JP4514919B2

JP4514919B2 - 前立腺特異抗原の糖鎖構造の違いに基づく前立腺癌と前立腺肥大とを識別する方法

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Publication number: JP4514919B2
Application number: JP2000245485A
Authority: JP
Inventors: 力大山
Original assignee: 力大山
Priority date: 2000-08-14
Filing date: 2000-08-14
Publication date: 2010-07-28
Anticipated expiration: 2020-08-14
Also published as: JP2002055108A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、前立腺癌と前立腺肥大を識別する新規な方法およびそのための診断キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅｃａｒｃｉｎｏｍａ：以下「ＰＣ」と略す）は男性の主要な死亡原因である。前立腺特異抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎ：以下「ＰＳＡ」と略す）はＰＣに対する最も重要な腫瘍マーカーとして認識されている（ＳｔａｍｅｙＴＡ，ＹａｎｇＮ，ＨａｙＡＲ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎａｓａｓｅｒｕｍｍａｒｋｅｒｆｏｒａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｏｆｔｈｅｐｒｏｓｔａｔｅ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ１９８７；３１７：９０９−９１６）。ＰＳＡは約３０ｋＤａの糖蛋白で、糖鎖はその約８％を占める。
ＰＣの初期診断に対する血清ＰＳＡ試験の有用性は既に多くの文献に記載されているが、前立腺肥大（ｂｅｎｉｇｎｐｒｏｓｔａｔｉｃｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ：以下「ＢＰＨ」と略す）に罹患している男性とＰＣに罹患している男性との間にグレーゾーン（ｇｒａｙｚｏｎｅ）と呼ばれるどちらとも言えない領域がある（ＣａｔａｌｏｎａＷＪ，ｅｔａｌ．，Ｕｓｅｏｆｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｆｒｅｅｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎｔｏｅｎｈａｎｃｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒｆｒｏｍｂｅｎｉｇｎｐｒｏｓｔａｔｅｄｉｓｅａｓｅ：Ａｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌ．ＪＡＭＡ１９９８；２７９，１５４２−１５４７）。この問題を解決するためにこれまでに幾つかの試み（例えば、ＰＳＡ密度、ＰＳＡ勾配、フリーＰＳＡ／トータルＰＳＡの比、等）は実施されてきたが、２つの病変（ｌｅｓｉｏｎｓ）の間にはかなり重複する点がある。
【０００３】
最近、ＰＳＡのアスパラギン（Ｎ）−結合糖鎖構造がＰＣ組織とＢＰＨ組織との間で相違するという、コンカナバリンＡ、植物凝集素Ｅ４（ＰＨＡ−Ｅ４）およびＰＨＡ−Ｌ４を用いた連続的レクチンアフィニティークロマトグラフィーによる研究結果が報告されている（ＳｈｕｈｅｉＳｕｍｉ，ｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＢ，７２７（１９９４）９−１４）。この報告によれば、ＰＳＡ中のＮ−結合糖鎖がヒト前立腺における癌化の過程で変化し、したがって、ＰＳＡ中のＮ−結合糖鎖がＰＣの診断ツールとして役立つ可能性があると記載されている。
しかしながら、ＰＳＡを用いてＢＰＨとＰＣを的確に識別して診断することは、これまで困難であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記のような従来技術の問題点を解決することを意図してなされたものである。すなわち、本発明は、これまで的確に識別して診断することが困難であったＢＰＨとＰＣの識別法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて、研究開発を行った。その結果、特定のレクチンがＢＰＨ患者のＰＳＡとＰＣ患者のＰＳＡとにおいて異なる反応性を示すことを見いだした。本発明はかかる知見に基づいてなされたものである。
