인 산업 기술 종합 연구소 당쇄 의공학 연구 센터 등이 개발한 렉틴 마이크로어레이법에, 본 발명의 복합체 형성 방법을 적용할 수 있다.
렉틴 어레이(렉틴 마이크로어레이)란, 특이성(친화성)이 다른 수십 종의 렉틴을 슬라이드 글라스 상에 스폿 형상으로 나열하여 고정화한 어레이이다.
본 발명의 복합체 형성 방법을 렉틴 마이크로어레이법에 응용하는 방법으로서, 예를 들면, 이하의 [방법 1] 및 [방법 2]를 들 수 있다.
[방법 1]
당쇄를 갖는 물질과 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액을 렉틴 마이크로어레이와 상호 작용시킨 후, 그 마이크로어레이를, 당쇄를 갖는 물질에 특이적으로 결합하는 항체를 형광 표지한 형광 표지 항체와 반응시킨다. 이어서, 상기와 동일한 방법으로 형광 표지 항체 유래의 형광을 검출함으로써 당쇄를 갖는 물질이 결합한 렉틴을 알 수 있으므로, 그 결과를 근거로, 당쇄를 갖는 물질의 당쇄를 해석할 수 있다.
[방법 2]
당쇄를 갖는 물질을 형광 물질 등의 검출 가능한 표지 물질로 표지한 당쇄를 갖는 물질의 표지물과 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액을 렉틴 마이크로어레이와 상호 작용시킨 후, 여기광을 조사하여 에바네센트장(場)을 발생시킨다. 이어서, 당쇄를 갖는 물질의 표지물 유래의 시그널을 검출함으로써 당쇄를 갖는 물질이 결합한 렉틴을 알 수 있으므로, 그 결과를 근거로, 당쇄를 갖는 물질의 당쇄를 해석할 수 있다.
당쇄를 갖는 물질과 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액 중의, 본 발명에 관한 다당류의 농도는, 0.01(w/v)%~50(w/v)%, 바람직하게는 0.1(w/v)%~25(w/v)%, 보다 바람직하게는 0.5(w/v)%~15(w/v)%, 더 바람직하게는 0.5~10(w/v)%이다.
렉틴 마이크로어레이에 의한 측정은, 예를 들면 MICROARRAY METHODS AND PROTOCOLS(CRC Press), edited by Robert S. Matson, "Chapter 9: Lectin Microarrays", Masao Yamada, p.141, 2009에 기재된 프로토콜에 따라 실시하면 된다.
상기한 방법 중에서도, [방법 1]이 바람직하다.
렉틴 마이크로어레이법은, 세정 조작을 행하지 않고 렉틴 어레이의 형광을 검출할 수 있는 방법이지만, 본 발명의 복합체 형성 방법을 렉틴 마이크로어레이법에 응용함으로써, 렉틴에 대하여 친화성이 약한 당쇄여도, 보다 많은 양의 당쇄-렉틴 복합체가 마이크로어레이 상에 유지된다. 이로 인하여, 그 당쇄의 정보를 보다 고정밀도로 얻을 수 있다.
면역학적 측정 방법(샌드위치법)으로의 응용
본 발명의 복합체 형성 방법을 면역학적 측정 방법(샌드위치법)에 응용하는 경우는, 본 발명에 관한 다당류의 존재하에, 당쇄를 갖는 물질과 렉틴을 반응시키는 것 이외에는, 공지의 면역학적 측정 방법(샌드위치법)에 준한 측정을 행하면 된다.
본 발명의 복합체 형성 방법을, 고상을 이용한 샌드위치법에 응용하는 방법으로서, 예를 들면, 이하의 [방법 1] 및 [방법 2]를 들 수 있다.
[방법 1]
측정 대상인 당쇄를 갖는 물질의 당쇄에 친화성을 갖는 렉틴을 고상으로 고정화한다. 측정 대상의 시료와 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액을, 상기 고상과 접촉시켜, 반응시킨다. 또는, 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액, 측정 대상의 시료 순으로 상기 고상과 접촉시켜 반응시켜도 되고, 측정 대상의 시료, 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액 순으로, 상기 고상과 접촉시켜 반응시켜도 된다.
고상을 세정 처리한 후, 측정 대상의 당쇄를 갖는 물질에 특이적으로 결합하는 항체를 검출 가능한 표지 물질로 표지한 표지 항체의 용액을, 고상과 접촉시켜, 반응시킨다. 당쇄를 갖는 물질이 당단백질인 경우에는, 그 코어 단백질에 특이적인 항체를 이용하면 된다. 고상을 세정 처리하고, 미반응의 표지 항체를 제거한다.
표지 항체의 표지 물질에 따른 측정 방법으로, 그 고상 상에 형성된 [렉틴-당쇄를 갖는 물질-표지 항체]의 복합체 유래의 표지 물질의 양을 측정한다. 그리고 그 결과에 근거하여, 당쇄를 갖는 물질을 측정한다.
[방법 2]
측정 대상의 당쇄를 갖는 물질에 특이적으로 결합하는 항체를 고상으로 고정화한다. 당쇄를 갖는 물질이 당단백질인 경우에는, 그 코어 단백질에 특이적인 항체를 이용하면 된다.
그 후, 측정 대상의 시료를, 상기 고상과 접촉시켜, 반응시킨다.
이어서, 고상을 세정 처리한 후, 본 발명에 관한 다당류와 측정 대상인 당쇄를 갖는 물질의 당쇄에 친화성을 갖는 렉틴을 검출 가능한 표지 물질로 표지한 표지 렉틴을 함유하는 용액을, 상기 고상과 접촉시켜, 반응시킨다. 또는, 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액, 당쇄를 갖는 물질의 당쇄에 친화성을 갖는 렉틴을 검출 가능한 표지 물질로 표지한 표지 렉틴을 함유하는 용액 순으로, 상기 고상과 접촉시켜 반응시켜도 되고, 그 표지 렉틴을 함유하는 용액, 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액 순으로, 상기 고상과 접촉시켜 반응시켜도 된다.
