JP5431360B2

JP5431360B2 - 前立腺癌の判定方法

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Description

本発明は、前立腺癌の新規な判定方法に関し、特に前立腺癌と良性前立腺肥大症とを判定する新規な方法に関する。特に本発明は、前立腺特異抗原の糖鎖構造の差異に基づき、前立腺癌と良性前立腺肥大症とを判定する新規な方法に関する。

前立腺癌（prostate carcinoma：以下「ＰＣ」と称する）は男性の主要な死亡原因の１つである。前立腺特異抗原（prostate specific antigen：以下「ＰＳＡ」と称する）はＰＣに対する最も重要な腫瘍マーカーとして認識されている（たとえば、非特許文献１参照）。ＰＳＡは、約２６ｋＤａの分子量を有する２３７個のアミノ酸残基からなるタンパク部分と、該タンパク部分のアミノ酸残基（４５番目のＡｓｎなど）に結合した糖鎖部分とから構成される約３０ｋＤａの分子量を有する糖タンパク質、またはその誘導体である。糖鎖部分は、ＰＳＡの分子量の約８％を示す。

ＰＣの初期診断に対する血清ＰＳＡ濃度試験の有用性は既に多くの文献に記載されているが、良性前立腺肥大症（benign prostatic hyperplasia：以下「ＢＰＨ」と称する）に罹患している男性とＰＣに罹患している男性との間に、グレーゾーン（gray zone）と呼ばれるＰＣまたはＢＰＨの何れとも判断できないＰＳＡ濃度領域がある（たとえば、非特許文献２参照）。

この問題を解決するために、これまでにいくつかの試み（たとえば、ＰＳＡ密度、ＰＳＡ勾配（年間増加度）、遊離ＰＳＡ／全ＰＳＡの比などによる識別）が実施されてきたが、２つの病変（lesions）の間にはかなり重複する点がある。

最近、コンカナバリンＡ、植物凝集素Ｅ４（ＰＨＡ−Ｅ４）およびＰＨＡ−Ｌ４を用いた連続的レクチンアフィニティークロマトグラフィー法を用いた研究において、ＰＳＡのアスパラギン（Ｎ）に結合する糖鎖の構造が、ＰＣ組織とＢＰＨ組織との間で相違するという結果が報告された（非特許文献３参照）。この報告は、ＰＳＡ中のＮ−結合糖鎖がヒト前立腺における癌化の過程で変化すること、ならびにＰＳＡ中のＮ−結合糖鎖がＰＣの診断ツールとして役立つ可能性があることを記載している。

ＰＳＡの構造を検出する方法として、ＰＳＡの糖鎖に結合する結合分子を用いるいくつかの免疫学的方法が提案されてきている。たとえば、ＰＳＡをレクチンと接触させ、ＰＳＡの糖鎖とレクチンとの親和性に基づいて分別されたＰＳＡを測定することによって、ＰＣとＢＰＨとを識別する方法が報告されている（特許文献１参照）。この報告において、ＰＳＡの糖鎖とレクチン（イヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａａｍｕｒｅｎｓｉｓ）レクチンなど）との親和性の差異は、糖鎖末端のシアル酸のコンフォメーションに基づくと記載されている。しかしながら、ＰＣまたはＢＰＨに罹患した被験者のＰＳＡ糖鎖の具体的構造を決定していない。

また、ＰＳＡ中に少なくとも三分岐の糖鎖が存在するかどうかに基づいてＰＣを検定する方法が報告されている（特許文献２参照）。この方法においては、少なくとも三分岐の糖鎖に結合するが、一分岐および二分岐の糖鎖とは結合しない結合分子を用いる。用いることができる結合分子は、レクチン（ＰＨＡ−Ｌなど）および抗体を含む。

さらに、ＰＳＡ中のＮ−アセチルガラクトサミン(GalNAc)の含有量に注目した報告がなされている（非特許文献４参照）。該報告は、ＰＳＡ糖鎖の構造を詳細に検証し、精漿由来ＰＳＡ糖鎖におけるGalNAc含有量が２５％なのに対し、前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ）のＰＳＡ糖鎖にはGalNAcが６５％程度含まれる事を記載している。この著者らは膵ガン由来細胞株（Ｃａｐａｎ−１）においても同様の変化を観察しており（非特許文献５参照）、そこからGalNAcの含有量変化は癌性変異に起因するものであると類推している。

また、特異的抗体と多数のレクチンからなるアレイを用いてＰＳＡを含む対象タンパク質の糖鎖を網羅的に解析する手法が報告されている（非特許文献６参照）。この方法において、前立腺癌細胞株に由来するＰＳＡの糖鎖構造上の非還元末端にはLacdiNAc構造（Ｎ−アセチルガラクトサミン−Ｎ−アセチルグルコサミン構造）が多く存在する事が明らかにされている。しかしながら、ＰＣまたはＢＰＨに罹患した被験者のＰＳＡ糖鎖を対象にはしていない。

関連して、LacdiNAc構造を癌細胞に特異的に発現されるオリゴ糖配列であると開示し、生物学的試料中に検出されるその存在を指標に癌の検出を行なう方法について特許出願がなされている（特許文献３参照）。しかしながらその検出に関する具体的な手法は記載されておらず、さらにはＰＣとＢＰＨの判定を対象にしていない。

あるいはまた、ＰＳＡを含む標的糖タンパク質の糖鎖の糖プロファイルを決定することにより、被験者の臨床状態を評価する方法が提案されている（特許文献４参照）。該文献は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法を用いた解析において、ＰＣに罹患した被験者のＰＳＡ糖鎖が、正常なＰＳＡ糖鎖とは異なることを記載している。しかしながら、ＰＣに罹患した被験者のＰＳＡ糖鎖の具体的構造を記載していない。

上記のように、ＰＳＡ糖鎖構造が疾患により変化するという事象は多数報告されているが、ＢＰＨに罹患した被験者のＰＳＡ糖鎖の構造に関する詳細な報告は少なく、ＰＣ患者においてもＰＳＡ糖鎖の網羅的な解析は未だ例を見ない。さらに、具体的な糖鎖構造に基づいてＢＰＨとＰＣとを判定することは、これまでなされていない。

特開２００２−０５５１０８号公報特表２０００−５１４９１９号公報特表２００５−５０００５７号公報特表２００６−５１５９２７号公報

Stamey他, N. Engl. J. Med., 317, 909-916(1987) Catalona他, j. Am. Med. Assoc,279, 1542-1547(1998) Sumi他, J. Chromatogr. B, 727, 9-14 (1994) Peracaula他, Glycobiology,13(6),457-470 (2003) Peracaula他, Glycobiology,13(4),227-244 (2003) Kuno他, Mol. Cell. Proteomics, 8(1),99-108 (2009) Tabares他,Glycobiology, 16(2), 132-145 (2006) Bindukumar他, J.Chromatogr. B, Analyt. Technol. Biomed. Life. Sci., 813(1-2), 113-120 (2004) Zhang他, Clin. Chem., 41(11), 1567-1573(1995) Okada他, Biochim. Biophys. Acta,1525(1-2), 149-160 (2001)

したがって、本発明の課題は、被験者のＰＳＡ糖鎖を検出し、特に、ＢＰＨまたはＰＣに罹患した被験者のＰＳＡ糖鎖を検出し、ＰＳＡの糖鎖構造に基づいて、ＢＰＨとＰＣとを的確に判定する方法などを提供することである。