【０００６】
すなわち、本発明は、ＰＳＡを含む試料をレクチンに接触させ、該レクチンとＰＳＡの糖鎖構造の親和性により分別されたＰＳＡを測定することにより、ＰＣとＢＰＨを識別する方法を提供する。
また、本発明は、ＰＳＡを含む血清を、イヌエンジュレクチン（以下、「ＭＡＡ」と略す）非結合分画とＭＡＡ結合分画とに分け、ＭＡＡ結合分画および分画前の血清のフリーＰＳＡおよび／またはトータルＰＳＡを測定することによってＰＣとＢＰＨを識別する方法を提供する。
さらに、本発明は、ＰＳＡを含む血清を、ニワトコレクチン（以下、「ＳＮＡ」と略す）非結合分画とＳＮＡ結合分画とに分け、ＳＮＡ結合分画および分画前の血清のフリーＰＳＡおよび／またはトータルＰＳＡを測定することによってＰＣとＢＰＨを識別する方法を提供する。これらのレクチンを用いてＰＣとＢＰＨを識別することはこれまで全く提案されたことのない方法である。
加えて、本発明は、レクチン並びにＰＣとＢＰＨを識別するための説明書を含むＰＣとＢＰＨを識別するための診断キットを提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明において使用するレクチンは、ＰＣとＢＰＨとを識別することができるものであれば特に限定されないが、イヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａａｍｕｒｅｎｓｉｓ）由来のＭＡＡおよびニワトコ由来のＳＮＡが特に好ましいものとして挙げられる。なお、ニワトコの種類は特に限定されず、ニワトコの例としては、ニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｕｓｓｉｅｂｏｌｄｉａｎａ）、クサニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、セイヨウニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｕｓｎｉｇｒａ）などを挙げることができる。ＭＡＡは、ＰＳＡ糖鎖構造の末端シアル酸残基のα（２，３）結合したものを特異的に認識する。他方、ＳＮＡは、ＰＳＡ糖鎖構造の末端シアル酸残基のα（２，６）結合したものを特異的に認識する。更に、ＰＨＡ−Ｌというレクチンも前立腺癌と前立腺肥大とを識別するのに有用である。
本発明の方法において使用するＰＳＡを含む試料としては、血清、前立腺の組織抽出液、尿等を挙げることができ、必要に応じてそのいずれを用いてもよい。
試料の分画は、レクチンアフィニティークロマトグラフィーにより行う。充填材としては、アガロース、セファロース等を用いることができる。
【０００８】
【実施例】
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
【０００９】
【実施例１】
アガロースに結合したＭＡＡ（ＥＹｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製，ＳａｎＭａｔｅｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）のカラムを、０．０２％のツィーン（ｔｗｅｅｎ）２０、０．０２％のアジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝液で平衡化させた。血清試料をそのカラムに入れて３０分間室温に保持し、その後５倍のカラム容量の上記緩衝液でカラムを洗った。この分画をＭＡＡ非結合分画と称した。ＭＡＡ結合分画を５倍のカラム容量の０．４Ｍ乳糖含有上記緩衝液で溶出した。プレカラム（ｐｒｅ−ｃｏｌｕｍｎ）、ＭＡＡ非結合分画およびＭＡＡ結合分画について、トータルＰＳＡおよびフリーＰＳＡを測定した。各分画からの試料をＰＳＡアッセイに供した。トータルＰＳＡおよびフリーＰＳＡは、それぞれＤＰＣイミュライズ（Ｉｍｍｕｌｙｚｅ）ＨＳ−ＰＳＡおよびＤＰＣイミュライズフリー−ＰＳＡ（ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＰｒｏｄｕｃｔｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製，ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって測定した。