고상을 세정 처리하여, 미반응의 표지 렉틴 등을 제거한다.
표지 렉틴의 표지 물질에 따른 방법으로, 그 고상 상에 형성된 [항체-당쇄를 갖는 물질-표지 렉틴]의 복합체 유래의 표지 물질의 양을 측정한다. 그리고 그 결과에 근거하여, 당쇄를 갖는 물질을 측정한다.
[방법 1] 및 [방법 2]에 있어서, 측정 대상의 시료와 렉틴을 반응시킬 때의 반응액 중의 본 발명에 관한 다당류의 농도는, 0.01(w/v)%~50(w/v)%, 바람직하게는 0.1(w/v)%~25(w/v)%, 보다 바람직하게는 0.5(w/v)%~15(w/v)%, 더 바람직하게는 0.5~10(w/v)%이다.
[방법 1] 및 [방법 2]에서 이용되는, 각 반응 후에 고상을 세정 처리할 때의 세정액과, [방법 1]에서 이용되는 표지 항체의 용액은, 본 발명에 관한 다당류를 함유하고 있는 것이 바람직하다. 세정액 중의 본 발명에 관한 다당류의 농도는, 상기한 바와 같다.
또, 본 발명에 관한 다당류의 존재하에, [항체-당쇄를 갖는 물질-표지 렉틴]의 복합체 유래의 표지 물질의 양을 측정하는 것이 바람직하다. 측정 시의 본 발명에 관한 다당류의 농도는, 상기한 반응액 중의 농도와 동일하면 된다.
상기한 방법 중에서도, [방법 2]가 보다 바람직하다.
본 발명의 복합체 형성 방법을 면역학적 측정 방법에 응용하면, 당쇄를 갖는 물질과 렉틴의 복합체를 보다 많이 얻을 수 있으므로, 보다 고감도의 당쇄를 갖는 물질의 측정이 가능해진다.
전기 영동법으로의 응용
측정 대상의 시료를 통상의 방법에 의하여 젤 전기 영동 후, PVDF막 등의 멤브레인에 전사한다. 이어서 적절히 멤브레인을 블로킹 처리한 후, 얻어진 멤브레인을, 당쇄를 갖는 물질의 당쇄에 친화성을 갖는 렉틴을 검출 가능한 표지 물질로 표지한 표지 렉틴과 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액에 침지시켜, 멤브레인 상에서 당쇄를 갖는 물질과 표지 렉틴과의 복합체를 형성시킨다. 이어서, 표지 물질에 따른 측정 방법으로 표지 물질을 검출함으로써, 당쇄를 갖는 물질을 고감도로 검출하고, 측정할 수 있다.
표지 렉틴으로서 당쇄를 갖는 물질의 당쇄에 친화성을 갖는 렉틴을 비오틴으로 표지한 비오틴 표지 렉틴을 이용하는 경우에는, 다음과 같이 행한다. 먼저 당쇄를 갖는 물질을 함유하는 시료를 젤 전기 영동 후, 멤브레인에 전사한다. 그 멤브레인을, 비오틴 표지 렉틴과 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액에 침지시켜, 멤브레인 상에서 당쇄를 갖는 물질과 비오틴 표지 렉틴과의 복합체를 형성시킨다. 이어서, 멤브레인을 HRP 표지 아비딘 용액(본 발명에 관한 다당류를 포함하고 있어도 됨)에 침지시킨다. 또한, 그 멤브레인을 발색액에 침지시켜 발색시킨다. 그 발색을 검출함으로써, 당쇄를 갖는 물질을 검출하여, 측정한다.
상기에서 사용되는, 표지 렉틴과 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액 또는 비오틴 표지 렉틴과 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액 중의, 본 발명에 관한 다당류의 농도는, 0.01(w/v)%~50(w/v)%, 바람직하게는 0.1(w/v)%~25(w/v)%, 보다 바람직하게는 0.5(w/v)%~15(w/v)%, 더 바람직하게는 0.5~10(w/v)%이다.
본 발명의 복합체 형성 방법을 전기 영동법에 응용함으로써, 멤브레인 상에 형성되는 당쇄를 갖는 물질과 표지 렉틴의 복합체의 양이 증가하므로, 그 복합체의 표지 렉틴 유래의 시그널값이 증대한다. 그 결과, 보다 고감도의 당쇄를 갖는 물질의 검출이나 측정이 가능해진다.
조직 염색으로의 응용
통상의 방법에 의하여 제작한 조직 절편을, 검출 대상인 당쇄에 친화성을 갖는 렉틴을 형광 물질이나 방사성 물질 등의 검출 가능한 표지 물질로 표지한 표지 렉틴과 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액에 침지시켜, 조직 절편 상의 당쇄와 표지 렉틴과의 복합체를 형성시킴으로써, 조직 절편을 보다 양호한 효율로 표지할 수 있다.
상기 조직 염색에 이용되는 표지 렉틴과 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액 중의, 본 발명에 관한 다당류의 농도는, 0.01(w/v)%~50(w/v)%, 바람직하게는 0.1(w/v)%~25(w/v)%, 보다 바람직하게는 0.5(w/v)%~15(w/v)%, 더 바람직하게는 0.5~10(w/v)%이다.
플로 사이토메트리로의 응용
세포막에 존재하는 검토 대상(표적)의 당쇄에 친화성을 갖는 렉틴을 검출 가능한 표지 물질로 표지한 렉틴을 세포에 결합시켜, 세포 분리 장치(셀 소터)를 이용한 통상의 플로 사이토메트리를 실시하면, 렉틴의 당쇄 특이성을 이용하여, 세포 표면(세포막 상)에 있는 당쇄의 종류에 근거하여 세포의 아집단을 분획할 수 있다.
그 방법에 본 발명의 복합체 형성 방법을 응용하는 방법으로서는, 예를 들면 이하의 방법을 들 수 있다.