本発明者らは、ＰＳＡ糖鎖において、LacdiNAc構造の存在のみを指標にするのではなく、LacdiNAcを有する糖鎖とLacdiNAcを持たない糖鎖の比率に着目することによって、前立腺癌であることの判定、特に、前立腺癌と良性前立腺肥大症とを判定できることを見出して、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下の方法である。
［１］
被験者由来の試料中のＰＳＡの糖鎖構造を分析する工程を含み、LacdiNAc（Ｎ−アセチルガラクトサミン−Ｎ−アセチルグルコサミン）を有する糖鎖（LacdiNAc（＋））の量が、LacdiNAcを持たないがLacNAc（ガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン）を有する糖鎖（LacdiNAc（−））の量の３０％を超える際に前立腺癌であると判定することを特徴とする前立腺癌の判定方法。
［２］
被験者由来の試料中のＰＳＡの糖鎖構造を分析する工程を含み、LacdiNAc（Ｎ−アセチルガラクトサミン−Ｎ−アセチルグルコサミン）を有する糖鎖（LacdiNAc（＋））の量が、LacdiNAcを持たないがLacNAc（ガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン）を有する糖鎖（LacdiNAc（−））の量の３０％を超える際に前立腺癌であると判定し、３０％以下である際に良性前立腺肥大症であると判定することを特徴とする［１］に記載の前立腺癌の判定方法。
［３］
上記ＰＳＡの糖鎖構造の分析を、上記ＰＳＡに対してレクチンを作用させる方法、上記ＰＳＡに対して抗体を作用させる方法、高速液体クロマトグラフィー法もしくは質量分析法、またはこれらを組み合わせた分析手段により行うことを特徴とする［１］に記載の前立腺癌の判定方法。

［４］
上記ＰＳＡの糖鎖構造の分析を、上記ＰＳＡに対してレクチンを作用させる方法、上記ＰＳＡに対して抗体を作用させる方法、高速液体クロマトグラフィー法もしくは質量分析法、またはこれらを組み合わせた分析手段により行うことを特徴とする［２］に記載の前立腺癌の判定方法。

［５］
（１）被験者由来の試料からＰＳＡを精製する工程と、
（２）工程（１）で精製したＰＳＡからＰＳＡ誘導体を調製する工程と、
（３）工程（２）で得られたＰＳＡ誘導体を標識する工程と、
（４）工程（３）で得られた標識化ＰＳＡ誘導体を質量分析法により分析する工程を含み、LacdiNAc（Ｎ−アセチルガラクトサミン−Ｎ−アセチルグルコサミン）の構造の有無に起因する質量差４１で示される一対のシグナルを選定し、LacdiNAcを有する糖鎖（LacdiNAc（＋））に由来するシグナル強度が、LacdiNAcを持たないがLacNAc（ガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン）を有する糖鎖（LacdiNAc（−））に由来するシグナル強度の３０％を超える際に前立腺癌であると判定することを特徴とする［３］に記載の前立腺癌の判定方法。

［６］
（１）被験者由来の試料からＰＳＡを精製する工程と、
（２）工程（１）で精製したＰＳＡからＰＳＡ誘導体を調製する工程と、
（３）工程（２）で得られたＰＳＡ誘導体を標識する工程と、
（４）工程（３）で得られた標識化ＰＳＡ誘導体を質量分析法により分析する工程を含み、LacdiNAc（Ｎ−アセチルガラクトサミン−Ｎ−アセチルグルコサミン）の構造の有無に起因する質量差４１で示される一対のシグナルを選定し、LacdiNAcを有する糖鎖（LacdiNAc（＋））に由来するシグナル強度がLacdiNAcを持たないがLacNAc（ガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン）を有する糖鎖（LacdiNAc（−））に由来するシグナル強度の３０％を超える際に前立腺癌であると判定し、３０％以下である際に良性前立腺肥大症であると判定することを特徴とする［４］に記載の前立腺癌の判定方法。
［７］
上記工程（２）において調製されるＰＳＡ誘導体が、ＰＳＡ由来の糖鎖またはＰＳＡ由来の糖ペプチドであることを特徴とする［５］に記載の前立腺癌の判定方法。
［８］
上記工程（２）において調製されるＰＳＡ誘導体が、ＰＳＡ由来の糖鎖またはＰＳＡ由来の糖ペプチドであることを特徴とする［６］に記載の前立腺癌の判定方法。

本発明によれば、上記した問題点と課題を解決できる。すなわち、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の糖鎖構造を検出し、その構造の差異を基に、前立腺癌であるか否かを的確に判定でき、特に、前立腺癌であるか良性前立腺肥大症であるかを的確に判定する方法を提供できる。

具体的には、上記のような工程を採ることによって、血清などの中のＰＳＡ濃度がほぼ同レベルの被験者についても、そのＰＳＡ糖鎖に含まれる一連のLacdiNAc（＋）糖鎖構造およびLacdiNAc（−）糖鎖構造のシグナル強度比百分率Ｒ値を測定することによって、ＰＣとＢＰＨとを高精度で識別判定できる。また、ＰＣおよびＢＰＨの両方において、LacdiNAc（＋）／LacdiNAc（−）のシグナル強度比百分率Ｒ値は、血清ＰＳＡ濃度に相関せず、ＰＣにおいては少なくとも閾値Ｒより大きく、ＢＰＨにおいては閾値Ｒ以下であるため、ＰＳＡ濃度によらず閾値Ｒの数値を設定するだけで、高精度でＰＣか否かを判定できる。

したがって、現行のＰＣのスクリーニングに繁用されている血清中ＰＳＡ濃度を測定する方法において高いＰＳＡ値（例えば、４ｎｇ／ｍＬ以上）を示し、苦痛な２次検査である針生検を受けていた被験者についても、本発明を適用することによって、不必要な検査を回避することができる。

また、血清中ＰＳＡ濃度は年齢とともに上昇する傾向があることが知られている。よって、特に、今後の高齢化社会において、高精度でＰＣか否かを判定し、特にＰＣとＢＰＨとを判定する本発明手法は、医学的な貢献のみならず、医療経済にも良好な効果を奏する。

実施例１で得られたネガティブイオンＭＳスペクトルを示す図である。実施例１においてｍ／ｚ＝２１１８で得られたシグナルＰ２_Ｉをプリカーサーイオンとして得られるネガティブイオンＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。実施例４で得られたポジティブイオンＭＳスペクトルを示す図である。実施例５で得られたポジティブイオンＭＳスペクトルを示す図である。実施例６で得られたポジティブイオンＭＳスペクトルを示す図である。実施例７で得られたポジティブイオンＭＳスペクトルを示す図である。

以下、本発明について説明するが、本発明は以下の実施の具体的態様に限定されるものではなく、任意に変形して実施することができる。

本発明に係るＰＣの判定方法、特にＰＣとＢＰＨとの判定方法は、対象をレクチン、特異的抗体といった特異的結合分子、高速液体クロマトグラフィー、質量分析法、あるいはその組み合わせにより分析する工程において、標準閾値Ｒ_(S)を適応した際に、該検出対象のLacdiNAc（＋）糖鎖構造を含む集合がLacdiNAc（−）糖鎖構造を含む集合の３０％を超える際に前立腺癌であると判定し、特に３０％以下である際に良性前立腺肥大症であると判定する事を特徴とする。

本発明においては、「Ｎ−アセチルガラクトサミン−Ｎ−アセチルグルコサミン」を「LacdiNAc」と略記し、「ガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン」を「LacNAc」と略記する。また、LacdiNAcを有する糖鎖を「LacdiNAc（＋）」と略記し、LacdiNAcを有さないがLacNAcを有する糖鎖を「LacdiNAc（−）」と略記する。
また、本発明において用いられる「被験者由来の試料」は、血液（血清、血漿などを含む）、尿、精液（精漿）などの体液、細胞・組織などを含む。