新たに診断され、未治療の種々の臨床ステージにあるＰＣ患者１７名（ステージＢの患者４名、ステージＣの患者４名、ステージＤの患者９名）およびトータルＰＳＡのレベルが４．０ｎｇ／ｍｌと１０．０ｎｇ／ｍｌの間にあるＢＰＨ患者１５名から血清試料を採取した。患者の組織病理学的診断は経尿道的切除標本（ｔｒａｎｓｕｒｅｔｈｒａｌｒｅｓｅｃｔｉｏｎｓｐｅｃｉｍｅｎ）または前立腺生検（ｓｅｘｔａｎｔｐｒｏｓｔａｔｅｂｉｏｐｓｙ）を用いて確認した。ＰＣ患者およびＢＰＨ患者の中央年齢（ｍｅｄｉａｎａｇｅ）は、それぞれ７２歳（範囲：５５−８２歳）および６９歳（範囲：５５−８２歳）であった。ＰＣ患者のトータルＰＳＡ濃度およびＢＰＨ患者のトータルＰＳＡ濃度は、それぞれ１３８ｎｇ／ｍｌ（範囲：５−１２７０ｎｇ／ｍｌ）および８．８ｎｇ／ｍｌ（範囲：５．０−１０．０ｎｇ／ｍｌ）であった。ＰＣ標本の組織病理学的段階は次の通りであった。即ち、グリーソンスコア（Ｇｌｅａｓｏｎｓｃｏｒｅ）２−４である標本が４例、グリーソンスコア５−７である標本が６例、グリーソンスコア８−１０である標本が７例であった。
【００１０】
ＭＡＡ結合分画の割合は次の式により計算した。
ＭＡＡ結合分画の割合＝（ＭＡＡ結合分画中のＰＳＡ濃度／元の血清試料中のＰＳＡ濃度）×１００％
癌患者におけるフリーＰＳＡおよびトータルＰＳＡに対するＭＡＡ結合分画の割合は、それぞれ１６．９±５．２（平均±標準偏差）％および７．５±４．２％であった。一方、ＢＰＨの場合、その割合は、それぞれ０．６±０．２％および０．３±０．１％であった。特に、フリーＰＳＡのＭＡＡ結合分画の割合が、ＰＣとＢＰＨとの間で重複することなく明確な相違を示した（マン−ホイットニーＵ検定（Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙＵｔｅｓｔ），ｐ＜０．００１；図１を参照）。図１において、ＣａｎｃｅｒはＰＣを意味し、ＭＡＡｂｏｕｎｄｆｒａｃｔｉｏｎはＭＡＡ結合分画を意味する。ＭＡＡカラムからのＰＳＡの回収率は常に９７％より大きかった。異なる組織病理学的病型においても、臨床段階においてもＭＡＡ結合分画の割合に有意な差異はなかった。
【００１１】
血清ＰＳＡのレクチン結合活性を、Ｌｅｎｓｃｕｌｉｎａｒｉｓ（ＬｃＨ）、Ａｌｅｕｒｉａａｕｒａｎｔｉａ（ＡＡＬ）、Ｓａｍｂｕｃｕｓｎｉｇｒａ（ＳＮＡ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）の各レクチンを用いてスクリーニングした。試料はＭＡＡ結合アッセイにおいて使用された試料から選択した。フリーＰＳＡにおいては、ＳＮＡ結合分画の割合がＭＡＡ結合分画に対して鏡像の関係を示した（図２を参照）。図２において、ＣａｎｃｅｒはＰＣを意味し、ＳＮＡｂｏｕｎｄｆｒａｃｔｉｏｎはＳＮＡ結合分画を意味する。ＢＰＨ患者におけるフリーＰＳＡのＳＮＡ結合分画の割合が癌患者における割合に比べて有意に高かった（マン−ホイットニーＵ検定（Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙＵｔｅｓｔ），ｐ＜０．００１）。ＰＳＡアッセイの後に行ったＣｏｎＡアガロースカラムクロマトグラフィーによって、癌患者由来のフリーＰＳＡが多くの枝分かれしたＮ−グリカン類を有することが示された。これは以前に報告されたＰｒａｋａｓｈＳ，ＲｏｂｂｉｎｓＰＷ．Ｇｌｙｃｏｔｙｐｉｎｇｏｆｐｒｏｓｔａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ２０００；１０：１７３−１７６の内容に一致する。しかし、癌患者とＢＰＨ患者との間でかなりの重複が見られた。ＬｃＨ結合分画の割合に関してもＡＡＬ結合分画の割合に関しても、癌患者とＢＰＨ患者との間で有意な相違はなかった。
【００１２】
発癌には糖質構造の変化が伴う（ＦｕｋｕｄａＭ，Ｐｏｓｓｉｂｌｅｒｏｌｅｓｏｆｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅａｎｔｉｇｅｎｓ：ＣａｎｃｅｒＲｅｓ１９９６，５６，２２３７−２２４４）。臨床の場において、これまでに数多くの糖質腫瘍マーカーが使用されてきた。腫瘍細胞由来の糖質構造は、良性病変の糖質構造とは全く相違する。α−フェト蛋白（ＡＦＰ）およびヒト絨毛性性腺刺激ホルモンがこの変化に対する好例である。特定のレクチンに対する親和性の差異が良性病変と癌を識別するために用いられている。