세포를, 표적의 당쇄(세포가 세포막 상에 갖고 있다고 생각되는 당쇄)에 친화성을 갖는 렉틴을 형광 물질로 표지한 표지 렉틴과 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액과 접촉시켜, 세포막 상의 당쇄와 형광 표지 렉틴과의 복합체를 형성시킨다. 그 후, 통상의 셀 소터를 이용한 형광을 검출하는 방법으로, 표지 렉틴이 결합한 세포와 결합하지 않았던 세포를 분리한다. 셀 소터로 세포를 분리할 때의 분리액은, 본 발명에 관한 다당류를 함유하고 있어도 된다.
세포를, 형광 표지 렉틴과 본 발명에 관한 다당류를 함유하는 용액과 접촉시킬 때의 본 발명에 관한 다당류의 농도는, 0.01(w/v)%~50(w/v)%, 바람직하게는 0.1(w/v)%~25(w/v)%, 보다 바람직하게는 0.5(w/v)%~15(w/v)%, 더 바람직하게는 0.5~10(w/v)%이다.
또, 본 발명에 관한 다당류를 용해시킨 분리액을 이용하여 셀 소터로 세포를 분리하는 경우, 분리액 중의 본 발명에 관한 다당류의 농도는, 0.01(w/v)%~50(w/v)%, 바람직하게는 0.1(w/v)%~25(w/v)%, 보다 바람직하게는 0.5(w/v)%~15(w/v)%, 더 바람직하게는 0.5~10(w/v)%이다.
본 발명의 복합체 형성 방법을 플로 사이토메트리에 응용함으로써, 얻어지는 당쇄를 갖는 물질을 갖는 세포와 렉틴의 복합체의 양이 증가하므로, 분리하여 얻어지는 렉틴이 결합한 세포의 양이 증가한다. 즉, 효율적으로 표적의 당쇄를 갖는 세포를 회수할 수 있다.
또, 재생 의료에 있어서는, 사용하는 세포의 품질 관리가 불가결하다. 최근, 세포 표면의 당쇄를 해석함으로써, ES 세포, iPS 세포의 분화/미분화를 식별할 수 있는 것이 밝혀졌다. 또, 미분화 세포의 당쇄를 특이적으로 인식하는 렉틴이 발견되었다(Tateno H, et al., J. Biol. Chem., vol.286, No.23, pp.20345-20353, 2011). 이러한 발견에 근거하여, 미분화 세포나 분화 세포의 품질을 관리하는 기술이 개발되고 있다(국제 공개 WO2013/065302호, 국제 공개 WO2013/128914호).
예를 들면, 미분화 세포의 당쇄를 특이적으로 인식하는 렉틴을 검출 가능한 표지 물질로 표지한 표지 렉틴을 이용하고, 본 발명의 복합체 형성 방법에 의하여, 미분화 세포와 표지 렉틴과의 복합체를 형성시킨다. 이어서, 미분화 세포와 분화 세포를 셀 소터로 분리함으로써, 미분화 세포와 분화 세포를 효율적으로 분별할 수 있다.
그 외의 본 발명의 복합체 형성 반응을 응용 가능한 기술로서는, 예를 들면 렉틴을 이용하는 혈액형(아형, subtype)의 판정 방법을 들 수 있다. 혈액형 판정용 시약 증 어느 것에 본 발명에 관한 다당류를 첨가시킨 것을 이용하여, 판정을 실시하면 된다.
이상 예시한 방법 중에서도, 플라즈몬 공명법 및 캐필러리 전기 영동에 응용하는 것이 바람직하고, 특히 플라즈몬 공명법에 응용하는 것이 바람직하다.
[3] 본 발명의 당쇄를 갖는 물질의 측정 방법
본 발명의 당쇄를 갖는 물질의 측정 방법이란, "본 발명의 복합체 형성 방법으로 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 복합체를 형성시킨 후, 그 복합체의 양을 측정하는, 당쇄를 갖는 물질의 측정 방법"이다.
본 발명의 당쇄를 갖는 물질의 측정 방법에 있어서의, 본 발명의 복합체 형성 방법의 상세는, 상기한 "본 발명의 복합체 형성 방법"에 기재한 바와 같다.
본 발명의 복합체 형성 방법으로 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 복합체를 형성시킨 후에는, 그 복합체의 양을 측정함으로써, 당쇄를 갖는 물질을 측정하면 된다. 그 복합체의 구체적인 측정 방법으로서는, 예를 들면 상기한 표면 플라즈몬 공명법, 캐필러리 전기 영동, 렉틴 어피니티 크로마토그래피, 렉틴 마이크로어레이법, 샌드위치법 등의 면역학적 측정 방법, 전기 영동법 등을 들 수 있다. 그 구체적인 조건이나 방법 등은, 상기한 각방법의 설명에 기재한 바와 같다.
[4] 본 발명의 복합체 형성 촉진제
본 발명의 복합체 형성 촉진제는, "본 발명의 다당류를 함유하여 이루어지는, 당쇄를 갖는 물질과 그 당쇄를 갖는 물질의 당쇄에 친화성을 갖는 렉틴과의 복합체 형성 촉진제"이다.
본 발명의 복합체 형성 촉진제에 함유시키는 본 발명에 관한 다당류로서는, 상기의 본 발명의 복합체 형성 방법에 관한 설명에 기재한, N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당 또는 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 다당을 갖는 수용성 화합물을 들 수 있다. 그 바람직한 양태 및 구체예도, 상기한 바와 같다.
구체적으로는, 예를 들면 덱스트란 황산 또는 그 염, 콘드로이틴 황산 c 나트륨 또는 그 염 등을 들 수 있다.
본 발명의 복합체 형성 촉진제가 용액인 경우, 본 발명에 관한 복합체 형성 촉진제의 용액 중의 본 발명에 관한 다당류의 농도는, 0.01(w/v)%~50(w/v)%, 바람직하게는 0.1(w/v)%~25(w/v)%, 보다 바람직하게는 0.5(w/v)%~15(w/v)%, 더 바람직하게는 0.5~10(w/v)%이다.
본 발명의 복합체 형성 촉진제가 용액인 경우, 그 용액에 이용되는 용매의 구체예로서는, 물 또는 완충액을 들 수 있다.