特に好ましくは、本発明に係るＰＣの判定方法、特にＰＣとＢＰＨとの判定方法は、質量分析法により分析する工程において、
（１）被験者由来の試料からＰＳＡを精製する工程と、
（２）工程（１）で精製したＰＳＡからＰＳＡ誘導体を調製する工程と、
（３）工程（２）で得られたＰＳＡ誘導体を標識する工程と、を含み、
（４）工程（３）で得られた標識化ＰＳＡ誘導体を分析し、標準閾値Ｒ_(S)を適応した際に、該標識化ＰＳＡ誘導体中のLacdiNAc（＋）糖鎖構造に由来するシグナル強度が、LacdiNAc（−）糖鎖構造に由来するシグナル強度の３０％を超える際に前立腺癌であると判定する事を特徴とし、特に３０％以下である際に、前立腺癌ではない、または良性前立腺肥大症であると判定する事を特徴とする。

工程（１）において、被験者由来の試料から、ＰＳＡを精製する。工程（１）は、当該技術において知られている任意の方法で実施することができる。

あるいは、工程（１）において被験者由来の血清を試料として用いる場合、数種のアフィニティークロマトグラフィーを組み合わせた方法を用いることができる。たとえば、被験者由来の血清に対して、親イオウ吸着に基づくアフィニティー担体であるフラクトゲル(Fractogel)（登録商標） EMD TA）やCibacron Blue 3GAなど、あるいは、プロテインＡセファロースCL-4B、HiTrapヘパリンカラムＨＰＬＣなどを行う（非特許文献７参照）。その溶離液をエタノールアミンで処理して、遊離のＰＳＡを得る。得られたＰＳＡを前述の免疫沈降法を用いて処理し、ＰＳＡ誘導体を得る。前述の文献によれば、得られたＰＳＡ誘導体の解析を行うために、被験者由来の試料中に約６３μｇのＰＳＡが必要であった。

さらに、工程（１）における試料として被験者由来の血清以外を用いる場合、工程（１）の親イオウ吸着に基づく親和性担体を用いて、ＰＳＡの精製を実施することができる（非特許文献８参照）。たとえば、3S,T-gelスラリー（フラクトゲル（登録商標） EMD TA）を用いるクロマトグラフィーによって、ヒト精液、前立腺癌患者の血清、前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ）培養液の上清からＰＳＡを精製し、ウェスタンブロット法を用いて、ＰＳＡ単体またはα１−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）などとの複合体を同定することができる。

あるいはまた、被験者由来の精液を試料として用いる場合、親イオウ吸着に基づくアフィニティークロマトグラフィーとゲル濾過を組み合わせることによって、ＰＳＡを精製してもよい（非特許文献８参照）。たとえば、フラクトゲル（登録商標） TA 650(S)と、ゲル濾過担体であるUltrogel AcA-54とを組み合わせることができる。この組み合わせ方法では、遊離のＰＳＡを７２％の収率で回収することができた。

あるいはまた、工程（１）における試料として被験者由来の精液を用いる場合、以下の方法を用いてＰＳＡの精製を行うことができる（非特許文献９および１０参照）。たとえば、硫酸アンモニウムの添加による沈殿、疎水性相互作用クロマトグラフィー（Phenyl-Sepharose-HPカラム）、ゲル濾過（Sephacryl S-200カラム）、およびアニオン交換クロマトグラフィー（Resourse Qカラム）を順次行うことによって、ＰＳＡを精製することができる。この方法において、試料中に３３．９ｍｇのＰＳＡが含まれる場合、最終的なＰＳＡの回収率が３０．１％であったことが報告されている。

さらに、工程（１）における試料として被験者由来のアンドロゲン依存性のＬＮＣａＰを用いる場合、限外濾過と各種クロマトグラフィーとを組み合わせた方法によって、ＰＳＡを精製することができる（非特許文献５参照）。たとえば、適切な手段で培養したＬＮＣａＰを含む培養液の限外濾過（５ｋＤａカットオフ・ポリスルホン膜(Millipore)）、アフィニティークロマトグラフィー（Cibacron Blue 3GA）、ゲル濾過（Biogel P60）、アフィニティークロマトグラフィー（Cibacron Blue 3GA）、および逆相クロマトグラフィー（214TP-RP C4、HPLC使用）を順次行うことによって、ＰＳＡを精製することができる。

次いで、工程（２）において、精製されたＰＳＡからＰＳＡ誘導体を調製する。本発明における「ＰＳＡ誘導体」とは、ＰＳＡ由来の糖鎖または糖ペプチドを意味し、具体的には、ＰＳＡから分離される糖鎖または糖ペプチドを意味する。たとえば、ＰＳＡに対して、エンドプロテアーゼ（サーモリシン、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、プロリン特異的エンドペプチダーゼ、プロテアーゼＶ８、プロテイナーゼＫ、アミノペプチダーゼＭ，カルボキシペプチダーゼＢなど）またはペプチド結合開裂剤を作用させて糖ペプチドを形成し、糖ペプチドを工程（３）で使用してもよい。

別法として、ＰＳＡを酵素的に処理して遊離の糖鎖を形成してもよい。あるいはまた、ＰＳＡから誘導された前述の糖ペプチドを酵素的に処理して遊離の糖鎖を形成してもよい。このようにして得られた糖鎖を工程（３）で使用してもよい。この酵素的処理においては、たとえば、ペプチドＮ−グリカナーゼ（PNGase F、PNGase A）、エンドグリコシダーゼ（EndoH, EndoF）、および／または、１つまたは複数のプロテアーゼ（トリプシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃなど）を用いることができる。あるいはまた、ＰＳＡまたはＰＳＡから誘導された糖ペプチドを化学的手段（無水ヒドラジンによる分解、還元的または非還元的β−脱離など）を用いて処理して、遊離の糖鎖を形成してもよい。このようにして得られる遊離の糖鎖を、以下の工程（３）で使用してもよい。また、シアリダーゼ処理または酸加水分解を行なってシアル酸を除去した糖鎖または糖ペプチドを用いてもよい。

また、工程（１）の最終段階で電気泳動を行い、ＰＳＡのバンドを切り出した場合、切り出したバンドに対して上記の反応剤を作用させてゲル内消化を行い、糖ペプチドおよび／または糖鎖を生成してもよい。

工程（３）において、ＰＳＡ誘導体を標識する。標識化合物としては、ナフタレン、アントラセン、ピレンなどの縮合多環炭化水素部分と、分析対象の分子と結合することが可能である反応性官能基と、必要に応じて該縮合多環炭化水素部分と該反応性官能基とを連結するスぺーサー部分とを有する化合物を用いることができる。

縮合多環炭化水素部分は、好ましくはピレンである。反応性官能基は、シアル酸のカルボキシ基または糖の還元末端との反応性を有し、たとえばジアゾメチル基、アミノ基、ヒドラジド基などを含む。スペーサー部分は、たとえば直鎖または分岐状のアルキレン基などを含む。本発明において用いることができる標識化合物は、１−ピレニルジアゾメタン（ＰＤＡＭ）、１−ピレンブタン酸ヒドラジド（ＰＢＨ）、１−ピレン酢酸ヒドラジド、１−ピレンプロピオン酸ヒドラジド、アミノピレン（構造異性体を含む）、１−ピレンメチルアミン、１−ピレンプロピルアミン、１−ピレンブチルアミンなどを含む。最も好ましく用いられる標識化合物は、ＰＤＡＭである。

工程（３）は、ＰＳＡ誘導体および標識化合物を混合し、加熱することによって行うことができる。加熱は、たとえば４０〜５０℃の範囲内の温度で実施することができる。任意選択的に、水溶性カルボジイミドまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどの促進剤の存在下で、標識を行ってもよい。より好適には、ＭＡＬＤＩ法にて用いられるターゲットプレート上にＰＳＡ誘導体の溶液を滴下して乾燥させ、その上に標識化合物の溶液を滴下して加熱乾燥させることによって、標識を実施することができる。