ＰＳＡは１個のアスパラギン（Ｎ−）結合オリゴ糖を有する糖蛋白である。Ｂeｌａｎｇｅｒらは、ヒト精液由来のＰＳＡの糖質構造を分析し、２本鎖オリゴ糖（ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）とのＮ−糖鎖形成部位を１個有することを見いだした（ＢeｌａｎｇｅｒＡ，ｖａｎ−ＨａｌｂｅｅｋＨ，ＧｒａｖｅｓＨＣ，ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｓｓａｎｄｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｐｒｏｓｔａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ１９９５；２７：１８７−１９７）。前記Ｆｕｋｕｄａの論文には、ＰＣ細胞株由来のＰＳＡは、正常なＰＳＡよりも多くの枝分かれしたオリゴ糖類を有していることが記載されている。本発明者もＣｏｎＡアフィニティークロマトグラフィーによってＰＣ患者における血清ＰＳＡの枝分かれしたＮ−グリカン類の存在を発見した。しかしながら、本発明者は、ＰＣ患者とＢＰＨ患者との間にはＣｏｎＡ非結合分画（ＰＳＡの場合の枝分かれしたＮ−グリカン類と同一）の割合の著しい重複を見いだした。
ＭＡＡレクチンはシアル酸α（２，３）ガラクトース残基と特異的に反応する。前記Ｂeｌａｎｇｅｒの論文によると、精液ＰＳＡのオリゴ糖の末端構造はα（２，６）ガラクトースである。ＢＰＨ血清ＰＳＡと癌血清ＰＳＡとの間におけるＭＡＡ結合割合の明確な相違の分子的背景は、この末端シアル酸コンフォメーションによってもたらされると言ってもよい。ＢＰＨ患者におけるフリーＰＳＡのより高いＳＮＡ結合分画割合はこの仮説を裏付けている。
血流中において、ある種のＰＳＡは血清プロテアーゼインヒビター（例えば、α１−アンチキモトリプシンまたはα−２−マクログロブリン）と結合した形態で存在しており、その他のものは遊離の状態で存在している。トータルＰＳＡアッセイは，フリーのα１−アンチキモトリプシンとＰＳＡ−α１−アンチキモトリプシンとの複合体を検出する。α１−アンチキモトリプシンは、２本鎖および３本鎖糖質鎖（ｂｉ− ａｎｄｔｒｉ−ａｎｔｅｎｎａｒｙｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｃｈａｉｎｓ）を含有する糖蛋白である。したがって、トータルＰＳＡのＭＡＡ親和性はα１−アンチキモトリプシン上の糖質によって影響される。このメカニズムが、トータルＰＳＡキットに関する癌とＢＰＨとの間におけるＭＡＡ結合分画の著しい重複の主要原因であると言ってよい。
【００１３】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、従来困難であったＰＣとＢＰＨとの識別診断が可能となり、臨床面での応用が強く期待される。したがって、本発明は、医学、生物学等の分野における極めて有用な発明である。
【図面の簡単な説明】
【図１】前立腺癌患者および前立腺肥大患者におけるトータルＰＳＡおよびフリーＰＳＡに対するＭＡＡ結合分画の割合を示すグラフである。
【図２】前立腺癌患者および前立腺肥大患者におけるトータルＰＳＡおよびフリーＰＳＡに対するＳＮＡ結合分画の割合を示すグラフである。

Claims

前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を含む試料をＰＳＡ糖鎖構造の末端シアル酸残基のα（２，３）結合したものを特異的に認識するイヌエンジュレクチン（ＭＡＡ）に接触させ、該イヌエンジュレクチンとＰＳＡの糖鎖構造の親和性により分別されたＰＳＡを測定することにより、前立腺癌（ＰＣ）と前立腺肥大（ＢＰＨ）を識別する方法。
試料が、血清、組織抽出液、あるいは尿である請求項１記載の方法。
ＰＳＡを含む血清を、ＭＡＡ非結合分画とＭＡＡ結合分画とに分け、ＭＡＡ結合分画および分画前の血清のフリーＰＳＡ（蛋白非結合型ＰＳＡ）およびトータルＰＳＡ（蛋白結合型と蛋白非結合型を併せたＰＳＡ）、またはフリーＰＳＡを測定することによってＰＣとＢＰＨを識別する方法。
分画前の血清のフリーＰＳＡ値およびトータルＰＳＡ値に対する、レクチン結合分画のフリーＰＳＡ値およびトータルＰＳＡ値のパーセント比を取るか、あるいは分画前の血清のフリーＰＳＡ値に対する、レクチン結合分画のフリーＰＳＡ値のパーセント比を取り、その値からＰＣとＢＰＨを識別する請求項３記載の方法。
ＰＳＡ糖鎖構造の末端シアル酸残基のα（２，３）結合したものを特異的に認識するイヌエンジュレクチン（ＭＡＡ）並びにＰＣとＢＰＨを識別するための説明書を含むＰＣとＢＰＨを識別するための診断キット。