용매로서 이용되는 물로서는, 이 분야에 있어서 사용되는 물이면 특별히 제한은 없고, 구체적으로는, 예를 들면 증류수, 탈이온수 등의 정제수 등을 들 수 있다.
용매로서 이용되는 완충액의 구체예로서는, 예를 들면 트리스 완충액, 인산 완충액, 베로날 완충액, 붕산 완충액, 굿 완충액, Tris-HCl 완충액, MES 완충액, HEPES 완충액, 인산 완충액 등을 들 수 있다.
또, 이들 완충액의 완충제 농도로서는, 통상 5~1,000mM, 바람직하게는 5~300mM의 범위로부터 적절히 선택된다. 그 pH도 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 5~9의 범위를 들 수 있다.
본 발명의 복합체 형성 촉진제는, 렉틴을 포함하고 있어도 된다. 렉틴의 구체예는, 상기의 본 발명의 복합체 형성 방법에 관한 설명에 기재한 바와 같다. 예를 들면, LCA, MAA, BC2LCN 등을 들 수 있다. 또, 본 발명에 관한 복합체 형성 촉진제 중의 렉틴의 농도는, 1μg/mL~30mg/mL, 바람직하게는 10μg/mL~20mg/mL, 보다 바람직하게는 1~10mg/mL이다.
본 발명의 복합체 형성 촉진제가 본 발명의 다당류와 렉틴을 함유하는 것인 경우, 본 발명의 다당류는, 상기한 본 발명의 복합체 형성 방법에 있어서 설명한 바와 같이, 그 렉틴이 친화성을 갖는 당쇄를 갖지 않는 것으로부터 선택된다.
본 발명의 다당류와 렉틴을 함유하는 본 발명의 복합체 형성 촉진제의 구체예로서는, 예를 들면 이하의 조성의 것을 들 수 있다.
(1) 0.01(w/v)%~50(w/v)%의 덱스트란 황산 또는 그 염과 1μg/mL~30mg/mL의 LCA를 5~1000mM Tris-HCl 완충액(pH5~9) 등의 완충액에 용해시킨, 복합체 형성 촉진제,
(2) 0.01(w/v)%~50(w/v)%의 덱스트란 황산 또는 그 염과 1μg/mL~30mg/mL의 MAA를 5~1000mM Tris-HCl 완충액(pH5~9) 등의 완충액에 용해시킨, 복합체 형성 촉진제,
(3) 0.01(w/v)%~50(w/v)%의 콘드로이틴 황산 c 또는 그 염과 1μg/mL~30mg/mL의 MAA를 5~1000mM Tris-HCl 완충액(pH5~9) 등의 완충액에 용해시킨, 복합체 형성 촉진제.
본 발명의 복합체 형성 촉진제에는, 통상 이 분야에서 이용되는 시약류, 예를 들면 완충제, 반응 촉진제, 단백질, 염류, 계면활성제 등의 안정화제, 방부제 등이며, 공존하는 시약 등의 안정성을 저해하거나 하지 않고, 당쇄와 렉틴과의 반응을 저해하지 않는 것이 포함되어 있어도 된다. 또 그 농도도, 통상 이 분야에서 통상 이용되는 농도 범위로부터 적절히 선택하면 된다.
또한, 본 발명의 복합체 형성 촉진제에는, 그 복합체 형성 촉진제의 사용 설명서 등을 첨부해도 된다. 당해 "설명서"란, 본 발명의 복합체 형성 촉진제의 특징, 사용 방법 등이 문장 또는 도표 등에 의하여 실질적으로 기재되어 있는, 본 발명의 복합체 형성 촉진제의 취급 설명서, 첨부 문서, 혹은 팸플릿(리플릿) 등을 의미한다.
이하에, 실시예를 들어 본 발명을 더 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: AFP-L3의 검출
(1) 측정 기기 등
측정 기기: Biacore X(GE Healthcare UK Ltd.제)
칩: Sensor Chip CM5(GE Healthcare UK Ltd.제)
런닝 버퍼: HBS-EP 버퍼(10mM HEPES, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% Surfactant P 20, pH7.4, GE Healthcare UK Ltd.제)
(2) 시약 등
당쇄를 갖는 물질로서, AFP-L3(α-페토프로테인의 LCA 결합성 분획, 와코 준야쿠 고교(주)제)을 이용했다.
본 발명에 관한 다당류로서, 덱스트란 황산 나트륨(M.W. 36,000~50,000, 와코 준야쿠 고교(주)제), 및 콘드로이틴 황산 c 나트륨(M.W. 40,000~80,000, 와코 준야쿠 고교(주)제)을 이용했다.
(3) 샘플 용액
HBS-EP 버퍼 및 상기 시약을 이용하여, 하기의 샘플 용액을 각각 조제했다.
·1μM(4w/v%) 덱스트란 황산 나트륨을 함유하는 28μg/mL AFP-L3 용액
·1μM(1w/v%) 콘드로이틴 황산 c 나트륨을 함유하는 28μg/mL AFP-L3 용액
·28μg/mL AFP-L3 용액
(4) 센서칩으로의 LCA 고정화
아민 커플링 키트(GE Healthcare UK Ltd.제)를 이용하여, LCA(Lens Culinaris Agglutinin)를 Sensor Chip CM5(CM 센서칩, GE Healthcare UK Ltd.제)의 센서칩 상에 고정화했다.
(5) 비아코어에 의한 측정
이하의 측정은, Biacore X(GE Healthcare UK Ltd.제)를 이용하여 행했다.
상기 (3)에서 조제한 샘플 용액 60μL를, 온도 25℃, 유속 30μL, 결합 시간 120초간의 조건으로 천천히 송액하여, LCA가 고정화되어 있는 센서칩에 흐르게 하여, AFP-L3과 LCA를 반응시켰다. 송액 직후부터, 경시적으로 Biacore X에 의한 측정을 행했다. 이어서 HBS-EP 버퍼만을, 180초간(해리 시간) 송액했다. 얻어진 측정 결과를, 비아코어 전용 해석 소프트인 BIAevaluation(Version4.1)을 이용하여 해석하여, 센서 그램을 얻었다.