本発明は、標識されたＰＳＡ誘導体を質量分析法により分析する方法に関する。以下、「質量分析法による分析」を「ＭＳ分析」と略記することがある。工程（４）のＭＳ分析において用いることができるイオン化部は、マトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）型、またはエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）型の装置を含む。

本発明においては、ピレンなどの縮合多環炭化水素基を結合することによって、ＭＡＬＤＩ法における標識されたＰＳＡ誘導体のイオン化効率が、未標識のＰＳＡ誘導体と比較して向上する。また、本発明の標識されたＰＳＡ誘導体は、ＥＳＩ法の適用がより容易である。なぜなら、ＰＳＡ誘導体は親水性が高く、ＥＳＩ法に用いる試料の有機溶液を得るのが困難であるのに比較して、本発明の標識されたＰＳＡ誘導体は、縮合多環炭化水素基の導入によって有機溶媒に可溶性となっているためである。

工程（４）のＭＳ分析において用いることができる分離部は、飛行時間型（ＴＯＦ型）、二重収束型、四重極収束型などの当該技術において知られている任意の装置を含む。特に、ＭＳ^ｎ（ｎ≧２）分析を行うことを考慮して、イオントラップを有する装置を用いることが便利である。特に好適な装置は、四重極イオントラップ−飛行時間型（ＱＩＴ−ＴＯＦ）である。ここで、飛行時間型装置として、リニア型、リフレクトロン型または周回型のいずれの装置を用いてもよい。

次いで、得られたＭＳスペクトルにおいて、LacdiNAc構造の存在／非存在に起因する、１分子のＮ−アセチルガラクトサミン(GalNAc)／ガラクトース(Gal)置換に相当する質量差４１のシグナルＰ１およびＰ２の対を選定する。ここで、Ｐ２はGalNAc置換糖鎖（LacdiNAc（＋）糖鎖）に相当するシグナルを意味し、Ｐ１はGalNAc非置換糖鎖（LacdiNAc（−））に相当するシグナルを意味する。そして、LacdiNAc（−）糖鎖に相当するシグナルの強度Ｓ（Ｐ１）、および、LacdiNAc（＋）糖鎖に相当するシグナルの強度Ｓ（Ｐ２）を求め、そのシグナル強度比百分率Ｒ値を下記式で計算する。なお、本発明における「シグナル強度」は、例えば、ＭＳスペクトルにおける、モノアイソトピック質量シグナル、最大強度質量シグナル、モノアイソトピック質量シグナル及び同位体イオンシグナルにおける任意の選択の和、あるいはその平均の強度などを挙げることができる。
以下、「シグナル強度比百分率Ｒ値」を単に「Ｒ値」と略記する場合がある。
Ｒ値＝［Ｓ（Ｐ２）／Ｓ（Ｐ１）］×１００

標準閾値Ｒ_(S)＝３０％を適応した際、得られたＲ値が３０％より大きい場合、「被験者がＰＣに罹患している。」と判定し、得られたＲ値が３０％以下である場合、「被験者がＰＣに罹患していない。」または「ＢＰＨに罹患している。」と判定する。閾値Ｒは標準閾値Ｒ_(S)＝３０％を基準に該判定対象の量に起因する検出感度および／または判定精度に関連して、上下１０％程度の幅で設定する事ができる。閾値Ｒは高精度判定であれば２０％程度、該判定対象が微量である場合には４０％程度に設定する事が好ましい。

本工程において得られるＭＳスペクトルにおいて、質量差４１の複数のシグナルの対を選定して、上記の判定手順を実施してもよい。あるいはまた、標識化合物および／またはシアル酸残基などが質量分析装置中で脱離したシグナル中で、質量差４１のシグナルの対を選定し、上記の判定手順を実施してもよい。

本発明は、上記したように、被験者由来の試料中のＰＳＡの糖鎖構造を質量分析法により分析する前立腺癌の判定方法であると共に、上記のＰＳＡの糖鎖構造の分析を、上記のＰＳＡに対してレクチンを作用させる方法、上記のＰＳＡに対して抗体を作用させる方法、高速液体クロマトグラフィー法もしくは上記した質量分析法、またはこれらを組み合わせた分析手段により行う前立腺癌の判定方法でもある。

本発明における「ＰＳＡ」とは、被験者由来の試料そのものでもよいし、それから抽出したり精製したりしたものでもよい。さらに、「ＰＳＡ」は、アンチキモトリプシンなどと複合体を形成したＰＳＡでもよいし、遊離ＰＳＡでもよいし、それらから調製した糖鎖、糖ペプチドでもよい。

本発明は、ＰＳＡの分析手段として、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」と略記する場合がある）を用いる方法に関する。例えば、Amideカラムなどに代表される順相ＨＰＬＣにより検出対象の分子量に依存した分離、あるいはＯＤＳカラムなどに代表される逆相ＨＰＬＣにより検出対象の構成糖鎖配向に依存した分離を行なう。分析で得られるクロマトグラムから、LacdiNAc（＋）糖鎖およびLacdiNAc（−）糖鎖に相当するピークの対を選択し、そのピーク高さまたは面積から算出したＲ値により判定をおこなう。検出には任意の吸光波長を用いることができ、あるいは選択した標識化合物に特定の蛍光波長を用いることができる。

あるいは、本発明は、ＰＳＡに対して特異的結合分子を作用させ、その組み合わせによる分析手法を用いる方法に関する。特異的結合分子は、数種のレクチン、抗体およびそれらの断片を含む。例えば、ＥＬＩＳＡプレート、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜、ガラスあるいはシリコン製アレイチップなどに固相化した検出対象に特異的結合分子を反応させ、LacdiNAc構造、および対象物全体を定量的に検出する。

検出には、アルカリフォスファターゼやホースラデッシュペルオキシダーゼといった酵素を結合させたレクチンや抗体を用い、酵素反応を介してブロモクロロインドリル燐酸（ＢＣＩＰ）またはニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）を用いた化学発色、あるいはルミノール試薬を用いた化学発光を用いることができ、あるいはまた、表面プラズモン共鳴を用いることができる。関連して、固相化した特異的結合分子に対して該検出対象を結合させ、そこに別種の特異的レクチン、または特異的抗体を反応させて、一連の検出を行う事ができる。本発明では、「特異的抗体」を単に「抗体」と、「特異的レクチン」を単に「レクチン」と略記する場合がある。

特異的結合分子としてレクチンを用いる場合、例えば、非還元末端GalNAcを認識するＷＦＡレクチン（Wisteria floribunda agglutinin）をＰＳＡに作用させることで、LacdiNAc（＋）糖鎖を検出する事ができる。特異的結合分子として抗体を使用する際、ＰＳＡに対する抗体は、市販のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用することができる。

特異的結合分子として特定の糖鎖構造を認識する抗体を使用する方法に関連して、本発明は、LacdiNAc構造を認識するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する次の工程に関する。まず、LacdiNAc構造を含む糖鎖構造、その類似体、あるいは誘導体を、生物試料から調製あるいは化学的若しくは生化学的に合成し、同構造の多価結合体を作製する。次に、免疫反応活性化物質と共に多価結合体で動物を免疫する。この時、多価結合体は免疫反応活性化物質に結合していることが好ましく、結合体は、単独で、あるいは更なる免疫反応活性化物質と共に免疫に用いる。より好ましくは、多価結合体を少なくとも一種のアジュバント分子と共に抗体産生生物に注射、あるいは粘膜投与する。

以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限りこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１
（ａ）工程（１）ＰＳＡの単離
最初に血清中の免疫グロブリンの除去を行った。４ｍＬのプロテインＡアガロース(PIERCE)をディスポーザブルプラスティックカラム(PIERCE)に充填し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて平衡化した。プロテインＡアガロース充填カラムに対して、ＢＰＨと診断された被験者（Ｔ−１６）の血清およびＰＢＳの混合物を添加し、２倍のカラムボリューム（ＣＶ）のＰＢＳにて洗浄した。この担体に結合しないＰＳＡを含む画分を採取し、最終濃度が１ＭになるようにＮａ_２ＳＯ_４を加えた。

次に、血清中の主要タンパクであるアルブミンの除去を行った。１ｍＬのフラクトゲル（登録商標） EMD TA(S)(Merck)を、ディスポーザブルプラスティックカラムに充填し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、Ｎａ_２ＳＯ_４（１Ｍ）含有）にて平衡化させた。フラクトゲル充填カラムに対して上述のＰＳＡを含む画分を添加し、送液ポンプを用いて７ＣＶの同緩衝液でカラムを洗浄した。次いで、吸着したタンパクを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、Ｎａ_２ＳＯ_４不含）にて溶出し、ＰＳＡを含む画分を得た。

次に、血清中のＰＳＡとa_１−アンチキモトリプシンとの複合体（ＰＳＡ−ＡＣＴ）から、ＰＳＡを遊離させた。前述のＰＳＡを含む画分に同量の４Ｍエタノールアミン溶液（ｐＨ１０．５）を加え、最終のエタノールアミン濃度を２Ｍとし、２５℃において１４時間にわたって振盪して、反応させた。その後、反応混合物を氷浴で冷却しながら、２Ｍの塩酸を加え、反応混合物を中和した。

次に、ＰＳＡ抗体を用いた免疫沈降を行った。最初に、ダイナビーズ（登録商標）プロテインＧ（Invitrogen）に対して、市販の抗ヒトＰＳＡ・ウサギポリクローナル抗体（DAKO社製）を結合させ、続いてジメチルピメルイミデート（ＤＭＰ、PIERCE）を用いて処理して、抗体と磁気ビーズを架橋させて、抗体磁気ビーズを得た。前述の中和された反応混合物に対して、ＰＳＡ抗体磁気ビーズを添加し、４℃にて１時間にわたって振盪した。続いて、ＰＳＡ抗体磁気ビーズを、０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回、およびＰＢＳで１回洗浄した。さらに、ＰＳＡ抗体磁気ビーズに１Ｍプロピオン酸を加え、４℃にて４０分間にわたって振盪し、ＰＳＡ抗体磁気ビーズに吸着したタンパクを溶出させて回収した。溶出したタンパクを遠心式濃縮機（SpeedVac）により乾固させた。

乾固させたタンパクを、酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ、栄研化学）および電気泳動にて分析した結果、最初の血清中に含まれていたＰＳＡの約５０％を回収できることが判明した。

０．１２５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）に対して、１０質量％のメルカプトエタノール、４質量％のＳＤＳ、１０質量％のショ糖、０．００４質量％のブロモフェノールブルーを添加して、サンプルバッファーを調製した。２０μＬのサンプルバッファーに対して工程（１）で精製したＰＳＡを添加し、３分間にわたって１００℃に加熱し、そして氷浴中に静置して冷却した。得られたサンプルを、１０質量％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により分離した。電気泳動による分離後、ポリアクリルアミドゲルを純水で軽く洗浄し、引き続いてSYPRO（登録商標） Ruby (Invitrogen)による染色を行なった。染色されたタンパク質を含むゲルを切り出し、１．５ｍＬチューブに移した。切り出したゲルを、純水、５０％アセトニトリル水溶液、およびアセトニトリルを用いて順次洗浄し、そしてゲルを乾燥させた。

また、別途、４〜１０ｎｇ／ｍＬのＰＳＡ濃度を有する血清１ｍＬを用いて上記の手順を繰り返したところ、ウェスタンブロットにてＰＳＡのバンドが強く観察された。この結果から、このように低い濃度のＰＳＡであっても、前述の方法によって効率よく精製することが可能であることが証明された。

（ｂ）工程（２）糖鎖（ＰＳＡ誘導体）の調製
工程（１）で得られた乾燥ゲルの入ったチューブに対して、１０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）および２５ｍＭの炭酸水素アンモニウムを含む水溶液（ｐＨ８．０）を加え、遮光条件下１時間にわたって５６℃で振盪して還元反応を行い、チューブ内の溶液を除去した。チューブに対して５５ｍＭのヨードアセトアミドを含む水溶液を加えて、遮光条件下４５分間にわたって室温で振盪してアルキル化反応を行い、チューブ内の溶液を除去した。還元およびアルキル化を行ったゲルを、２５ｍＭの炭酸水素アンモニウム水溶液（ｐＨ８．０）、およびアセトニトリルで洗浄し、その後、ゲルを乾燥させた。

上記により得られたゲルに、リシルエンドペプチダーゼ（登録商標）溶液（２５０ｎｇ、和光純薬（質量分析グレード）、２５ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（ｐＨ８．０）を加えて、４５分間にわたって氷中で静置し、ゲルを膨潤させた。その後、１８時間にわたって３７℃において、反応混合物を緩やかに撹拌した。７５％アセトニトリル水溶液（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）を加えて、２０分間にわたって振盪して抽出を行い、溶液を回収した。

回収した溶液を遠心濃縮機によって乾固させた。残渣に対して、１μｇのフェタブロックＳＣ（ロシュ・ダイアグノスティックス）を含む５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（ｐＨ８．０）を加え、引き続いて１単位（１単位／μＬ）のペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（Sigma）を加えて、１８時間にわたって３７℃で振盪した。振盪終了後、反応混合物に１μＬのトリフルオロ酢酸１％水溶液を添加した。オクタデシル（Ｃ１８）シリカ担体が充填されたＣ１８チップを用いた反応混合物の吸引および排出を繰り返して、ペプチドを吸着させて、反応混合物中の糖鎖と分離し、糖鎖画分を得た。続いて、７０％アセトニトリル０．１％トリフルオロ酢酸水溶液を用いて、Ｃ１８チップからペプチドを溶出させて、ペプチド画分を得た。得られたペプチド画分からは、ＰＳＡに由来するペプチドが検出された。

マイクロスピンカラムに３０ｍｇのカーボングラファイト（ＧＬサイエンス）を充填して洗浄した。グラファイト充填マイクロスピンカラムに対して糖鎖画分を加え、さらに洗浄液として５％アセトニトリル水溶液（０．１％トリフルオロ酢酸）を加え、遠心分離（３００×ｇ、１分〜２分）により洗浄した。洗浄液を除去した後に、５０％アセトニトリル水溶液（０．１％トリフルオロ酢酸）を加え、遠心分離（３００×ｇ、１分〜２分）を行い、糖鎖を溶出させ、糖鎖溶出液を得た。回収した糖鎖溶出液を、遠心濃縮機を用いて乾固させ、２μＬの純水に再溶解させて、糖鎖溶液を得た。

（ｃ）工程（３）糖鎖（ＰＳＡ誘導体）の標識
ＭＡＬＤＩ用ターゲットプレートの上に、工程（２）で得られた糖鎖溶液０．５μＬを滴下し、風乾させた。次に、ターゲットプレート上に、１−ピレニルジアゾメタン（ＰＤＡＭ、５００ｐｍｏｌ）のＤＭＳＯ溶液０．２５μＬを滴下し、約２５分間にわたって４０℃に加熱し、乾燥させた。この操作によって、ターゲットプレート上に、ＰＤＡＭで標識された糖鎖が得られた。