(6) 결과
얻어진 센서 그램을 도 1 및 도 2에 나타낸다.
도 1 및 도 2에 있어서, 가로 축은 시간(s(초)), 세로 축은, 리스폰스의 값(RU, Resonance Unit, 공명 단위)을 나타낸다. RU의 크기는, AFP-L3과 LCA와의 복합체의 양을 반영한다.
또, 도 1에 있어서, +는 덱스트란 황산 나트륨을 함유하는 AFP-L3 용액을 이용하여 얻어진 결과를, ◆은 덱스트란 황산 나트륨을 함유하지 않는 AFP-L3 용액을 이용하여 얻어진 결과를 각각 나타낸다.
도 2에 있어서, □는 콘드로이틴 황산 c 나트륨을 함유하는 AFP-L3 용액을 이용하여 얻어진 결과를, ◆는 콘드로이틴 황산 c 나트륨을 함유하지 않는 AFP-L3 용액을 이용하여 얻어진 결과를 각각 나타낸다.
또한, AFP-L3과 LCA의 반응은 120초간 행하여, 그 후 HBS-EP 버퍼만을 LCA를 고정화한 센서칩에 흐르게 했다. 따라서, 도 1 및 도 2에 있어서, 가로 축의 120sec의 시점으로부터는, HBS-EP 버퍼만이 센서칩에 송액되고 있다(비아코어에서는 "해리"라고 한다).
도 1 및 도 2로부터 명확한 바와 같이, 덱스트란 황산 나트륨 또는 콘드로이틴 황산 c 나트륨의 존재하에서 AFP-L3과 LCA를 반응시킨 경우, 덱스트란 황산 나트륨 또는 콘드로이틴 황산 c 나트륨이 없는 상태로 AFP-L3과 LCA를 반응시킨 경우와 비교하여, 해리 시의 AFP-L3과 LCA의 복합체의 양이 많았다. 즉, 본 발명의 다당류의 존재하에 AFP-L3과 LCA를 접촉시켜, 반응시키면, 본 발명의 다당류의 비존재하에 AFP-L3과 LCA를 접촉시켜, 반응시킨 경우와 비교하여 AFP-L3과 LCA와의 복합체량이 증가하고 있는 것을 알 수 있다.
실시예 2. α(2,3) 당쇄 유리형 PSA의 검출-1
(1) 시료 및 시액의 조제
1) DNA 표지 항PSA 항체의 조제
하기의 순서에 따라, DNA가 결합한 PSA 항체 Fab' 프래그먼트를 조제했다.
Figure pct00004
즉, 먼저, 통상의 방법에 의하여 5' 말단에 NH2기가 도입된 250bp의 DNA 단편을 정제하고(정제 말단 아미노화 DNA), 이어서, 이 DNA 단편에 도입된 NH2기와 설포석신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)뷰티레이트(Sulfo-SMPB) 링커(석신이미드기와 말레이미드기를 갖는 링커, 피어스사제)의 석신이미드기를 통상의 방법에 의하여 반응시켰다. 이어서, 젤 여과 처리를 행하여, 미반응 링커를 제거하여, 링커가 결합한 250bpDNA 단편을 얻었다. 얻어진 링커 결합 250bpDNA 단편과, 먼저 항인간 PSA 마우스 모노클로널 항체(Anti PSA 모노클로널 항체 5G6, HyTest사제)를 이용하여 통상의 방법에 따라 조제한 항PSA 항체 5G6 Fab' 프래그먼트를 반응시켰다. 얻어진 반응물을, DEAE 컬럼을 이용하여 정제하고, 250bpDNA 단편이 결합한 항PSA 항체 5G6 Fab' 프래그먼트(이하, "DNA 표지 항PSA 항체"라고 기재함)를 조제했다.
또한, 이용한 Anti PSA 모노클로널 항체 5G6은, 인간 PSA에 대하여 친화성을 갖는 항체로, 결합형 PSA 및 유리형 PSA의 양쪽 모두에 결합할 수 있다. 즉, 그 항체는, "α(2,3) 당쇄 유리형 PSA"와 "α(2,3) 당쇄 유리형 PSA 이외의 유리형 PSA"의 양쪽 모두에 결합할 수 있다.
2) 형광 표지 항유리형 PSA 항체의 조제
Anti PSA 모노클로널 항체 5G6과는 다른 PSA의 에피토프를 인식하고, 또한 유리형 PSA와만 특이적으로 결합하는 항인간 PSA 모노클로널 항체(Anti PSA 모노클로널 항체 8A6, HyTest사제)를 통상의 방법에 의하여 처리하여, 항PSA 항체 8A6 Fab' 프래그먼트를 얻었다. 얻어진 프래그먼트의 아미노기에, 통상의 방법에 의하여 형광 물질 HiLyte647(AnaSpec사제)을 도입하여, HiLyte647 표지 항유리형 PSA 항체 8A6 Fab' 프래그먼트(이하, "형광 표지 항유리형 PSA 항체"라고 기재함)를 얻었다.
(2) 전기 영동(마이크로칩 캐필러리 전기 영동)
전자동 형광 면역 측정 장치 뮤타스 와코 i30(와코 준야쿠 고교(주)제)을 이용하여 장치의 취급 설명서에 따라, 이하에 나타낸 순서로 마이크로칩 캐필러리 전기 영동을 행했다.
1) 영동용 시료 A의 조제
Yoneyama T. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., vol.448, No.4, pp.390-396, 2014의 "2. Materials and methods (2.7Forced expression of FLAG-tag-fused S2, 3PSA)"에 개시된 방법에 따라 리캄버넌트 유리형 PSA[이하, "r 유리형 PSA"라고 약기한다. r 유리형 PSA는, 리캄버넌트 α(2,3) 유리형 PSA(이하, rα(2,3) 유리형 PSA라고 약기함)와, 리캄버넌트 α(2,3) 유리형 PSA 이외의 유리형 PSA를 함유함]를 취득했다. 취득한 r 유리형 PSA 용액 중의 PSA 농도를 측정하고, PBS(-)(와코 준야쿠 고교(주)제)로 희석하여 1ng/mL PSA 단백질 농도가 되도록 조제한 샘플 용액을 얻었다. 얻어진 샘플 용액을 2μL, 상기 (1) 2)에서 조제한 1μM 형광 표지 항유리형 PSA 항체를 1μL, 및 영동 완충액 1〔5%(w/v) 폴리에틸렌글라이콜(PEG20000), 3%(w/v) 글리세롤, 150mM NaCl, 0.01% BSA, 75mM Tris-HCl, 10mM MES를 함유한다. pH7.5〕7μL를 0.5mL 튜브에 더하고 혼합하여, 10μL의 반응액을 조제했다.