（ｄ）工程（４）ＭＳ分析
工程（３）で得られた標識糖鎖を担持したターゲットプレートに対して、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）の５０％アセトニトリル溶液（濃度１０ｍｇ／ｍＬ）０．５μＬを滴下し、室温において乾燥させた。

得られたターゲットプレートをＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦＭＳ装置ＡＸＩＭＡ−ＱＩＴ（島津製作所／Kratos社製）に設置し、ＭＳ分析を行った。定量的な比較を行うために、ターゲットプレート上の試料の広がりよりも大きい外周で囲まれた領域をラスタースキャンし、有意な全シグナルを積算した。得られたＭＳスペクトルの代表例を図１に示す。

別途、ｍ／ｚ＝２０７７およびｍ／ｚ＝２１１８で得られるイオンをプリカーサーイオンとして用いたＭＳ^２分析を行った結果、図１中のｍ／ｚ＝２０７７のシグナルＰ１が（化１）Ａに示すLacdiNAc（−）糖鎖に相当し、ｍ／ｚ＝２１１８のシグナルＰ２が（化１）Ｂに示すLacdiNAc（＋）糖鎖に相当することが判明した。なお、式中、「Sia」はＮ−アセチルノイラミン酸を示し、「Glc」はグルコース、「Gal」はガラクトース、「Man」はマンノースをそれぞれ示し、「Fuc」はフコースを示す。また、式中括弧は２ヶ所の非還元末端のいずれかへの結合を示す。他の化学式においても以下同様である。

ｍ／ｚ＝２１１８のシグナルをプリカーサーイオンとして用いたＭＳ^２分析を行った結果を図２に示した。Sia-[Gal-GlcNAc-Man-(GalNAc-GlcNAc-Man-)Man-GlcNAc]の存在を示す、ｍ／ｚ＝１７５１のフラグメント（イオンｂ_６）をはじめ、Sia-GalNAc-GlcNAc-Man構造である、ｍ／ｚ＝８５８のフラグメント（イオンｂ_４）などが検出され、さらにLacdiNAc構造を含むSia-GalNAc-GlcNAcであるｍ／ｚ＝６９６のフラグメント（イオンｂ_３）も確認された。その結果、プリカーサーイオンの構造が、Sia-[Gal-GlcNAc-Man-(GalNAc-GlcNAc-Man-)Man-GlcNAc-(Fuc-)GlcNAc]である事が確認された。

シグナルＰ１およびＰ２の強度Ｓ（Ｐ１）およびＳ（Ｐ２）を求め、その比Ｒ値＝［Ｓ（Ｐ２）／Ｓ（Ｐ１）］×１００を計算して、Ｒ値＝１２（％）という数値が得られた。

実施例２〜４
ＢＰＨと診断され、匿名化され識別コードを付した２名の被験者の血清（実施例１および２）、ならびに、生検によりＰＣと診断され、匿名化され識別コードを付した２名の被験者の血清（実施例３および４）を用いて、実施例１の手順を繰り返した。なお、手順の実施に際し医療機関の倫理審査の承認を受け、被験者にはインフォームドコンセントを行なった。

それぞれの被験者の血清中ＰＳＡ濃度およびLacdiNAc（−）（ｍ／ｚ＝２０７７）、LacdiNAc（＋）（ｍ／ｚ＝２１１８）のシグナル強度比百分率Ｒ値を、以下の第１表に示す。

ＰＣと診断された被験者の血清を用いた場合の代表例として、実施例４で得られたＭＳスペクトルを図３に示す。実施例１と同様の手順によるＭＳ^２分析によって、実施例４においては、（化１）Ａ、Ｂの他に、（化２）Ｃ、Ｄに示した構造を有する糖鎖の存在が確認された。式中の「Ｐｙｒｅｎｅ」は、ＰＤＡＭによるピレン標識（１−ピレニルメチル基）を示す。また、式中括弧は、２箇所のＮ−アセチルノイラミン酸のうちの何れかへの結合を示す。

（評価）
表１に示したように、ＰＣと診断された被験者の血清に由来する試料のLacdiNAc（＋）／LacdiNAc（−）のシグナル強度比百分率Ｒ値は３０％（Ｒ_(S)）以上を示し、GalNAc置換糖鎖を多く含有することを見出した。それに対して、ＢＰＨと診断された被験者の血清に由来する試料のシグナル強度比百分率Ｒ値は３０％（Ｒ_(S)）以下であった。すなわち、ＰＣと診断された被験者の血清ＰＳＡ糖鎖は、ＢＰＨと診断された被験者の血清ＰＳＡに比較して多くのLacdiNAc構造が存在することが初めて明らとなった。

さらに、ＰＣにおいて、LacdiNAc（＋）／LacdiNAc（−）のシグナル強度比Ｒ値は、血清ＰＳＡ濃度とは相関がないことが見いだされた。この結果は、本発明の方法が、ＰＳＡ濃度に依存することなしにＰＣとＢＰＨとを区別できる可能性を示している。したがって、本発明の方法は、広範囲の血清ＰＳＡ濃度の試料に適用できる。特に、本発明の方法は、グレーゾーンと呼ばれる血清中ＰＳＡ濃度の範囲（４〜１０ｎｇ／ｍＬ）において、高精度でのＰＣとＢＰＨとの区別に有効である可能性がある。

実施例５
本実施例は、前述の実施例における糖鎖に代えて糖ペプチドを用いることができることを示す例である。

実施例１の、工程（１）に記載のＰＳＡ単離、工程（２）に記載のＤＴＴによる還元およびヨードアセトアミドによるアルキル化を実施せずに、標準品ＰＳＡ−ＡＣＴ（ＣＯＲＴＥＸＢＩＯＣＨＥＭ）１００ｎｇに対して５０単位のサーモリシン(Calbio)の５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（ｐＨ８．０）を直接加え、１８時間にわたって５６℃で静置反応させた。反応混合物を遠心濃縮機によって乾固させた。得られた固形物を０．８％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、４０分間にわたって８０℃で静置し、脱シアル酸反応を行った。反応サンプルを遠心濃縮機で乾固させた。

続いて、カーボングラファイト充填カートリッジであるIntersep GC 50mg （GLサイエンス）を用いて、得られたサンプルから糖ペプチドの粗精製および脱塩を行った。最初に、カートリッジに対して、１ＭのＮａＯＨ水溶液、蒸留水、３０％酢酸水溶液、ならびに「５％アセトニトリルおよび１％トリフルオロ酢酸を含有する水溶液」を順次送液し、カーボングラファイトの洗浄、ならびに平衡化を行った。次に、乾固した糖ペプチドサンプルを、「５％アセトニトリルおよび１％トリフルオロ酢酸を含有する水溶液」に溶解し、カートリッジに送液した。カートリッジに吸着させた糖ペプチドに対して、蒸留水、「５％アセトニトリルおよび１％トリフルオロ酢酸を含有する水溶液」を順次送液し、洗浄を行った。その後、「８０％アセトニトリルおよび１％トリフルオロ酢酸を含有する水溶液」をカートリッジに送液して、吸着した糖ペプチドを溶出した。得られた糖ペプチド画分を回収し、遠心濃縮機を用いて乾固させた。

Sepharose CL4B（シグマアルドリッチ社）を用いて、糖ペプチドの精製を行った。使用前に、Sepharoseを５０％エタノール水溶液で５回洗浄し、次いで、「ブタノール：蒸留水：エタノール＝４：１：１」で５回洗浄した。乾固させた粗精製糖ペプチド画分を同混合溶液に溶解し、その溶液に対して洗浄済みのSepharoseを６μL加え、１時間にわたって室温にて振盪する事で糖ペプチドをSepharoseに吸着させた。次いで、前述の混合溶液を用いて９回にわたってSepharoseを洗浄した。糖ペプチドの吸着したSepharoseに対して５０％エタノール水溶液を加え、３０分間にわたって室温で振盪する事により糖ペプチドの溶離を行った。溶離した糖ペプチドを含む溶液を回収し、遠心濃縮機にて乾固させた。次いで、乾固させた糖ペプチドを５％アセトニトリル水溶液４μLに溶解した。