또한, 이 반응액 중의 형광 표지 항유리형 PSA 항체의 최종 농도는, 100nM이다.
상기 반응에서 얻어진 [형광 표지 항유리형 PSA 항체-r 유리형 PSA] 복합체를 함유하는 용액(즉, [형광 표지 항유리형 PSA 항체-rα(2,3) 당쇄 유리형 PSA] 복합체와 [형광 표지 항유리형 PSA 항체-rα(2,3) 당쇄 유리형 PSA 이외의 유리형 PSA] 복합체를 함유하는 용액)(10μL)을, 영동용 시료 A로 했다.
2) 영동용 시액의 조제
하기의 각 시액을 조제했다.
·영동 완충액 2(MAA와 콘드로이틴 황산 c 나트륨 함유)
5.0%(w/v) 폴리에틸렌글라이콜(PEG8000), 3%(w/v) 글리세롤, 10mM NaCl, 0.01% BSA를 함유하는 75mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.5)를 조제했다. 이것에 MAA(VECTOR사제)를 종농도(영동 완충액 2중의 농도) 4mg/mL가 되도록, 또 본 발명에 관한 다당류로서 콘드로이틴 황산 c 나트륨(와코 준야쿠 고교(주)제)를, 종농도(w/v)(영동 완충액 2중의 농도)가 각각 0%, 2.8%, 3.4%, 3.5%, 3.6%, 3.8%, 4.1%, 4.3%, 4.5%가 되도록 첨가하고, 혼합한 것을 조제하여, 영동 완충액 2로 했다.
·영동 완충액 3
2%(w/v) 폴리에틸렌글라이콜(PEG20000), 3%(w/v) 글리세롤, 0.01% BSA, 125mM HEPES, 75mM Tris-HCl를 함유하는 버퍼(pH조정 없음)를, 영동 완충액 3으로 했다.
·영동 완충액 4
2%(w/v) 폴리에틸렌글라이콜(PEG20000), 3%(w/v) 글리세롤, 0.01% BSA를 함유하는 75mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.5)를, 영동 완충액 4로 했다.
·DNA 표지 항체액(DNA 표지 항PSA 항체 함유)
상기 (1) 1)에서 얻어진 DNA 표지 항PSA 항체 100nM를 함유하는 버퍼〔2%(w/v) 폴리에틸렌글라이콜(PEG20000), 0.5mM EDTA(2Na), 3%(w/v) 글리세롤, 50mM NaCl, 0.01% BSA, 75mM BisTris(pH 6.0)를 함유함〕를 조제하여, DNA 표지 항체액으로 했다.
·형광액
30nM HiLyte647, 20%(w/v) 글리세롤을 함유하는 50mM BisTris(pH 6.0)를, 형광액으로 했다. 형광액은 측정 기기(뮤타스 와코 i30)의 검출부에서의 위치 확인 등의 조정을 위하여 이용된다.
3) 전기 영동 순서
i) 영동용 시료 A 및 영동용 시액의 도입
상기 (2) 1)에서 조제한 영동용 시료 A 5.4μL를, 뮤타스 와코 i30 전용 마이크로칩의 소정 웰(SP 웰)에 분주했다. 이어서, 하기와 같이 그 마이크로칩의 각 웰에 상기 (2) 2)에서 조제한 각 시액을 분주했다.
·R2 웰(R2(FLB) 웰, R2(LB) 웰): 영동 완충액 2(MAA와 콘드로이틴 황산 c 나트륨 함유)를 10.0μL씩,
·R3 웰: 영동 완충액 3을 10.0μL,
·R4 웰: 영동 완충액 4를 5.4μL,
·C1 웰: DNA 표지 항체액을 3.0μL,
·FD 웰: 형광액을 7.0μL.
사용한 마이크로칩의 모식도를 도 3에 나타낸다.
도 3에 있어서, Waste 웰은, 각 웰(R2, R3, R4, C1)의 시액 및 영동용 시료 A를 분석용 유로에 도입할 때의 폐액 용기(드레인용 웰)로서 사용한다.
이어서, 각 4개의 Waste 웰(드레인용 웰) 간에 30초간, -5psi의 압력을 인가하여, 칩의 분석용 유로에 영동용 시료 A 및 각 시액을 도입했다.
ii) ITP(반응, 농축, 분리), 및 검출
사용한 마이크로칩의 칩내 유로를 모식화한 것을 도 4에 나타낸다.
도 4에 있어서, W는 Waste 웰을 나타낸다. R3 웰측이 음극, R2(LB) 웰측이 양극이 된다. 또, 도 4에 있어서, 영동용 시료 A 및 각 시액의 배치 부분을 점 부분과 흰색 부분(점이 없는 부분)으로 분류하여 나타낸다.
칩의 분석용 유로에 영동용 시료 A 및 각 시액을 도입한 후, 이하의 방법으로 PSA의 분리 및 검출을 행했다.
도 4의 R3 웰-R2(LB) 웰 간에, 4000V의 전압을 인가하여, 30℃에서, 시액 중의 DNA 표지 항PSA 항체를 영동용 시료 A 중의 [형광 표지 항유리형 PSA 항체-r 유리형 PSA] 복합체와 접촉시켜, [형광 표지 항유리형 PSA 항체-r 유리형 PSA-DNA 표지 항PSA 항체]의 복합체를 형성시켜, 이것을 등속 전기 영동(ITP)으로 농축했다. 등속 전기 영동의 영동 방향은 도 4에 "ITP"로 점선에 의하여 나타난다.