得られた糖ペプチド溶液に対して実施例１の工程（３）、および工程（４）を適用してＭＳ解析を行った。得られたＭＳスペクトルを図４に示した。ＰＳＡに由来するペプチド４３−４７に糖鎖が付加したスペクトルが得られ、GalNAc／Gal置換に対応する４１の質量差を有する２種類の糖ペプチド、Ｐ１およびＰ２が２対検出された。それぞれの構成を、（化３）のＥおよびＧ（Ｐ１）、ＦおよびＨ（Ｐ２）に示す。なお、式中の「Ｐｅｐｔｉｄｅ」はＰＳＡに由来するペプチド断片を示す。

精漿に由来する標準品ＰＳＡ−ＡＣＴのLacdiNAc（＋）／LacdiNAc（−）のシグナル強度比百分率Ｒ値の平均は２５％であった。

以上のように、標準品ＰＳＡのLacdiNAc（＋）／LacdiNAc（−）のシグナル強度比百分率Ｒ値は、ＢＰＨの被験者に対する糖鎖解析の結果に近く３０％以下であり、ＰＣの被験者に対する糖鎖解析Ｒ値とは異なっていた。また、糖ペプチドを用いる場合、糖鎖にペプチドが結合していることによって、ＰＳＡの同定および糖鎖付加位置の確認が可能となる。このことによって、他の糖タンパク質が混在する場合であっても、LacdiNAc（＋）／LacdiNAc（−）のシグナル強度比百分率Ｒ値を正確に求めることが可能となる。

実施例６
実施例４に示したＰＣ羅患の被験者（Ｎ−１８）の血清を対象に糖ペプチド解析を行った。該被験者の血清を用いて、実施例１の工程（１）および工程（２）に記載のＤＴＴによる還元、ヨードアセトアミドによるアルキル化、洗浄および乾燥の工程を実施し、乾燥ゲルを得た。

次に、乾燥ゲルに対して、１〜１００単位のサーモリシン（Calbio
Chem）の２５ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（ｐＨ８．０）を加えて、４５分間にわたって氷浴中で静置して、ゲルを膨潤させた。膨潤したゲルを１８時間にわたって５６℃で軽く攪拌した。ゲルに対して、抽出液「７０〜８０％アセトニトリルおよび０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水溶液」を加えて２０分間にわたって振盪し、溶液を回収した。

洗浄した２５ｍｇのZIC（登録商標）HILIC固相カラム充填剤（SeQuant）に対して、回収した溶液を加えた。続いて、「８０％アセトニトリルおよび０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水溶液」を加えて洗浄し、そして０．１％トリフルオロ酢酸の水溶液を用いて糖ペプチドを溶出させた。糖ペプチド溶出液を遠心濃縮機によって乾固させ、次いで、固形物を２μＬの純水に溶解させて糖ペプチド溶液を得た。

得られた糖ペプチド溶液に対して、実施例１の工程（３）と同様の手順を適用して、糖ペプチドの標識を行った。次いで、得られたターゲットプレートに対して実施例１の工程（４）の手順を適用して、ＭＳ分析を行った。

ＭＳ分析によって、ＰＳＡ由来のペプチド４３−４７に糖鎖が結合した糖ペプチドが検出された。得られたＭＳスペクトルを図５に示した。図５に示すように、GalNAc／Galの置換に対応する４１の質量差を有する、４つのLacdiNAc（−）糖ペプチド（Ｐ１）およびLacdiNAc（＋）糖ペプチド（Ｐ２）の対が見いだされた（化４）。

いずれの対においても、LacdiNAc（＋）／LacdiNAc（−）糖ペプチドのシグナル強度比百分率Ｒ値が３０％以上であった。また、本実施例で得られたＲ値と該血清サンプルに対して糖鎖解析を行った実施例４のＲ値は同様な数値であった。

以上のように、ＰＳＡ誘導体として糖ペプチドを用いた場合であっても、標識後のＭＳ分析において、GalNAc／Gal置換の有無に相当する質量差４１を有する糖ペプチドのシグナルの対を検出することができた。さらに、糖ペプチドのシグナル対の強度比百分率Ｒ値は１１４％±２％となり、糖鎖のシグナル対の強度比百分率Ｒ値である９５％±３％と同等の結果を示した。したがって、実施例１〜４に示したLacdiNAc（＋）／LacdiNAc（−）糖鎖のシグナル強度比Ｒ値と同様に、LacdiNAc（＋）／LacdiNAc（−）糖ペプチドのシグナル強度比百分率Ｒ値を求めることによって、ＰＣとＢＰＨとを高精度で判別することが可能であると考えられる。

実施例７
実施例７は、実施例１の工程（１）に記載のＰＳＡの単離、および工程（２）に記載のＤＴＴによる還元、ヨードアセトアミドによるアルキル化の工程を実施する事なしに患者血清の分析を行った例である。

最初にＰＣに羅患している患者（Ｎ−１２２、ＰＳＡ濃度１８６ｎｇ／ｍＬ）の血清から免疫グロブリンの除去を行った。３ｍＬのプロテインＡアガロース担体(PIERCE)を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて平衡化した。これをディスポーザブルプラスティックカラム(PIERCE)に充填し、該被験者の血清およびＰＢＳの混合物を添加し、４℃にて３０分間振盪した。この担体に結合しないＰＳＡを含む画分を回収し、さらに担体の３倍体積（３ＣＶ）のＰＢＳにてプロテインＡアガロース担体を洗浄した画分を回収後、両画分の混合溶液に最終濃度が１ＭになるようにＮａ_２ＳＯ_４を加えた。

次に、ＰＳＡ含有画分から血清中の主要タンパクであるアルブミンの除去を行った。２．５ｍＬのフラクトゲル（商標）ＥＭＤＴＡ（Ｓ）(Merck)を、ディスポーザブルプラスティックカラムに充填し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、Ｎａ_２ＳＯ_４（１Ｍ）含有）にて平衡化させた。フラクトゲル充填カラムに対して上記にて得られた画分を添加し、ポンプを用いて７ＣＶの同緩衝液を送液し、アルブミンの除去を行った。次いで、フラクトゲル（商標）に吸着したタンパク質を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、Ｎａ_２ＳＯ_４不含）にて溶出し、ＰＳＡを含む画分を得た。引き続き、この画分をＰＢＳにて平衡化させた２ｍＬのプロテインＡアガロース担体に添加し、４℃にて３０分間振盪することにより除去しきれなかった免疫グロブリンを除去した。プロテインＡアガロース担体に結合しないＰＳＡを含む画分および３ＣＶのＰＢＳにて洗浄した画分の混合溶液を次の免疫沈降に用いた。

引き続いて、免疫沈降に用いる抗ＰＳＡ抗体ビーズの作製をおこなった。NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow （ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を１ｍＭのＨＣｌで３回洗浄した。次に、洗浄したビーズに対して、市販の抗ヒトＰＳＡ・ウサギポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社）を添加し、室温にて３０分間にわたって振盪することで、抗体とビーズの架橋を行った。続いて、０．５ＭのＮａＣｌを含む０．５Ｍのモノエタノールアミン水溶液を加え、室温にて３０分間にわたって振盪することで、残余活性基の不活化を行った。得られた抗ＰＳＡ抗体ビーズを、０．５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）、および０．５ＭのＮａＣｌを含む１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９．０）で交互に３回洗浄した。次いで、抗ＰＳＡ抗体ビーズをＰＢＳで３回洗浄した。最後に、同ビーズを、０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳで洗浄し、使用時まで４℃にて保存した。