유리형 PSA를 포착하기 위한 각 표지 항체에 의한 면역 반응 시간은 약 200초였다.
여기에서 형성된 복합체는, 구체적으로는 [형광 표지 항유리형 PSA 항체-rα(2,3) 당쇄 유리형 PSA-DNA 표지 항PSA 항체]의 복합체(복합체 1)와 [형광 표지 항유리형 PSA 항체-rα(2,3) 당쇄 유리형 PSA 이외의 유리형 PSA-DNA 표지 항PSA 항체]의 복합체(복합체 2)이다.
R2(FLB)와 R2(LB)의 채널 크로스 부분까지 등속 전기 영동되어 복합체가 당해 채널 크로스 부분을 빠져 나간 것을, 전압의 변화로 판단하고, 음전극을 R3으로부터 R2(FLB)로 전환했다. 그리고, 또한 검출 부분(R2(FLB)와 R2(LB)의 채널 크로스 부분으로부터 2cm 하류의 캐필러리 부분)으로, [형광 표지 항유리형 PSA 항체-r 유리형 PSA-DNA 표지 항PSA 항체]의 복합체의 피크가 검출될 때까지, MAA와 콘드로이틴 황산 c 나트륨의 존재하에서 캐필러리 젤 전기 영동(CE)을 행했다. CE가 행해진 위치 및 전기 영동의 영동 방향은, 도 4에 "CE"로 점선에 의하여 나타냈다.
MAA와 콘드로이틴 황산 c 나트륨의 존재하에서 캐필러리 젤 전기 영동을 행하는 사이에, 콘드로이틴 황산 c 나트륨 존재하에 복합체 1 및 복합체 2는, MAA와 접촉하여, 반응한다. 반응 시의, 반응액 중의 MAA의 농도는 4mg/mL, 및 콘드로이틴 황산 c 나트륨의 농도(w/v%)는 0%, 2.8%, 3.4%, 3.5%, 3.6%, 3.8%, 4.1%, 4.3% 또는 4.5%이다.
검출은, 635nm레이저 여기에 의하여 R2(FLB)와 R2(LB)의 채널 크로스 부분으로부터 2cm의 캐필러리 부분의 형광 강도를 포토 다이오드(후지 필름(주)제)에 의하여 경시적으로 측정함으로써 행했다.
(3) 결과
얻어진 전기 영동상(일렉트로페로그램)으로부터, MAA와 반응한 [형광 표지 항유리형 PSA 항체-rα(2,3) 당쇄 유리형 PSA-DNA 표지 항PSA 항체]의 복합체(복합체 1) 분획의 피크 면적을, i30 장치 부속의 해석용 소프트로 구했다.
결과를 도 5에 나타낸다. 도 5에 있어서, 세로 축은 복합체 1분획의 피크 면적을 나타내고, 가로 축은 MAA와 복합체 1 및 복합체 2의 반응 시의, 콘드로이틴 황산 c 나트륨의 농도(%(w/v%))를 나타낸다.
도 5로부터 분명한 것과 같이, 복합체 1의 피크 면적은, 콘드로이틴 황산 c 나트륨의 농도 의존적으로 증대했다. 이 점으로부터, 당쇄와 렉틴과의 반응을 콘드로이틴 황산 c 나트륨의 존재하에 행함으로써, 콘드로이틴 황산 c 나트륨의 비존재하에 동 반응을 행한 경우와 비교하여, 복합체 1의 양이 증가하는 것을 알 수 있다.
또한, 영동용 시약 2는 폴리에틸렌글라이콜(PEG8000;5%)을 함유하므로, 콘드로이틴 황산 c 나트륨 농도가 "0(w/v)%"가 되는 조건하에서는, 폴리에틸렌글라이콜 존재하이고 또한 콘드로이틴 황산 c 나트륨의 비존재하에 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 반응을 행하게 된다. 도 5로부터 분명한 바와 같이, 폴리에틸렌글라이콜 존재하이고 또한 콘드로이틴 황산 c 나트륨의 비존재하에 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 반응을 행한 경우에는, 복합체 1을 거의 검출할 수 없었다. 이상의 결과로부터, 본 발명에 관한 다당류 비존재하에서, 고분자 폴리머인 폴리에틸렌글라이콜의 존재하에 당쇄를 갖는 물질과 렉틴을 반응시켜도, 그 복합체의 양을 증가시키는 효과가 없는 것을 알 수 있다.
실시예 3. α(2,3) 당쇄 유리형 PSA의 검출-2
(1) 시료 및 시액의 조제, 및 전기 영동(마이크로칩 캐필러리 전기 영동)
하기의 영동 완충액 2를 이용하는 것 이외에는, 실시예 2에서 사용한 것과 동일한 영동용 시액, 기기 등을 이용하여, 실시예 2와 동일한 방법으로, [형광 표지 항유리형 PSA 항체-α(2,3) 당쇄 유리형 PSA-DNA 표지 항PSA 항체]의 복합체(복합체 1)의 검출을 행했다.
·영동 완충액 2(본 발명에 관한 다당류 함유)
5.0%(w/v) 폴리에틸렌글라이콜(PEG8000), 3%(w/v) 글리세롤, 10mM NaCl, 0.01% BSA를 함유하는 75mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.5)를 조제했다. 이것에 MAA(VECTOR사제)를 종농도(영동 완충액 2중의 농도) 4mg/mL가 되도록, 또 본 발명에 관한 다당류로서 덱스트란 황산 나트륨(M.W. 6,500~10,000)(Sigma사제)을, 종농도(영동 완충액 2 중의 농도)(w/v)가 0%, 3.0%, 5.0%, 5.5%, 6.0%, 6.7%, 7.0%, 7.7%, 8.1%가 되도록 첨가하고, 혼합한 것을 조제하여, 영동 완충액 2로 했다.