次いで、免疫沈降を行った。前述のＰＳＡを含む混合溶液画分に対して、０．１ｍＬの抗ＰＳＡ抗体ビーズを添加し、４℃にて１時間にわたり振盪した。続いて、抗ＰＳＡ抗体ビーズをＭｉｃｒｏＢｉｏ−Ｓｐｉｎクロマトグラフィーカラム（バイオ・ラッドラボラトリーズ社）に移した。抗ＰＳＡ抗体ビーズカラムを、ＰＢＳで４回、０．０２％のTween-20を含むＰＢＳで３回、および蒸留水で２回洗浄した。さらに、抗ＰＳＡ抗体ビーズカラムに１Ｍのプロピオン酸水溶液を加え、ビーズに吸着したタンパク質を溶出させて回収した。プロピオン酸水溶液による溶出は全１０回にわたって行い、その溶離液を混合して遠心濃縮機を用いて乾固させた。

得られたタンパク質画分の一部をウェスタンブロット法に供し、半定量的な解析を行ったところ、最初の血清に含まれていたＰＳＡの７０％以上を回収できる事が判明した。

続いて、実施例５に従い、サーモリシン消化、脱シアル酸反応、カーボングラファイト充填カートリッジによる粗精製、およびSepharose CL4Bを用いた精製を順次行い、糖ペプチド画分を得た。得られた糖ペプチド溶液に対して実施例１の工程（３）と同様の手順を適用して、糖ペプチドの標識を行った。次いで、得られたターゲットプレートに対して実施例１の工程（４）の手順を適用して、ＭＳ分析を行った。

ＭＳ分析によって、ＰＳＡ由来のペプチド４３−４７に糖鎖が結合した糖ペプチドが検出された。得られたＭＳスペクトルを図６に示した。ＭＳ分析により、LacdiNAc構造の有無に相当する４１の質量差を有する糖ペプチドのシグナル対、Ｐ１およびＰ２を検出することができた。

実施例８〜１２
生検によりＰＣと診断され、識別コードを付した５名の被験者の血清（実施例８〜１２）、を用いて、実施例７の手順を繰り返した。なお、手順の実施に際し医療機関の倫理審査の承認を受け、被験者にはインフォームドコンセントを行なった。

実施例５、６および実施例７を含むそれぞれの被験者の血清中ＰＳＡ濃度およびLacdiNAc（−）糖ペプチド（ｍ／ｚ＝２３８６）、LacdiNAc（＋）糖ペプチド（ｍ／ｚ＝２４２７）のシグナル強度比百分率Ｒ値を、以下の第２表に示す。

以上のように、３２ｎｇ／ｍＬの低いＰＳＡ濃度を有する前立腺癌患者の血清から糖ペプチドを精製し、ＭＳによって検出するに至った。また、低血清ＰＳＡ濃度である前立腺癌患者のＲ値も、ＰＳＡを多く有する前立腺癌患者血清のＲ値と同様に３０％を大きく上回る事が明らかとなった。

このように、実施例１に示す手法のようにＰＳＡ−ＡＣＴ複合体から遊離ＰＳＡを調製することなく、血清中の複合体および遊離ＰＳＡから糖ペプチドを直接的に調製して、ＰＳＡのLacdiNAc（＋）糖ペプチド、およびLacdiNAc（−）糖ペプチドを検出することができた。この方法は、工程が少なくなるので、簡便迅速となる上、糖ペプチドの回収率が向上する。したがって、この方法は臨床試料への適用に好ましい。

本願は、２００８年１２月３日に出願した日本の特許出願である特願２００８−３０９０１２に基づくものであり、その出願の全ての内容はここに引用し、本願発明の明細書の開示として取り込まれるものである。

Claims

被験者由来の試料中のＰＳＡの糖鎖構造を分析する工程を含み、LacdiNAc（Ｎ−アセチルガラクトサミン−Ｎ−アセチルグルコサミン）を有する糖鎖（LacdiNAc（＋））の量が、LacdiNAcを持たないがLacNAc（ガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン）を有する糖鎖（LacdiNAc（−））の量の３０％を超える際に前立腺癌であると判定することを特徴とする前立腺癌を判定するためのデータを提供する方法。
被験者由来の試料中のＰＳＡの糖鎖構造を分析する工程を含み、LacdiNAc（Ｎ−アセチルガラクトサミン−Ｎ−アセチルグルコサミン）を有する糖鎖（LacdiNAc（＋））の量が、LacdiNAcを持たないがLacNAc（ガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン）を有する糖鎖（LacdiNAc（−））の量の３０％を超える際に前立腺癌であると判定し、３０％以下である際に良性前立腺肥大症であると判定することを特徴とする請求項１に記載の前立腺癌を判定するためのデータを提供する方法。
上記ＰＳＡの糖鎖構造の分析を、上記ＰＳＡに対してレクチンを作用させる方法、上記ＰＳＡに対して抗体を作用させる方法、高速液体クロマトグラフィー法もしくは質量分析法、またはこれらを組み合わせた分析手段により行うことを特徴とする請求項１に記載の前立腺癌を判定するためのデータを提供する方法。
上記ＰＳＡの糖鎖構造の分析を、上記ＰＳＡに対してレクチンを作用させる方法、上記ＰＳＡに対して抗体を作用させる方法、高速液体クロマトグラフィー法もしくは質量分析法、またはこれらを組み合わせた分析手段により行うことを特徴とする請求項２に記載の前立腺癌を判定するためのデータを提供する方法。
（１）被験者由来の試料からＰＳＡを精製する工程と、
（２）工程（１）で精製したＰＳＡからＰＳＡ誘導体を調製する工程と、
（３）工程（２）で得られたＰＳＡ誘導体を標識する工程と、
（４）工程（３）で得られた標識化ＰＳＡ誘導体を質量分析法により分析する工程を含み、LacdiNAcの構造の有無に起因する質量差４１で示される一対のシグナルを選定し、LacdiNAcを有する糖鎖（LacdiNAc（＋））に由来するシグナルの強度が、LacdiNAcを持たないがLacNAcを有する糖鎖（LacdiNAc（−））に由来するシグナルの強度の３０％を超える際に前立腺癌であると判定することを特徴とする請求項３に記載の前立腺癌を判定するためのデータを提供する方法。
（１）被験者由来の試料からＰＳＡを精製する工程と、
（２）工程（１）で精製したＰＳＡからＰＳＡ誘導体を調製する工程と、
（３）工程（２）で得られたＰＳＡ誘導体を標識する工程と、
（４）工程（３）で得られた標識化ＰＳＡ誘導体を質量分析法により分析する工程を含み、LacdiNAcの構造の有無に起因する質量差４１で示される一対のシグナルを選定し、LacdiNAcを有する糖鎖（LacdiNAc（＋））に由来するシグナルの強度がLacdiNAcを持たないがLacNAcを有する糖鎖（LacdiNAc（−））に由来するシグナルの強度の３０％を超える際に前立腺癌であると判定し、３０％以下である際に良性前立腺肥大症であると判定することを特徴とする請求項４に記載の前立腺癌を判定するためのデータを提供する方法。
上記工程（２）において調製されるＰＳＡ誘導体が、ＰＳＡ由来の糖鎖またはＰＳＡ由来の糖ペプチドであることを特徴とする請求項５に記載の前立腺癌を判定するためのデータを提供する方法。
上記工程（２）において調製されるＰＳＡ誘導体が、ＰＳＡ由来の糖鎖またはＰＳＡ由来の糖ペプチドであることを特徴とする請求項６に記載の前立腺癌を判定するためのデータを提供する方法。