또한, 덱스트란 황산 나트륨 존재하에 복합체 1 및 복합체 2를 MAA와 반응시켰을 때의, 반응액 중의 MAA의 농도는 4mg/mL, 및 덱스트란 황산 나트륨의 농도(w/v%)는, 0%, 3.0%, 5.0%, 5.5%, 6.0%, 6.7%, 7.0%, 7.7%, 또는 8.1%이다.
(2) 결과
얻어진 전기 영동상(일렉트로페로그램)으로부터, MAA와 반응한 [형광 표지 항유리형 PSA 항체-α(2,3) 당쇄 유리형 PSA-DNA 표지 항PSA 항체]의 복합체(복합체 1) 분획의 피크 면적을, i30 장치 부속의 해석용 소프트로 구했다.
결과를 도 6에 나타낸다. 도 6에 있어서, 세로 축은 복합체 1분획의 피크 면적을 나타내고, 가로 축은 MAA와 복합체 1 및 복합체 2의 반응 시의 본 발명의 다당류(덱스트란 황산)의 농도(%(w/v%))를 나타낸다.
도 6으로부터 분명한 바와 같이, 복합체 1의 피크 면적은, 덱스트란 황산 나트륨의 첨가 농도 의존적으로 증대했다. 이 점으로부터, 당쇄와 렉틴과의 반응을 덱스트란 황산 나트륨의 존재하에 행함으로써, 덱스트란 황산 나트륨의 비존재하에 동 반응을 행한 경우와 비교하여, 복합체 1의 양이 증가하는 것을 알 수 있다.
또한, 영동용 시약 2는 폴리에틸렌글라이콜(PEG8000;5%)을 함유하므로, 덱스트란 황산 나트륨 농도가 "0(w/v)%"가 되는 조건하에서는, 폴리에틸렌글라이콜 존재하이고 또한 덱스트란 황산 나트륨의 비존재하에 당쇄와 렉틴과의 반응을 행하게 된다. 도 6으로부터 분명한 바와 같이, 폴리에틸렌글라이콜 존재하이고 또한 덱스트란 황산 나트륨의 비존재하에 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 반응을 행한 경우에는, 복합체 1을 거의 검출할 수 없었다. 이상의 결과로부터, 본 발명에 관한 다당류 비존재하에서, 고분자 폴리머인 폴리에틸렌글라이콜의 존재하에 당쇄를 갖는 물질과 렉틴을 반응시켜도, 그 복합체의 양을 증가시키는 효과가 없는 것을 알 수 있다.
산업상 이용가능성
본 발명의 복합체 형성 방법에 의하면, 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 복합체의 양이 증가한다.
이로 인하여, 당쇄를 갖는 물질의 측정에, 본 발명의 복합체 형성 방법을 적용함으로써, 당쇄를 갖는 물질의 고감도의 측정을 행할 수 있다.
또, 본 발명의 복합체 형성 방법은, 당쇄에 대한 렉틴의 친화성을 이용한 모든 반응, 검출, 측정, 당쇄의 분석 등에 이용할 수 있다. 그리고, 검출이나 측정의 감도를 높이고, 또 고정밀도의 당쇄의 분석을 행할 수 있다.

Claims (9)

  1. N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당 또는 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 다당을 갖는 수용성 화합물의 존재하에, 당쇄를 갖는 물질을 함유하는 시료와 상기 당쇄를 갖는 물질의 당쇄에 친화성을 갖는 렉틴을 접촉시키는, 상기 당쇄를 갖는 물질과 상기 렉틴과의 복합체 형성 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당 또는 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 다당을 갖는 수용성 화합물이, 상기 렉틴이 친화성을 갖는 당쇄를 갖지 않는 것인, 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 복합체 형성 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당 또는 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 다당을 갖는 수용성 화합물이 덱스트란 황산 혹은 그 염, 또는 콘드로이틴 황산 c 혹은 그 염인, 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 복합체 형성 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    하기 (1)~(2)로부터 선택되는, 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 복합체 형성 방법:
    (1) N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당이 덱스트란 황산 또는 그 염이며, 당쇄를 갖는 물질이 α페토프로테인-L3(AFP-L3)이고, 렉틴이 렌즈콩 렉틴이다.
    (2) N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당 또는 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 다당을 갖는 수용성 화합물이 덱스트란 황산 혹은 그 염, 또는 콘드로이틴 황산 c 혹은 그 염이며, 당쇄를 갖는 물질이 α(2,3) 당쇄 유리형 전립선 특이 항원이고, 렉틴이 다릅나무 렉틴이다.
  5. N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당 또는 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 다당을 갖는 수용성 화합물을 함유하여 이루어지는, 당쇄를 갖는 물질과 상기 당쇄를 갖는 물질의 당쇄에 친화성을 갖는 렉틴과의 복합체 형성 촉진제.
  6. 청구항 5에 있어서,
    N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당 또는 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 다당을 갖는 수용성 화합물이, 상기 렉틴이 친화성을 갖는 당쇄를 갖지 않는 것인, 복합체 형성 촉진제.
  7. 청구항 5에 있어서,
    N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당 또는 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 다당을 갖는 수용성 화합물이 덱스트란 황산 혹은 그 염, 또는 콘드로이틴 황산 c 혹은 그 염인, 복합체 형성 촉진제.
  8. 청구항 5에 있어서,
    하기 (1)~(2)로부터 선택되는, 복합체 형성 촉진제:
    (1) N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당이 덱스트란 황산 또는 그 염이며, 당쇄를 갖는 물질이 α페토프로테인-L3(AFP-L3)이고, 렉틴이 렌즈콩 렉틴이다.
    (2) N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 수용성 다당 또는 N-아세틸글루코사민을 갖지 않는 다당을 갖는 수용성 화합물이, 덱스트란 황산 혹은 그 염, 또는 콘드로이틴 황산 c 혹은 그 염이며, 당쇄를 갖는 물질이 α(2,3) 당쇄 유리형 전립선 특이 항원이고, 렉틴이 다릅나무 렉틴이다.
  9. 청구항 1에 기재된 방법으로 당쇄를 갖는 물질과 렉틴과의 복합체를 형성시킨 후, 상기 복합체의 양을 측정하는, 당쇄를 갖는 물질의 측정 방법.
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